Name: Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprenda a visualizar adaptações celulares pulmonares durante lesão aguda induzida por ozônio e LPS em camundongos. Este método ajuda pesquisadores a estudar inflamação e reparo tecidual.

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A pesquisa realizada é financiada pela subvenção do Presidente NSERC, bem como fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk. O Centro Canadense de Inovação Nuclear De Sylvia Fedoruk é financiado pela Innovation Saskatchewan. A imagem de fluorescência foi realizada no Centro de Imagem WCVM, que é financiado pela NSERC. Jessica Brocos (Estudante de MSc) e Manpreet Kaur (Estudante de MSc) foram financiadas pelos fundos de start-up do Centro Canadense de Inovação Nuclear Sylvia Fedoruk.

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse ou divulgações para fazer.

Os métodos apresentados no presente estudo destacam a utilidade da análise de múltiplos compartimentos para estudar múltiplos eventos celulares durante a inflamação pulmonar. Resumimos os resultados na Tabela 2. Nós e muitos laboratórios estudamos extensivamente a resposta murina à instilação intranasal do LPS, que é marcada pelo rápido recrutamento de neutrófilos pulmonares, que atinge o pico entre 6-24 h após o qual, a resolução começa. E recentemente, temos demonstrado que a sub-clínica O3 ...

A lesão pulmonar aguda (ALI) é uma resposta patológica crucial dos pulmões a estímulos infecciosos ou outros prejudiciais que é marcada pela ativação simultânea dos sistemas imunológicos coagulativos, fibrinolíticos e inatos1. Os neutrófilos detectam prontamente padrões microbianos, bem como padrões de danos intracelulares através da família receptor toll-like (TLR)2,3,4. Os neutrófilos liberam citocinas pré-formadas e o conteúdo do grânulo citotóxico, que pode causar danos colaterais ao tecido. O dano alveolar resultante é marcado com a morte celular secundária levando à liberação de moléculas como o triptosfato de adenosina (ATP)5, estabelecendo-se assim em um ciclo vicioso de desregulação imunológica.
Um problema não resolvido na compreensão da ALI diz respeito à questão de como a lesão é iniciada dentro da membrana alveolar. O complexo de transporte de elétrons V, g1F0 ATP synthase, é uma proteína mitocondrial conhecida por ser expressa onipresentemente, na célula (incluindo membrana plasmática endotelial, leucócito, epitelial) durante a inflamação. O citoesqueleto celular, composto por actina e tubulina, abriga muitas formas e funções de células modulando, bem como proteínas mitocondriais, respectivamente. Recentemente mostramos que o bloqueio da synthase ATP por uma molécula endógena, angiostatina, silencia o recrutamento de neutrófilos, ativação e lipopólise (LPS) induzida inflamação pulmonar6. Assim, tanto os mecanismos bioquímicos (ATP synthase) quanto os imunológicos (TLR4) podem regular a barreira alveolar durante a inflamação pulmonar.
A exposição ao ozônio (O3),poluente ambiental, prejudica a função pulmonar, aumenta a suscetibilidade a infecções pulmonares, e os baixosníveis curtos de exposições de O 3 aumentam o risco de mortalidade naqueles com condições cardiorrespiratórias subjacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Assim, a exposição a concentrações fisiologicamente relevantes de O3 fornece um modelo significativo de ALI para estudar mecanismos fundamentais de inflamação7,8. Nosso laboratório estabeleceu recentemente um modelo murino de baixa dose O3 induzido ALI15. Após a realização de uma dose e uma resposta ao tempo-resposta às baixas concentrações de O3, observamos que a exposição a 0,05 ppm O3 por 2 h, induz lesão pulmonar aguda que é marcada pela subunidade V do complexo de synthase do pulmão Β (ATPβ) e expressão de angiostatina, semelhante ao modelo LPS. Imagens pulmonares intravitais revelaram a desorganização de microfilamentos de actina alveolar indicando danos pulmonares, e ablação dos níveis de oxigênio reativo septal alveolar (ROS) (indicando revogação da sinalização celular de base) e potencial de membrana mitocondrial (indicando morte celular aguda) após 2 h de exposição a 0,05 ppm O315 que se correlacionava com um pulmão heterogêneo 18retenção FDG16,recrutamento de neutrófilos e liberação de citocinas, liberação, mais notavelmente IL-16 e SDF-1α. A mensagem de nossa última opinião é que O3 produz toxicidade exponencialmente alta quando exposto em concentrações abaixo dos limites permitidos de 0,063 ppm acima de 8h (por dia) para exposição humana. É importante ressaltar que não existe uma compreensão clara sobre se essas exposições sub-clínicas O3 podem modular mecanismos mediados pelo TLR4, como pela endotoxina bacteriana17. Assim, estudamos um modelo de exposição de O3 e LPS de duplo sucesso e observamos as adaptações celulares imunes e não imunes.
Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar (ou seja, BAL) que amostra os espaços alveolares, o perfusato vascular pulmonar (i.e., LVP) que amostra a vasculatura pulmonar e o interstício septal alveolar no caso de uma barreira endotelial comprometida, crioseções pulmonares esquerdas, para olhar para leucócitos parnchímicos e aderentes deixados no tecido pulmonar lavado , sangue periférico que representa os leucócitos circulantes e os perfusados da medula óssea sternal e do fêmur que amostram os locais proximais e distais da mobilização de células hematopoiéticas durante a inflamação, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Painel de quimiocinas Bioplex 33-plex</td><td>Biorad</td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>óleo 63X (NA 1.4-0.6) Objetivas de microscópio</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350 conjugado cabra anti-rato IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 cabra conjugada anti-rato IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 faloidina conjugada</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 camundongo conjugado anti-&alfa; clone de tubulina DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra conjugada anti-hamster IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra conjugada anti-rato IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633 cabra conjugada anti-coelho IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>hamster armênio anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>alíquota em 2 &micro; l estoques e loja em -20&deg; C</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente invertido de campo amplo</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina (Narketan)</td><td>Vetoquinol</td><td>100 mg/ml</td><td>Diluir 10 vezes para fazer um estoque de 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Kit de citotoxicidade viva (calceína)/morta (Ethidium homodimer-1)</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)</td><td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-ATP5&beta; IgG2b (clone 3D5AB1)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína Pierce 660 nm</td><td>Termocientífico</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>Coelho antiangiostatina (camundongo aa 98-116) IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker reduzido laranja</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>20 mg/ml</td><td>Diluir 2 vezes para fazer um estoque de 10 mg/ml</td></tr></tbody></table>

visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e lps induzidas por lps

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos na forma de condições inflamatórias estéreis (partículas ou reativas) e infecciosas (bacterianas, virais ou fúngicas). Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda, que é caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares como resultado da resposta imunológica, coagulativa e remodelagem de tecidos. Métodos microscópicos sensíveis para visualizar e quantificar adaptações celulares pulmonares murinas, em resposta ao ozônio de baixa dose (0,05 ppm), um potente poluente ambiental em combinação com lipopólise bacteriana, um agonista TLR4, são cruciais para entender os mecanismos inflamatórios e de reparo. Descrevemos uma análise microscópica fluorescente abrangente de vários compartimentos corporais pulmonares e sistêmicos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, perfusato vascular pulmonar, crioseções pulmonares esquerdas e perfusato de medula óssea severa. Mostramos danos de macrófagos alveolares, neutrófilos, tecido parenchímal pulmonar, bem como células de medula óssea em correlação com uma resposta imune retardada (até 36-72 h) que é marcada por gradientes de quimioterapia discretos nos compartimentos analisados. Além disso, apresentamos a matriz extracelular pulmonar e interações citosqueléticas celulares (actina, tubulina), espécies de oxigênio mitocondrial e reativa, plasminogen anticoagulativo, seu fragmento de peptídeo anti-angiogênico angiogenic, as subunidades do complexo de sintetizador ATP mitocondrial V, α e β. Esses marcadores substitutos, quando complementados com ensaios adequados em células in vitro e técnicas de imagem animal in vivo, como microscopia intravital, podem fornecer informações vitais para entender a resposta pulmonar a novos agentes imunomodulatórios.

A exposição combinada o3 e LPS leva à inflamação sistêmica e à mobilização da medula óssea em 72 h: A contagem de células em diferentes compartimentos revelou alterações significativas no sangue periférico e a célula total da medula óssea do fêmur conta com exposições combinadas de O3 e LPS. Embora as exposições combinadas de O3 e LPS não tenham induzido alterações nas contagens totais de células BAL (Figur...

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Oi, meu nome é Gurpreet. Nosso laboratório investiga mecanismos de inflamação pulmonar e reparação. Oi, meu nome é Jessica e investigo alvéolos de ratos de laboratório induzidos por ozônio usando métodos microscópicos fluorescentes.Olá a todos, meu nome é Manpreet. E estudo inflamação pulmonar com métodos de imagem animal. Os pulmões são continuamente confrontados com insultos diretos e indiretos, decorrentes de estéreis, como o ozônio, e componentes microbianos, como o lipopólise bacteriano ou LPS.Uma resposta esmagadora do hospedeiro pode resultar em respiração comprometida e lesão pulmonar aguda caracterizada pelo recrutamento de neutrófilos pulmonares, devido à remodelação imunológica, coagulativa e de tecido não regulamentada. Descrevemos uma análise abrangente de vários compartimentos, ou seja, o fluido de lavage bronco-alveolar, que é BAL, o perfusato vascular pulmonar, que é LVP, seções de crio pulmonar esquerdo, sangue periférico e a medula óssea sternal e fêmur. Para exposições de ozônio, coloque suavemente ratos na caixa de indução personalizada e exponha continuamente os ratos a 0,05 PPM de ozônio por duas horas.Para exposições de LPS, anestesiar os camundongos sob leve cetamina intraperitoneal e mistura de xilazina. Agora instile 50 microliters fora da solução LPS para os ratos de nares externos. Incutir camundongos de controle com 50 microliters de soro fisiológico estéril.Em pontos de tempo especificados, anestesiar os camundongos com a dose completa de cetamina e mistura de xilazina. Em seguida, higienize os ratos e verifique os reflexos do pedal, ou seja, belisque qualquer um dos dígitos do membro traseiro, e observe para retração do membro. Nenhum reflexo significa anestesia profunda.Agora faça um corte abaixo do esterno e exponha o coração. Coloque uma agulha de calibre 25 presa à seringa heparinizada no ventrículo direito e tire sangue por punção cardíaca. Recolher o sangue em seringas heparinizadas e drenar em tubos de microfuge para posterior processamento.Use cuidadosamente pinças ou fórceps contundentes para limpar a região traqueal do tecido sobrelado. Agora corte a caixa torácica para expor os pulmões. Passe uma ligadura de algodão abaixo da traqueia, e deixe assim por enquanto.Corte a traqueia, espaçada em cerca de um terço de seu comprimento dos pulmões para traqueostomia. Insira uma cânula de polietileno de 28 bitola na traqueia. Amarre firmemente a ligadura de algodão para manter a cânula no lugar.Certifique-se de não destruir a cânula. Agora, injete gradualmente 0,5 ml de PBS na cânula com a ajuda de uma seringa de um mL. Depois de injetar PBS aspirar a seringa desde que não resista à sucção.Colete o fluido aspirado em um tubo de microfago rotulado e repita este procedimento mais duas vezes. Corte a aorta torácica descendente no local entre as metades torácica e abdominal para evitar qualquer backup durante a perfusão pulmonar. Borrida a cavidade perto da extremidade da aorta cortada livre de sangue.Em seguida, perprendo os pulmões com 0,5 ML de soro fisiológico heparinizado de temperatura ambiente, injete-o através do ventrículo direito. Recolher o perfusato vascular da cavidade na extremidade cortada da aorta torácica descendente. Depois de ligar o brônquio direito, deixe o pulmão esquerdo inflar com 0,5 ML de paraformaldeído por cinco minutos.Agora higienize a porção abdominal. Corte a parte abdominal e deskin-lo do osso pélvico. Recolhe o osso pélvico e isole os ossos do fêmur esquerdo e direito em uma placa de petri cheia de soro fisiológico mantida no gelo.Colete a caixa torácica ventral e o esterno em uma placa de Petri cheia de soro fisiológico, que também é mantida no gelo. Perfunda as extremidades cortadas dos ossos com quatro vezes com 0,5 ML de soro fisiológico usando agulhas bem encaixadas em seringas de 1 ML. Colete as frações de cada osso em tubos Falcon rotulados, equipados com filtros e colocados no gelo.Centrifugar todas as amostras por 10 minutos a 3000 RPM. Pegue os supernacantes e congele-os. Reconstituir as células em um mínimo de 200 microliters de PBS.Realizar contagens totais de leucócitos. Manche outro líquido de BAL com uma mistura de verde calcein e o homodimer de ethidium vermelho uma mancha. Analise o supernatante para quimioterapia e concentração total de proteínas.Centrifugar as células para preparar dois citospins em cada lâmina e mancha para proteínas bioquímicas e imunológicas. Realize a coloração modificada de H e E nas crioseções pulmonares para todos os grupos. Delineie manualmente de 150 a 200 células no painel de imagens mesclado.Copie as regiões de interesse delineadas para todos os canais. Meça os parâmetros predefinidos para todos os canais. Divida a intensidade fluorescente da molécula manchada pela de DAPI ou CD61.Estes são denominados como razões de intensidade fluorescente normalizadas DAPI ou CD 61. Em seguida, plote os parâmetros para avaliar quaisquer alterações após a exposição. Embora, as exposições combinadas não tenham induzido nenhuma alteração na contagem total de células de medula óssea, os camundongos apresentaram leucocitose sistêmica às 24 horas, que foi seguida por leucopenia às 72 horas após a exposição.Estes são exibidos na contagem de células sanguíneas periféricas. A contagem de células de medula óssea do fêmur mostra o pico tardio em 72 horas quando comparado com todos os pontos de tempo. Observe a ausência de manchas de Siglec-F e CX3CRI em células polimorfóriares às 24 horas na imagem do citospin BAL.Os citospins BAL e LVP mostraram presença de grandes células mononucleares CD11b e GR1 positivas a zero hora. As células polimorfonucleares apresentaram-se como um tipo de célula predominante em todos os compartimentos após a exposição. O teor total de proteínas bal foi maior em 36 horas após a exposição combinada.No entanto, a proteína LVP não foi alterada após a exposição. Os níveis de eotaxina-2 e interleucina-2 foram mais elevados nas quatro horas em LVP. Estas quimiocinas foram reduzidas na fração BAL.Curiosamente, o neutrófilo alarmante IL-16 e muitas quimiocinas inatas foram alteradas no LVP, mas não na fração BAL. Na linha de base, mais de 95% das células BAL eram mono nucleares mostrando actina cortical, lamellipodia, estresse e fibras de tubulina, e foram fortemente positivas para a redução da coloração mitotracker. Em quatro horas, observamos células bal circulares, que haviam perdido actina, mas mostravam uma rede de microtúbulos espalhada, como mostrado em manchas de mitotracker vermelhas e mais baixas.Logo após a exposição combinada, as células BAL apareceram duplamente positivas para calceína e homodimer-1 de ethidium, o que indica células parcialmente comprometidas. Às 36 horas, as células BAL eram em grande parte viáveis, que é verde. Observamos manchas discretas atp alfa e Ly6G em macrófagos alveolares bal e neutrófilos.Observamos uma redução no ATP alfa normalizado do DAPI e um aumento no teor de proteína Ly6G intracelular. As exposições combinadas induziram expressões transitórias de Bal, célula assassina natural e K1.1, ATP neutrófilo, peta sub unit, fator de proliferação, Ki-67 e expressões sustentadas de neutrófilo GR1, plaqueta CX3CRI e a proteína angiogênica angiogênica em células BAL após exposição. Embora os danos septos bronquiolares e alveolares eram esperados, foi surpreendente observar agregados celulares em vasos maiores às 36 horas após a exposição.Finalmente, temos resultados resumindo nesta tabela. Esperamos que nosso modelo murino sirva como um protótipo facilmente acessível que pode ser reproduzido em laboratórios de contenção nível dois para estudar os mecanismos de morte celular invasiva e infecções. Obrigado.

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Research

JoVE Journal

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Aprenda a visualizar adaptações celulares pulmonares durante lesão aguda induzida por ozônio e LPS em camundongos. Este método ajuda pesquisadores a estudar inflamação e reparo tecidual.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

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