Name: Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a incorporar acetil-lisina em histonas H3 de forma específica usando Escherichia coli e a sintetase MmAcKRS1. Este método permite a reconstituição de mononucleossomos acetilados para estudos epigenéticos.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Wesley Wang por estabelecer as bases para este protocolo e sua valiosa mentoria. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e pela Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Construção plasmid
<ol><li>Comece decidindo qual proteína de histona será acetilada e em qual sítio de lise. Mutação do site para o codon de parada âmbar (TAG) usando mutagênese direcionada ao site. NOTA: Existem quatro plasmídeos previamente projetados utilizados para a expressão de proteínas histonas. Todas as quatro proteínas histonas foram clonadas no vetor pETDuet-1 com uma etiqueta de histidina n-terminal. Histone H4 também inclui uma tag SUMO, a origem do colE1 de replicação com um número de cópia de aproximadamente 40, resistente à ampicilina, e um promotor T7.<ol>
<li>Projete primers para frente e reverso que contenham uma mutação TAG no local desejado (substituindo um codon de lysina existente pelo codon de parada âmbar) em um dos quatro plasmídeos de proteína histona.</li>
		<li>Use PCR de plasmídeo inteiro para amplificar o TAG contendo plasmídeo. Determine uma temperatura de ressarcial apropriada para os primers. Em geral, a temperatura de fusão (Tm)dos primers menos 5 °C será suficiente. Se houver dificuldade para obter um produto PCR, um gradiente de temperatura em torno de Tm - 5 °C pode ser usado para otimizar a temperatura de ressarcimento para amplificação. NOTA: Neste experimento foi utilizada uma polimerase pfu expressa internamente para 30 ciclos com as seguintes condições: 94 °C para 30 s (desinaturação), temperatura de ressarcial para 30 s e 72 °C para 6 min (ou 1 min por quilobase-pares). Para obter mais detalhes sobre este tipo de método PCR, consulte Liu e Naismith7.</li>
		<li>Limpe o produto PCR com um kit de limpeza PCR seguindo o protocolo do fabricante. Analise o produto PCR por eletroforese de gel agarose e posterior coloração de brometo de ethidium.</li>
		<li>Liga o plasmídeo incubando com liga ligase T4 durante a noite a 16 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Primeiro transforme a TAG contendo plasmídeo (AmpR)em Escherichia coliquimicamente competente . Escolha um mínimo de 4 colônias da transformação e purifique o plasmídeo. Faça estoques de células de cada um com glicerol usando métodos padrão e armazene a -80 °C. Envie para sequenciamento para confirmar a mutação TAG desejada.</li>
	<li>Uma vez confirmada a sequência, co-transforme o plasmídeo contendo TAG (AmpR) com pEVOL-AckRS (ChlR) em CobB quimicamente competente (a única deacetylase histone lysine conhecida em células BL21 de E. coli.) usando o método de choque térmico. pEVOL é um plasmid com um número de cópia média para baixo número de cópia p15A de origem. NOTA: A série pEVOL de plasmídeos foi construída com base em estudos anteriores que mostraram uma expressão aumentada do par ortogonal aaRS/tRNATyr foi eficaz na diminuição da truncação proteica e no aumento do rendimento global das proteínas mutantes8. Se as células de exclusão de CobB não estiverem acessíveis, proceda com células BL21 quimicamente competentes. CobB é uma deacetilase de histonina de histonina e nicotinamida semelhante a histuina sirtuina e nicotinamida pode ser adicionada a uma concentração final de 5 mM durante a expressão da proteína histona para inibir o CobB como uma abordagem alternativa9.</li>
	<li>Faça um estoque de celular e armazene a -80 °C.</li>
</ol>2. Expressão de proteína histona acetilada
<ol><li>Prepare 1 L de mídia 2YT autoclaved (ou volume de escolha) em um frasco de cultura.</li>
	<li>Inocular 20 mL de mídia 2YT contendo os antibióticos apropriados com o estoque de células co-transformadas que tem o plasmídeo contendo TAG (AmpR) e pEVOL-AckRS (ChlR) e crescer a 37 °C a OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Adicione os antibióticos apropriados ao 1 L de mídia 2YT autoclaved e inoculada com a cultura inicial de 20 mL. Cresça a 37 °C a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Adicione agentes indutores e acetilizesina (AcK) às concentrações finais de IPTG 1 mM, 0,2% arabinose e AcK 5 mM.</li>
	<li>Cresça a cultura a 37 °C para 6-8 h.</li>
	<li>Células de pelota a 2.700 x g por 15 min.</li>
	<li>Armazene a pelota da célula a -80 °C durante a noite.</li>
	<li>A partir deste passo em diante mantenha a amostra no gelo o tempo todo. Dissolva a pelota celular em 50 mL de tampão de histona por 1 L de cultura.</li>
	<li>Sonicate de acordo com o seguinte ciclo: 1 s on, 1 s off, total at time: 3 min a 60% de amplitude.</li>
	<li>Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 45 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão de supernasciente e resuspend em 30 mL de tampão de histona. A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 30 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão supernasce e resuspend em 30 mL de tampão de lavagem de pelotas. Corpos de inclusão de pelotas a 41.600 x g por 30 min.</li>
	<li>Descarte os corpos de inclusão supernasce e dissolvido em 25 mL de 6 M Guanidine Hydrochloride (GuHCl). Incubar com agitação a 37 °C por 1h. NOTA: Se necessário, os corpos de inclusão podem ser incubados com agitação durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>A inclusão de pelotas é de 41.600 x g por 45 min. Incubar o supernaente com 1 mL de resina Ni-NTA equilibrada com tampão guhcl de 6 M por 2 h.</li>
	<li>Prossiga com a purificação ni-NTA em condições desnaturadas. Lave a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de lavagem de coluna. Elute acetilou proteína histona com 10 mL de tampão de eluição. NOTA: Tentar concentrar a proteína aqui é uma opção, mas histones acetilados são muito imprevisíveis e podem facilmente precipitar. Não é recomendável concentrar-se além de 2 mL em volume total.</li>
	<li>Digele extensivamente a proteína histona acetilada contra 5% de tampão de ácido acético para remover sais. Dialisar por 3h de cada vez a 4 °C, trocando por tampão fresco mínima de 6 vezes. NOTA: Para uma melhor pureza proteica, há a opção de diálise contra água pura. No entanto, isso causa precipitação significativa e redução no rendimento que pode ser indesejável para proteínas histonas acetiladas de baixo rendimento.</li>
	<li>Aliquot e proteína liofilizada, e armazenar indefinidamente a -80 °C. As proteínas histonas do tipo selvagem geralmente produzem 10-50 mg/L, enquanto as proteínas de histona acetiladas produzem menos de 10 mg/L, dependendo do local específico da lise. Por exemplo, H3K79Ac tem uma média de 5 mg/L.</li>
</ol>3. Expressão de proteína histona tipo selvagem
<ol><li>Para montar nucleossomos completos, expresse todas as 4 proteínas histonas. Ao expressar e purificar histones do tipo selvagem, o protocolo é o mesmo que as histonas acetiladas, exceto as seguintes:<ol>
<li>Não realize a co-transformação. Não use pEVOL-AcKRS para expressão histona tipo selvagem. Ajuste os antibióticos de acordo.</li>
		<li>Não use uma linha celular de exclusão de CobB ou adicione nicotinamida, AcK ou arabinose durante a indução da expressão celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparação de 601 DNA
NOTA: Uma sequência de DNA otimizada previamente projetada para o posicionamento nucleossomo direto é montada com octamers de histona para produzir mononucleossomo com alta eficiência. Esta sequência é referida como 601 DNA ou a sequência de Widom. Esta sequência tornou-se a sequência padrão de DNA para estudos in vitro de nucleososos desde ensaios de remodelação de cromatina até medições de molécula única10.
<ol><li>Para preparar quantidades significativas de DNA 601 para montagem nucleosômica, transforme pGEM-3z/601 em células Top 10 e cresça 10 mL de cultura para amplificação e extração plasmóides. Use um kit de extração de plasmídeos e siga a recomendação do fabricante.</li>
	<li>Use uma polimerase PFU expressa internamente (mais eficiente) para este protocolo de amplificação. Configure uma reação pcr: Para uma reação de 250 μL, use 207,5 μL autoclaved MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccgg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. Normalmente corremos 60 reações de uma vez para obter DNA suficiente para montar.</li>
	<li>Use uma temperatura de ressarção de 52 °C para 30 s e um tempo de extensão de 30 s se usar polimerase PFU. Caso contrário, siga as condições recomendadas pelos fabricantes.</li>
	<li>Uma vez feito o PCR, use um kit de limpeza PCR para purificar o produto PCR.</li>
</ol>5. Montagem de histone octamer
<ol><li>Dissolva alíquotas de pelotas de proteína histona H2A, H2B, H3 e H4 para que haja um estoque separado de cada proteína histona em Tampão guhcl com um volume total de 100 μL.</li>
	<li>Calcule a concentração de cada proteína histona medindo a absorvância A280.</li>
	<li>Se a absorvância for maior que 1 para qualquer proteína, dilui com o tampão guhcl para obter uma concentração mais precisa.</li>
	<li>Combine proteínas H2A e H2B em uma razão molar de 1:1 e dilua para uma concentração proteica total de 4 μg/μL. Repita para H3 e H4.</li>
	<li>Dialyze sequencialmente a 4 °C contra 2 M TE tampão durante a noite, 1 M TE tampão por 2 h e 0,5 M TE tampão por 5 h. NOTA: O segundo e terceiro passos da diálise faz com que as conformações instáveis de proteínas precipitam. Espera-se que haja precipitação pesada nestas etapas.</li>
	<li>Remova precipitados por centrifugação a 16.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Novamente, calcule a concentração de dimers de histona (mistura H2A/H2B) e tetramers (mistura H3/H4) medindo a absorvância A280.</li>
	<li>Misture dimers e tetramers em uma relação molar de 1:1 e ajuste NaCl para 2 M pela adição de NaCl sólido.</li>
	<li>O octamer histona pode ser armazenado a 4 °C e é mais estável do que os dimers e tetramers. Nunca congele a octamer de histona, pois isso pode causar desmontagem.</li>
	<li>Se montar com histones acetilados, basta substituir a proteína do tipo selvagem pela proteína acetilada no procedimento.</li>
</ol>6. Montagem nucleossomo
<ol><li>Use tampão 100x TE e NaCl sólido para ajustar 601 DNA ao buffer te de 2M. Adicione o DNA 601 em tampão 2M TE ao octamer histona em uma razão molar de 0,85:1 a 0,90:1. Uma menor proporção de DNA pode ser adicionada se o DNA livre estiver presente na análise de mudança de gel.</li>
	<li>Transfira a mistura DNA-histona de um saco de diálise e coloque em cerca de 200 mL de tampão de 2M TE (ou mais se montar várias amostras) e mexa suavemente a 4 °C.</li>
	<li>Ajuste uma bomba peristáltica para limpar para gotejar lentamente sem tampão de TE de sal. Quando o volume tiver aproximadamente dobrado, despeje metade do volume. Faça isso pelo menos 4 vezes no total. Com uma bomba, pode levar de 4 a 8 h, dependendo do volume inicial. Os nucleosmos formam-se quando a concentração de sal é reduzida para 150 mM (medida pelo medidor de salinidade).</li>
	<li>Após a concentração de sal ser reduzida para 150 mM, dilíque contra um buffer TE de 20 mM durante a noite.</li>
	<li>Remova precipitados por centrifugação e meça a concentração dos nucleosmos por uma leitura260 usando um leitor de placas.</li>
	<li>Adicione protease His-TEV (TEV: nucleossomo 1:30, w:w ) e incubar durante a noite a 4 °C para remover todas as tags de histidina. Remova as impurezas da tag histidina da solução nucleossom pela resina Ni-NTA puxada para baixo.</li>
	<li>Para posicionar o nucleossomo e homogeneizar a amostra, incubar a 60 °C por 1h. NOTA: Para locais acetilados que são particularmente instáveis, esta etapa pode não ser aconselhável.</li>
	<li>Armazene nucleososomos por curto prazo (algumas semanas) a 4 °C.</li>
	<li>Para armazenamento a longo prazo, dilyze nucleossomos contra buffer de armazenamento e armazene a -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Não há interesses financeiros concorrentes para declarar por nenhum dos autores.

É essencial seguir este protocolo em cada detalhe durante um experimento. Os nucleosmos não são muito estáveis e muita tentativa e erro foi para determinar este protocolo. É fundamental remover precipitados a cada passo (ou sempre observado) porque as partículas podem interferir facilmente nos processos de montagem. Sempre mantenha amostras de histona no gelo. Se os nucleosómos são armazenados a 4 °C por muito tempo, eles podem desmontar espontaneamente. Certifique-se de verificar quaisquer amostras por Native PAGE se ar...

Utilizamos PylRS e tRNAPyl para sintetizar e montar mononucleosmos reconstituídos com histones acetilados específicos do local. A PylRS provou ser inestimável como uma ferramenta de expansão de código genético para produzir proteínas com modificações pós-translacionais (PTMs) e foi geneticamente evoluída para incorporar cerca de 200 ncAAs diferentes. PylRS incorpora em um códon de parada âmbar, removendo a concorrência de outros aminoácidos durante a tradução. PylRS foi descoberto pela primeira vez na arquiaia metogênica, e desde então tem sido utilizado em biologia química para incorporar novos grupos químicos reativos em proteínas1,2.
O MMAcKRS1 foi evoluído de Metanoosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizado em nosso laboratório para a síntese de proteínas acetiladas3,4,5,6. MmAcKRS1 fornece AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica foi usada anteriormente para incorporar ack em k4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64, e K79 histone H3 lysine sites para estudar a atividade de Sirtuin 1, 2, 6, e 7 em mononucleosmos acetilados4,5,6. Aqui detalhamos este método para expressar histones acetilados e nucleosómos acetilados reconstituídos.

<table><tbody><tr><td>0,5 M TE Buffer</td><td>NA NA</td><td></td><td>0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA NA</td><td></td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA NA</td><td></td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M cloreto de guanidínio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetillisina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem em Coluna</td><td>NA</td><td>NA 6</td><td>M ureia, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazol pH 7.8</td></tr><tr><td>Tampão de Eluição</td><td>NA</td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Bomba de transferência química de fluxo variável</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de histona</td><td>NA NA</td><td></td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0</td></tr><tr><td>Resina</td><td></td><td></td> Ni-NTA <td>6 M ureia, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de PCR</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lavagem de pellets</td><td>NA NA</td><td></td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Armazenamento</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site lysine acetilation specific de histones para reconstituição nucleososome usando expansão do código genético em escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Proteínas histonas acetiladas podem ser facilmente expressas em Escherichia coli codificando um mutante, Nε-acetil-lysine (AcK)-específica Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) e seu tRNA cognato (tRNAPyl) para reunir mononucleosmos estabelecidos com histones acetiladas específicas. MmAcKRS1 e tRNAPyl entregam AcK em um local de mutação âmbar no mRNA de escolha durante a tradução em Escherichia coli. Esta técnica tem sido usada extensivamente para incorporar AcK em locais de lise H3. A sithetase pirrolysíl-tRNA (PylRS) também pode ser facilmente evoluída para incorporar outros aminoácidos não-orônicos (ncAAs) para modificação ou funcionalização de proteínas específicas do local. Aqui detalhamos um método para incorporar o AcK usando o sistema MmAcKRS1 no histona H3 e integrar proteínas H3 acetiladas em mononucleosmos reconstituídos. Mononucleososes reconstituídos acetilados podem ser usados em ensaios bioquímicos e de ligação, determinação da estrutura e muito mais. A obtenção de mononucleosmos modificados é crucial para projetar experimentos relacionados à descoberta de novas interações e compreensão da epigenética.

Dimers, tetramers e octamers podem ser avaliados executando um gel de PÁGINA SDS de 12%(Figura 1 e Figura 2). Aqui você pode ver que alguns dos tetramers acetilados têm um rendimento menor do que outros(Figura 1). De fato, quanto mais perto da região central, menor o rendimento observado. Isso é mais provável devido à acetilação interferindo na montagem do tetramer quanto mais perto você chegar das r...

Aqui apresentamos um método para expressar proteínas histonas acetiladas usando expansão de código genético e montar nucleososomos reconstituídos in vitro.

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

A obtenção de mononucleossomo modificado é crucial para o planejamento de experimentos epigenéticos. Nosso protocolo fornece mononucleossomos reconstituídos acetilados que podem ser usados em ensaios bioquímicos e de ligação, determinação de estrutura e muito mais. A principal vantagem de nossa técnica é sua versatilidade.Este sistema pode ser facilmente modificado para incorporar muitos tipos de modificações em mononucleossomos. Comece preparando um litro de meio 2YT autoclavado em um frasco de cultura. Inocular 20 mililitros do meio contendo antibióticos apropriados com o estoque de células co-transformado que tem a etiqueta contendo plasmídeo e pEVOL-AckRS e cultivá-los a 37 graus Celsius para obter uma DO de 0,6.Adicione antibióticos apropriados em um litro de meio 2YT autoclavado e inocule-o com 20 mililitros de cultura inicial. Cultive a cultura a 37 graus Celsius por duas a três horas para obter um OD de 0,6, 2,8. Adicione agentes indutores e AcK para uma concentração final de um IPTG milimolar, 0,2% de arabinose e cinco AcK milimolar.Cultive a cultura a 37 graus Celsius por seis a oito horas. Em seguida, pulverize as células a 2.700 x g por 15 minutos e armazene-as durante a noite a 80 graus Celsius negativos. Dissolva o pellet em 50 mililitros de tampão de lise de histonas por litro de cultura e sonice as células a 60% de amplitude por três minutos com intervalos de um segundo e um segundo desligado.Corpos de inclusão de pellets a 41.600 x g por 45 minutos. Rejeitar o sobrenadante e, em seguida, ressuspender os corpos de inclusão em 30 mililitros de tampão de lise de histonas e, em seguida, centrifugar novamente durante 30 minutos. Ressuspenda novamente os corpos de inclusão em 30 mililitros de tampão de lavagem de pellets e repita a centrifugação.Em seguida, dissolva os corpos de inclusão em 25 mililitros de tampão cloridrato de guanidina de seis molares. Incubar com agitação a 37 graus durante uma hora e depois centrifugar durante 45 minutos. Incubar o sobrenadante com um mililitro de resina de níquel-NTA equilibrada com tampão cloridrato de guanidínio de seis molares durante duas horas e proceder à purificação de níquel-NTA em condições desnaturadas.Lave a coluna com três volumes de tampão de lavagem e, em seguida, elua a proteína histona acetilada com 10 mililitros de tampão de eluição. Dialise a proteína histona acetilada contra tampão de ácido acético a 5% para remover sais por três horas a quatro graus Celsius, trocando o tampão no mínimo seis vezes. Alíquota e lipolizar a proteína e armazenada indefinidamente a 80 graus negativos.Dissolva alíquotas de pastilhas de proteína histona H2A, H2B, H3 e H4 para que haja um estoque separado de cada proteína histona no tampão cloridrato de guanidínio para o volume total de 100 microlitros. Calcule a concentração de cada proteína histona medindo os absorventes em 280 nanômetros. Se a absorbância for maior que um para qualquer proteína, dilua com tampão de cloridrato de guanidínio para obter uma concentração mais precisa.Combine H2A com H2B e H3 com proteínas H4 em uma proporção molar de um para um e dilua até uma concentração total de proteína de quatro microgramas por microlitro. Dialisar sequencialmente a quatro graus Celsius contra tampão TE dois molares durante a noite, tampão TE molar por duas horas e tampão TE 0,5 molar por cinco horas. Quando terminar, centrifugue a 16.800 x g a quatro graus Celsius para remover o precipitado.Calcule a concentração de dímeros de histonas e tetrâmeros medindo a absorbância em 280 nanômetros. Misture os dímeros e tetrâmeros em uma proporção molar de um para um e ajuste a concentração de cloreto de sódio para 2M. Ajuste o DNA 601 para tampão TE de dois molares usando tampão TE 100X e cloreto de sódio sólido.Adicione a solução ao octâmero de histonas a uma razão molar de 0,85, 2,9 para um. Transfira a mistura de histonas de DNA para uma bolsa de diálise e coloque-a a cerca de 200 mililitros de tampão TE de dois molares com agitação muito suave a quatro graus Celsius. Configure a bomba peristáltica para pingar lentamente no tampão TE sem sal.Quando o volume tiver aproximadamente dobrado, despeje metade do volume. Faça isso pelo menos quatro vezes, o que pode levar de quatro a oito horas, dependendo do volume inicial. Depois que a concentração de sal for reduzida para 150 milimolares, dialisar contra um tampão TE de 20 milimolares durante a noite.Remover precipitados por centrifugação e medir a concentração dos nucleossomas com um leitor de placas. Adicione a protease his-TEV e incube durante a noite a quatro graus Celsius para remover todas as marcas de histidina. Em seguida, remova as impurezas da marca de histidina da solução de nucleossomo com resina de níquel-NTA puxada para baixo.Incubar a 60 graus Celsius por uma hora para posicionar o nucleossomo e homogeneizar a amostra. Armazene nucleossomos a quatro graus Celsius a curto prazo. Para armazenamento de longo prazo, dialise os nucleossomos contra o tampão de armazenamento e armazene a 80 graus Celsius negativos.Alguns dos tetrâmeros acetilados tiveram um rendimento menor do que outros, conforme avaliado pela execução de um gel 12%SDS-PAGE. Quanto mais próximo da região central, menor o rendimento observado. Isso provavelmente se deveu à acetilação, interferindo na montagem do octâmero.Após a montagem de octâmeros com a sequência de DNA 601, o nucleossomo pode ser avaliado usando um gel PAGE nativo de TBE 5%1X seguido de coloração com brometo de etídio. Antes do posicionamento térmico, as bandas de nucleossomos observadas são muito largas e podem estriar. Ao realizar este protocolo, mantenha as proteínas no gelo o tempo todo.É crucial manter dímeros, tetrâmeros e nucleossomos montados. Este procedimento permitiu aos pesquisadores instalar os sítios de acetil lisina, especificamente em mononucleossomos, abrindo a porta para o estudo de modificações pós-traducionais em um contexto de cromatina. Pode ser facilmente adaptado para instalar qualquer número de aminoácidos não canônicos.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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