Name: Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de microscopia de condutância iônica por sonda saltitante para imagem de esterecílias em células ciliadas auditivas de roedores vivos com resolução nanométrica.

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Agradecemos ao Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Reino Unido) pelo apoio e aconselhamento a longo prazo em todas as etapas do projeto. Agradecemos também aos Drs. Pavel Novak e Andrew Shevchuk (Imperial College, Reino Unido), bem como ao Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rússia) por sua ajuda no desenvolvimento de software. O estudo foi apoiado pelo NIDCD/NIH (R01 DC008861 e R01 DC014658 a G.I.F.).

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</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes.

Para obter imagens HPICM bem-sucedidas, os usuários precisam estabelecer um sistema de baixa ruído e baixa vibração e fabricar pipetas apropriadas. Recomendamos fortemente o uso de padrões de calibração AFM para testar a estabilidade do sistema antes de tentar realizar qualquer imagem de célula viva. Uma vez que a resolução do sistema é testada, os usuários podem considerar o órgão fixo de imagem das amostras de Corti para se familiarizar com as configurações de imagem antes de tentar qualquer imagem de célula viva.
...

Apesar do fato de que os feixes de estereocilia nas células ciliadas auditivas são grandes o suficiente para serem visualizados por microscopia óptica e desviados em células vivas em um experimento de grampo de remendo, os componentes estruturais essenciais da máquina de transdução, como as ligações de ponta, poderiam ser visualizados apenas com a microscopia eletrônica em células mortas. Nas células ciliadas auditivas dos mamíferos, o maquinário de transdução está localizado nas extremidades inferiores das pontas, ou seja, nas pontas da linha mais curta esterecilia1 e regulado localmente através da sinalização nas pontas da estereócilia2,3. No entanto, imagens livres de rótulos das estruturas superficiais neste local em células ciliadas vivas não são possíveis devido aos pequenos tamanhos de estereócilia.
A cóclea dos mamíferos tem dois tipos de células sensoriais auditivas: células ciliares internas e externas. Nas células ciliadas internas, estereócilias são mais longas e grossas em comparação com as das células ciliadas externas4. A primeira e segunda fileira de estereócilia têm um diâmetro de 300-500 nm em células ciliadas internas de rato ou rato. Devido à difração da luz, a resolução máxima alcançável com uma microscopia óptica sem rótulos é de aproximadamente 200 nm. Assim, a visualização de estereócilias individuais dentro da primeira e segunda fileiras do feixe de células ciliadas internas é relativamente fácil com microscopia óptica. Em contraste, estereócilias de linha mais curtas nas células ciliadas internas e todos os estereocilias das células ciliadas externas têm diâmetros em torno de 100-200 nm e não podem ser visualizados com microscopia óptica5. Apesar dos recentes progressos em imagens de super resolução, essa limitação fundamental persiste em qualquer imagem óptica livre de rótulos. Todas as técnicas de super-resolução disponíveis comercialmente atuais requerem algum tipo de moléculas fluorescentes6,o que limita suas aplicações. Além das limitações devido à necessidade de moléculas marcadas fluorescentes específicas, a exposição à intensa irradiação de luz tem sido demonstrada para induzir danos celulares e pode influenciar os processos celulares, o que é uma grande desvantagem ao estudar células vivas7.
Nosso conhecimento atual dos detalhes ultraestruturais dos feixes de esterecicia de células ciliares tem sido obtido principalmente com várias técnicas de microscopia eletrônica (EM), como microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), em11 , fratura congelante, e recentemente com técnicas 3D como seção serial com feixe de íons focado ou tomografia crio-EM8,9,10, 11,12, 13,13 ,13, 14,15,16. Infelizmente, todas essas técnicas EM requerem química ou criofixação da amostra. Dependendo da escala de tempo dos fenômenos, essa exigência torna impossível ou muito trabalhoso um estudo dos processos dinâmicos nas pontas da estereócilia, seja impossível ou muito trabalhoso.
Esforços limitados foram feitos para a imagem de feixes de cabelo de células ciliar vivas com microscopia de força atômica (AFM)17,18. Uma vez que a AFM opera em soluções fisiológicas, poderia, em teoria, visualizar mudanças dinâmicas nos feixes de estereócilia de células ciliadas vivas ao longo do tempo. O problema está nos princípios da AFM de alta resolução, o que implica certo contato físico entre a sonda AFM e a amostra, mesmo no modo menos prejudicial de "tocar"19. Quando a sonda AFM encontra um estereócil, geralmente se depara com ele, danificando a estrutura do feixe de cabelo. Como resultado, essa técnica não é adequada para visualizar células ciliar vivas, ou mesmo fixas, feixes de célulasciliares 17,18. O problema pode ser parcialmente aliviado usando uma grande sonda AFM em forma de bola que impõe apenas forças hidrodinâmicas à superfície da amostra20. No entanto, embora tal sonda seja idealmente adequada para testar propriedades mecânicas da amostra21,ela fornece apenas uma resolução de sub micrômetro ao fotografar o órgão de Corti22 e ainda se aplica à amostra uma força que pode ser substancial para os feixes de estereócilia altamente sensíveis.
A microscopia de condução de íons de varredura (SICM) é uma versão da microscopia da sonda de varredura que usa uma sonda pipeta de vidro preenchida com uma solução condutora23. O SICM detecta a superfície quando a pipeta se aproxima da célula e a corrente elétrica através da pipeta diminui. Uma vez que isso está acontecendo bem antes de tocar a célula, o SICM é ideal para imagens não contato de células vivas na solução fisiológica24. A melhor resolução do SICM está na ordem dos nanômetros únicos, o que permite resolver complexos proteicos individuais na membrana plasmática de uma célula viva25. No entanto, semelhante a outras técnicas de sonda de digitalização, o SICM é capaz de imagem apenas superfícies relativamente planas. Superamos essa limitação inventando microscópio de condução de íons de ânhão de ânion de guinada (HPICM)26, no qual a nanopipette se aproxima da amostra em cada ponto de imagem(Figura 1A). Usando hpicm, conseguimos imaginar feixes de estereocilia em células ciliadas auditivas vivas com resolução nanoescala27.
Outra vantagem fundamental dessa técnica é que o HPICM não é apenas uma ferramenta de imagem. Em contraste com outras técnicas de sonda de varredura, a sonda HPICM/SICM é um eletrodo amplamente utilizado na fisiologia celular para gravações elétricas e entrega local de vários estímulos. A atividade do canal de íons geralmente não interfere com a imagem HPICM, porque a corrente total através da sonda HPICM é várias ordens de magnitude maior do que a corrente extracelular gerada pelos maiores canais deíons 25. No entanto, o HPICM permite um posicionamento preciso da nanopipette sobre uma estrutura de interesse e posterior gravação de grampo de remendo de um canal único a partir desta estrutura28. Foi assim que obtivemos as primeiras gravações preliminares de atividade de canal único nas pontas da estereócilia da célula ciliada29. Vale ressaltar que mesmo uma grande corrente através da nanopipette não pode produzir mudanças significativas do potencial através da membrana plasmática devido ao enorme desvio elétrico do meio extracelular. No entanto, canais de íons individuais podem ser ativados mecanicamente pelo fluxo de líquido através da nanopipette30 ou quimicamente por aplicação local de um agonista31.
No HPICM, a imagem é gerada quando uma nanopipette sequencialmente se aproxima da amostra em um ponto, se retrai e, em seguida, se move na direção lateral para repetir a abordagem(Figura 1A). Um amplificador de remendo aplica constantemente tensão a um fio AgCl na pipeta (Figura 1B) para gerar uma corrente de ~1 nA na solução de banho. O valor dessa corrente quando a pipeta está longe da superfície da célula é determinado como uma corrente de referência (Iref, Figura 1C). Em seguida, a pipeta se move no eixo Z para se aproximar da amostra até que a corrente seja reduzida por uma quantidade predefinida pelo usuário (setpoint), geralmente 0,2%-1% do Iref (Figura 1C, traço superior). O sistema então economiza valor Z neste momento como a altura da amostra, juntamente com coordenadas X e Y deste ponto de imagem. Em seguida, a pipeta é retraída para longe da superfície(Figura 1C, traço inferior) a uma velocidade definida pelo usuário, geralmente 700-900 nm/ms. Após a retração, a pipeta (ou, no nosso caso, a amostra - ver Figura 1B) é movida lateralmente para o próximo ponto de imagem, um novo valor atual de referência é obtido, e a pipeta se aproxima mais uma vez da amostra, repetindo o processo. O movimento X-Y da pipeta é preferido em uma configuração de microscópio vertical que é normalmente usada para gravações das correntes de mecanotransdução das células ciliares. Nesta configuração, a sonda HPICM se aproxima dos feixes de células ciliares não do topo, mas de um ângulo32. No entanto, a melhor resolução da imagem HPICM é alcançada em uma configuração de microscópio invertido (Figura 1A,B), onde o movimento da amostra nas direções X-Y é desacoplado do movimento Z da nanopipette, eliminando assim potenciais artefatos mecânicos.
Usando hpicm, obtivemos imagens topográficas de feixes de esterecilia de células ciliadas internas e externas de ratos, e até visualizamos as ligações entre os estereocilias que têm cerca de 5 nm de diâmetro26,27. O sucesso da imagem do feixe de células ciliares com essa técnica conta com vários fatores. Primeiro, o ruído (variância) da corrente de nanopipette deve ser o menor possível para permitir o menor ponto de configuração possível para imagens HPICM. Um ponto de setpoint baixo permite que a sonda HPICM "sinta" a superfície estereócilia a uma distância maior e em qualquer ângulo para a abordagem da sonda e, surpreendentemente, melhora a resolução X-Y da imagem HPICM (ver Discussão). Em segundo lugar, as vibrações e derivas no sistema devem ser reduzidas para menos de 10 nm, uma vez que contribuem diretamente para os artefatos de imagem. Finalmente, mesmo que a sonda HPICM e o estágio da amostra sejam movidos em eixos Z e X-Y pelos atuadores piezo controlados por feedback calibrado que têm uma precisão de um único nanômetro ou melhor, o diâmetro da ponta de nanopipette determina a propagação da corrente (volume de sensoriamento) e, portanto, a resolução(Figura 1A). Portanto, antes de imaginar células ciliar vivas, é vital puxar as pipetas adequadas, alcançar a resolução desejada com amostras de calibração e obter baixo ruído no sistema de gravação.
Há pelo menos algumas décadas, a técnica sicm não está disponível comercialmente e vem sendo desenvolvida por poucos laboratórios no mundo com o laboratório líder do Prof. Korchev no Imperial College (Reino Unido). Recentemente, vários sistemas SICM tornaram-se comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais), todos baseados nos princípios originais do HPICM. No entanto, os feixes de esterecilia de imagem nas células ciliadas exigem várias modificações personalizadas que são tecnicamente desafiadoras (ou até mesmo impossíveis) nos sistemas fechados "prontos para ir". Portanto, é necessária alguma integração de componentes. Uma vez que a configuração HPICM representa uma plataforma de fixação com requisitos mais rigorosos de vibração e deriva e um movimento piezo-driven da sonda HPICM e da amostra (Figura 1D), essa integração é relativamente fácil para qualquer pesquisador, que é proficiente em fixação de patches. No entanto, um cientista sem experiência adequada definitivamente precisaria de algum treinamento em eletrofisiologia primeiro. Apesar dos desafios restantes, como o aumento da velocidade da imagem (ver Discussão),temos sido capazes de imaginar feixes de esterecilia em células ciliadas vivas com resolução de nanoescala sem danificá-las.
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para realizar imagens hpicm bem sucedidas dos pacotes de células capilares auditivas ao vivo em jovens explants cocleares pós-natal ou rato usando nosso sistema personalizado. Os componentes integrados estão listados na Tabela de Materiais. O artigo também descreve problemas comuns que podem ser encontrados e como solucioná-los.

<table><tbody><tr><td>Osciloscópio analógico</td><td>B& K Precision</td><td>2160C</td><td>Osciloscópio analógico para monitoramento em tempo real da corrente de nanopipeta e abordagem do eixo Z</td></tr> PADRÕES DE <tr><td>CALIBRAÇÃO AFM</td><td>TED PELLA Inc</td><td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>Estes padrões de calibração de 100 e 20 nm são usados para testar o desempenho do sistema HPICM</td></tr><tr><td>Isolador de vibração de bancada</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>Isolamento ativo de vibração</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>Capilares de vidro borossilicato para as nanopipetas</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Para ser adicionado à solução de banho para ajustar a osmolaridade</td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>Digitalizador de entrada/saída multicanal</td></tr><tr><td>Analógico rápido Controle proporcional-integral-derivativo (PID) para movimento Z</td><td>Standford Research Systems</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Módulos de instrumentação integrados em um controlador PID externo para movimento Z. Requer uma resposta rápida que geralmente não é implementada em amplificadores piezo comerciais.</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Tipo II</td><td>Necessária para proteger a interferência eletromagnética</td></tr><tr><td>Prato com fundo de vidro</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>Usado como prato para a câmara do tecido</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>Solução extracelular (banho)</td></tr><tr><td>Amplificador de instrumentação</td><td>Brownlee O</td> amplificador de instrumentação <td>Precision Modelo 440</td><td>fornece os deslocamentos necessários, filtragem e ampliação ou atenuação secundária</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas baseado em laser</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Extrator de micropipetas para fabricar as nanopipetas. O laser é necessário para pipetas de quartzo afiadas.</td></tr><tr><td>L-15 de Lebovitz, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Solução extracelular (banho)</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>Usado para posicionamento "curso" do atuador piezo Z</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Microscópio óptico invertido</td></tr><tr><td>Amplificador de patch</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td>O amplificador de grampo de remendo mede a corrente através do nanopipeta</td></tr><tr><td>Amplificador piezoelétrico (eixos XY)</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>E-500.00, E-505.00, E-509. Amplificação C2A</td><td>e controle PID para estágio de tradução piezo XY</td></tr><tr><td>Amplificador piezo (eixo Z)</td><td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>Amplificador personalizado composto por fonte de alimentação ENT 400 e dois amplificadores ENT 800 em paralelo para atingir corrente máxima de 1,6 nA</td></tr><tr><td>Lamínulas de plástico</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>Usado na fabricação das câmaras para o tecido&nbsp;</td></tr><tr><td>Controlador e software SICM</td><td>*Ionscope, Reino Unido (ionscope.com)</td><td>N/A</td><td>Controlador personalizado baseado em SBC6711 placa de processamento de sinal digital da Innovative Integration Ltd</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone (Sylgard)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>Usado para prender as fibras de vidro flexíveis à câmara para o tecido</td></tr><tr><td>Cola de silicone</td><td>The Dow Chemical Company</td><td>734</td><td>Usado para colar as diferentes partes da câmara para o tecido Haste de</td></tr><tr><td>tungstênio</td><td>A-M Systems</td><td>717500</td><td>Usado para segurar os fios de fio dental na câmara para o tecido</td></tr><tr><td>XY nanoposicionador piezoelétrico</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>P-733.2DD</td><td>Estágio de tradução XY com sensores capacitivos</td></tr><tr><td>Z nanoposicionador piezoelétrico</td><td>Piezoatuador</td> de anel <td>RA 12/24 SG</td><td>com um sensor de strain gage</td></tr><tr><td>*A Ionscope não vende mais controladores SICM separados. Existem poucos outros sistemas comerciais:&nbsp; NX12-Bio e NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Systems, Coréia e módulos SICM da ICAPPIC Limited, Reino Unido (icappic.com). Todos esses sistemas são baseados no original&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Princípios do HPICM. No entanto, a imagem de feixes de estereocílios nas células ciliadas requer várias modificações personalizadas que são tecnicamente&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>desafiador (ou mesmo impossível) no fechado " pronto para ir" sistemas como Ionscope ou NX12-Bio/NX10. Atualmente, há apenas um&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistema modular (ICAPPIC) que tem a flexibilidade para se adequar a qualquer experimento SICM/HPICM, mas requer alguma integração de componentes.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

As células ciliadas internas detectam deslocamentos induzidos pelo som e transduzem esses estímulos em sinais elétricos em um feixe de cabelo que consiste em estereócilias que são dispostas em fileiras de altura crescente. Quando estereócilia é desviada, elas puxam em minúsculas (~5 nm de diâmetro) elos de ponta extracelular interligando esterecilia, que transmitem forças para os canais de transdução mecanosensíveis. Embora a mecanotransdução tenha sido estudada em células ciliadas vivas há décadas, os detalhes ultraestruturais funcionalmente importantes do maquinário de mecanotransdução nas pontas da estereocilia (como dinâmica de ligação de ponta ou remodelação de estereócilia dependente de transdução) ainda podem ser estudados apenas em células mortas com microscopia eletrônica. Teoricamente, técnicas de sonda de varredura, como microscopia de força atômica, têm resolução suficiente para visualizar a superfície da estereócilia. No entanto, independente do modo de imagem, mesmo o menor contato da sonda de microscopia de força atômica com o feixe de estereócilia geralmente danifica o feixe. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a microscopia de condução de íons de ânhão de ânion de salto (HPICM) de células ciliadas auditivas de roedores vivos. Esta técnica de sonda de varredura sem contato permite imagens de lapso de tempo da superfície de células vivas com uma topografia complexa, como células ciliar, com resolução de nanômetros únicos e sem fazer contato físico com a amostra. O HPICM usa uma corrente elétrica que passa através da nanopipette de vidro para detectar a superfície celular nas proximidades da pipeta, enquanto um sistema piezoelétrico de posicionamento 3D escaneia a superfície e gera sua imagem. Com o HPICM, conseguimos imaginar feixes de estereocilia e os links interligando esterecilia em células ciliadas auditivas ao vivo por várias horas sem danos perceptíveis. Prevemos que o uso do HPICM permitirá a exploração direta de mudanças ultraestruturais na estereócilia das células ciliadas vivas para melhor compreensão de sua função.

O protocolo apresentado neste artigo pode ser usado para visualizar qualquer célula viva com topografia complexa. Seguindo essas etapas, obtém rotineiramente imagens de feixes de células ciliar auditivas de ratos vivos(Figura 6B,D). Apesar de ter resolução X-Y mais baixa quando comparadas às imagens SEM, nossas imagens HPICM podem resolver com sucesso as diferentes linhas de estereócilia, a forma das pontas estereócilias e até mesmo as pequenas ligações (~5 nm de diâmetro) c...

Aqui apresentamos um protocolo para a Microscopia de Condução de Íons da Sonda Hopping (HPICM), uma técnica de sonda de varredura sem contato que permite imagens nanoescala de feixes de estereócilia em células ciliadas auditivas vivas.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Este prático pode nos ajudar a estudar mudanças dinâmicas dos componentes nanoestrusivos do maquinário mecânico de transdução elétrica na superfície dos feixes de esterecilia da célula ciliar. A principal vantagem dessa técnica é a imagem de lapso de tempo da superfície das células vivas com topografia complexa em resolução de nanômetros simples, e sem fazer contato físico com a amostra. Esta técnica pode ser aplicada a quase qualquer célula viva.Anteriormente, combinamos com a superfície das linhas de células epiteliais pulmonares infectadas com vírus, células musculares, em My Image Bacteria Soon. Teste os nanopipettos no início de cada sessão de imagem. Depois de fabricar uma nanopipette, verifique se há bolhas, remova quaisquer bolhas se presentes e monte a nanopipette no suporte de pipeta de microscópio de condução da sonda de salto.Em quatro mililitros de solução de banho para a câmara e coloque a câmara no palco HPICM. Introduza o eletrodo moído à solução de banho e certifique-se de que a tensão que está sendo aplicada na pipeta através do amplificador de grampo de remendo é zero. Depois de colocar o micro manipulador na posição vertical, mova a pipeta em Z até que toque o líquido e ajuste o amplificador para zero, antes de adicionar mais 100 milvolts para verificar a corrente da pipeta.Use cola de silicone para anexar o padrão de calibração AFM à câmara e cubra a amostra com quatro mililitros de HBSS. Use fita dupla face para fixar a câmara ao estágio X Y da configuração HPICM e carregue uma nova nanopipette no suporte, conforme demonstrado. Depois de testar a resistência e o diâmetro da nanopipette, defina a corrente para um nano amp.Use um manipulador de grampos grosseiro para posicionar a nanopipette aproximadamente acima do centro do padrão de calibração e aumentar o ponto de ajuste enquanto monitora o sinal do sensor do atuador Z piezo em um osciloscópio em tempo real. Após estabelecer um ciclo de aproximação Z repetitivo estável, diminua o ponto de conjunto para o valor logo acima do ponto de instabilidade e mova a pipeta para baixo a uma velocidade de aproximadamente cinco mícrons por segundo, até chegar à amostra. O nível inferior do sinal de posicionamento Z em tempo real aumentará, indicando que a nanopipette é retirada devido à detecção da superfície da amostra.Devido à montagem desigual no padrão AFM, o ponto mais alto da área de interesse pode ser desconhecido. Por isso, coloque a amplitude da retração da pipeta em pelo menos 200 a 500 nanômetros. Tomando cuidado para não exceder o limite superior do movimento atuador Z piezo, comece a imagem em baixa resolução.Uma vez identificado o ponto mais alto da amostra na área de imagem, diminua a amplitude do lúpulo e retraia a pipeta cerca de 200 mícrons ao longo do eixo Z para evitar qualquer colisão indesejada com a amostra antes de movê-la para um novo local X Y. Quando a área de interesse estiver localizada, comece a fotografar em uma resolução mais elevada. Para imagens auditivas de células ciliares, proteja firmemente um órgão recém-isolado de Corti a uma câmara usando fio dental ou pipetas de vidro flexíveis.Use fita dupla face para fixar firmemente a câmara no estágio X Y piezo e carregar uma nova nanopipette no suporte, como demonstrado. Depois de verificar a resistência à nanopipette, use o micro manipulador de grampos para posicionar a nanopipette sobre a região da célula ciliada enquanto observa o órgão da planta Corti X em um microscópio invertido. Registre, o sinal de posicionamento atual e Z em tempo real no osciloscópio para verificar se o sistema está estável com um ponto de ajuste de 0,5%6 ou mais baixo, e determinar o ponto de ajuste ideal e aproximar-se da amostra como demonstrado.Realize imagens de baixa resolução da amostra como demonstrado usando uma amplitude de lúpulo de pelo menos seis a oito mícrons. Se a nanopipette precisar se mover para um novo local X Y, retraia a pipeta cerca de 500 nanômetros para evitar uma colisão com quaisquer características altas dentro do tecido e repetir a baixa resolução de imagem HPICM até a região de interesse onde as células ciliadas estão localizadas. Em seguida, imagem a região de interesse em uma resolução maior em 15 minutos ou menos.O protocolo HPICM pode ser usado para visualizar quaisquer células vivas com uma topografia complexa, como pacotes de células ciliros auditivas ao vivo. Apesar de demonstrar uma resolução X Y mais baixa em comparação com imagens de microscopia eletrônica, as imagens HPICM podem resolver com sucesso as diferentes linhas de estereócilia. A forma das pontas estereócilias e até mesmo as pequenas ligações de cinco nanômetros que conectam os estereócilias adjacentes.Dada a natureza não-contato da imagem HPICM, a imagem contínua de lapso de tempo do mesmo feixe de células ciliares pode ser realizada por várias horas sem danificar a coesão do feixe. Note que com um set point muito baixo, o sistema pode interpretar pequenas flutuações na corrente como encontrar a superfície celular, levando ao ruído de ponto branco na imagem. Da mesma forma, grandes amplitudes de lúpulo podem aumentar a ressonância lateral da pipeta, resultando também na produção de pixels barulhentos.Em contraste, se a amplitude do lúpulo for muito pequena, ou o setpoint for muito alto, a nanopipette pode colidir com a amostra resultando em artefatos de imagem ou danos no feixe de cabelo. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é gastar menos de 15 minutos por feixe de células ciliar ao trabalhar com células vivas. Depois de obter uma imagem do feixe de cabelo, pode-se tentar obter gravações de canal único de locais específicos na superfície da estereócilia para responder perguntas sobre propriedades do canal de mecanotransdução.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

Fonte: Lukasz, D., et al. Imagem de cálcio in vivo de células ciliadas da linha lateral em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra imagens ao vivo do influxo de cálcio nas células ciliadas da linha lateral de uma larva de peixe-zebra transgênica paralisada usando um microscópio confocal. A estimulação mecânica dos feixes de cabelo por meio de pulsos de fluido induz a entrada de cálcio através de canais de mecanotransdução e canais dependentes de voltagem, que é...

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