Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Oi, meu nome é Gurpreet. Nosso laboratório investiga mecanismos de inflamação pulmonar e reparação. Oi, meu nome é Jessica e investigo alvéolos de ratos de laboratório induzidos por ozônio usando métodos microscópicos fluorescentes.

Olá a todos, meu nome é Manpreet. E estudo inflamação pulmonar com métodos de imagem animal. Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos, decorrentes de estéreis, como o ozônio, e componentes microbianos, como o lipopólise bacteriano ou LPS.

Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares, devido à remodelação imunológica, coagulativa e de tecido não regulamentada. Descrevemos uma análise abrangente de vários compartimentos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, que é BAL, o perfusato vascular pulmonar, que é LVP, seções de crio pulmonar esquerdo, sangue periférico e a medula óssea sternal e fêmur. Para exposições de ozônio, coloque suavemente ratos na caixa de indução personalizada e exponha continuamente os ratos a 0,05 PPM de ozônio por duas horas.

Para exposições de LPS, anestesiar os camundongos sob leve cetamina intraperitoneal e mistura de xilazina. Agora instile 50 microliters fora da solução LPS para os ratos de nares externos. Incutir camundongos de controle com 50 microliters de soro fisiológico estéril.

Em pontos de tempo especificados, anestesiar os camundongos com a dose completa de cetamina e mistura de xilazina. Em seguida, higienize os ratos e verifique os reflexos do pedal, ou seja, belisque qualquer um dos dígitos do membro traseiro, e observe para retração do membro. Nenhum reflexo significa anestesia profunda.

Agora faça um corte abaixo do esterno e exponha o coração. Coloque uma agulha de calibre 25 presa à seringa heparinizada no ventrículo direito e tire sangue por punção cardíaca. Recolher o sangue em seringas heparinizadas e drenar em tubos de microfuge para posterior processamento.

Use cuidadosamente pinças ou fórceps contundentes para limpar a região traqueal do tecido sobrelado. Agora corte a caixa torácica para expor os pulmões. Passe uma ligadura de algodão abaixo da traqueia, e deixe assim por enquanto.

Corte a traqueia, espaçada em cerca de um terço de seu comprimento dos pulmões para traqueostomia. Insira uma cânula de polietileno de 28 bitola na traqueia. Amarre firmemente a ligadura de algodão para manter a cânula no lugar.

Certifique-se de não destruir a cânula. Agora, injete gradualmente 0,5 ml de PBS na cânula com a ajuda de uma seringa de um mL. Depois de injetar PBS aspirar a seringa desde que não resista à sucção.

Colete o fluido aspirado em um tubo de microfago rotulado e repita este procedimento mais duas vezes. Corte a aorta torácica descendente no local entre as metades torácica e abdominal para evitar qualquer backup durante a perfusão pulmonar. Borrida a cavidade perto da extremidade da aorta cortada livre de sangue.

Em seguida, perprendo os pulmões com 0,5 ML de soro fisiológico heparinizado de temperatura ambiente, injete-o através do ventrículo direito. Recolher o perfusato vascular da cavidade na extremidade cortada da aorta torácica descendente. Depois de ligar o brônquio direito, deixe o pulmão esquerdo inflar com 0,5 ML de paraformaldeído por cinco minutos.

Agora higienize a porção abdominal. Corte a parte abdominal e deskin-lo do osso pélvico. Recolhe o osso pélvico e isole os ossos do fêmur esquerdo e direito em uma placa de petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.

Colete a caixa torácica ventral e o esterno em uma placa de Petri cheia de soro fisiológico, que também é mantida no gelo. Perfunda as extremidades cortadas dos ossos com quatro vezes com 0,5 ML de soro fisiológico usando agulhas bem encaixadas em seringas de 1 ML. Colete as frações de cada osso em tubos Falcon rotulados, equipados com filtros e colocados no gelo.

Centrifugar todas as amostras por 10 minutos a 3000 RPM. Pegue os supernacantes e congele-os. Reconstituir as células em um mínimo de 200 microliters de PBS.

Realizar contagens totais de leucócitos. Manche outro líquido de BAL com uma mistura de verde calcein e o homodimer de ethidium vermelho uma mancha. Analise o supernatante para quimioterapia e concentração total de proteínas.

Centrifugar as células para preparar dois citospins em cada lâmina e mancha para proteínas bioquímicas e imunológicas. Realize a coloração modificada de H e E nas crioseções pulmonares para todos os grupos. Delineie manualmente de 150 a 200 células no painel de imagens mesclado.

Copie as regiões de interesse delineadas para todos os canais. Meça os parâmetros predefinidos para todos os canais. Divida a intensidade fluorescente da molécula manchada pela de DAPI ou CD61.

Estes são denominados como razões de intensidade fluorescente normalizadas DAPI ou CD 61. Em seguida, plote os parâmetros para avaliar quaisquer alterações após a exposição. Embora, as exposições combinadas não tenham induzido nenhuma alteração na contagem total de células de medula óssea, os camundongos apresentaram leucocitose sistêmica às 24 horas, que foi seguida por leucopenia às 72 horas após a exposição.

Estes são exibidos na contagem de células sanguíneas periféricas. A contagem de células de medula óssea do fêmur mostra o pico tardio em 72 horas quando comparado com todos os pontos de tempo. Observe a ausência de manchas de Siglec-F e CX3CRI em células polimorfóriares às 24 horas na imagem do citospin BAL.

Os citospins BAL e LVP mostraram presença de grandes células mononucleares CD11b e GR1 positivas a zero hora. As células polimorfonucleares apresentaram-se como um tipo de célula predominante em todos os compartimentos após a exposição. O teor total de proteínas bal foi maior em 36 horas após a exposição combinada.

No entanto, a proteína LVP não foi alterada após a exposição. Os níveis de eotaxina-2 e interleucina-2 foram mais elevados nas quatro horas em LVP. Estas quimiocinas foram reduzidas na fração BAL.

Curiosamente, o neutrófilo alarmante IL-16 e muitas quimiocinas inatas foram alteradas no LVP, mas não na fração BAL. Na linha de base, mais de 95% das células BAL eram mono nucleares mostrando actina cortical, lamellipodia, estresse e fibras de tubulina, e foram fortemente positivas para a redução da coloração mitotracker. Em quatro horas, observamos células bal circulares, que haviam perdido actina, mas mostravam uma rede de microtúbulos espalhada, como mostrado em manchas de mitotracker vermelhas e mais baixas.

Logo após a exposição combinada, as células BAL apareceram duplamente positivas para calceína e homodimer-1 de ethidium, o que indica células parcialmente comprometidas. Às 36 horas, as células BAL eram em grande parte viáveis, que é verde. Observamos manchas discretas atp alfa e Ly6G em macrófagos alveolares bal e neutrófilos.

Observamos uma redução no ATP alfa normalizado do DAPI e um aumento no teor de proteína Ly6G intracelular. As exposições combinadas induziram expressões transitórias de Bal, célula assassina natural e K1.1, ATP neutrófilo, peta sub unit, fator de proliferação, Ki-67 e expressões sustentadas de neutrófilo GR1, plaqueta CX3CRI e a proteína angiogênica angiogênica em células BAL após exposição. Embora os danos septos bronquiolares e alveolares eram esperados, foi surpreendente observar agregados celulares em vasos maiores às 36 horas após a exposição.

Finalmente, temos resultados resumindo nesta tabela. Esperamos que nosso modelo murino sirva como um protótipo facilmente acessível que pode ser reproduzido em laboratórios de contenção nível dois para estudar os mecanismos de morte celular invasiva e infecções. Obrigado.