Name: Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a gerar equivalentes de pele humana vascularizada com cultura de longo prazo e análise volumétrica. Este protocolo personalizável permite estudar doenças, envelhecimento e medicina personalizada com modelos fisiologicamente relevantes.

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Os autores agradecem ao Dr. Jim Rheinwald59 e à Dra. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association (19IPLOI34760636).

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo demonstrou um método simples e repetível para a geração de VHSEs e sua análise tridimensional. É importante ressaltar que este método conta com poucas técnicas especializadas ou peças de equipamento, tornando-o acessível para uma gama de laboratórios. Além disso, os tipos de células podem ser substituídos por mudanças limitadas no protocolo, permitindo que os pesquisadores adaptem este protocolo às suas necessidades específicas.
A gelação de colágeno adequada é um passo desafiador no estabelecimento da cultura da pele. Especialmente quando se usam preparações brutas sem purificação, os contaminantes de traços podem influenciar o processo de gelação. Para ajudar a garantir a consistência, grupos de experimentos devem ser realizados com o mesmo estoque de colágeno que será usado para a geração VHSE. Além disso, a gelação deve ocorrer idealmente em um pH de 7-7.4, e os contaminantes de traços podem mudar o pH. Antes de usar qualquer caldo de colágeno, deve-se fazer um gel acelular prática na concentração desejada e o pH deve ser medido antes da gelação. Completar esta verificação de qualidade de colágeno antes de iniciar a semeadura de componentes dérmicos identificará os problemas com a homogeneidade adequada de gelação e colágeno antes de configurar um experimento completo. Em vez de semear colágeno acelular diretamente em uma inserção de cultura, semeou um pouco de colágeno em uma tira de pH que avalia toda a escala de pH e verifica um pH de 7-7.4. A gelação pode ser avaliada aplicando uma gota da solução de gel de colágeno em uma placa de plástico de cultura de tecido ou cultura de tecido (uma placa de poço é recomendada para simular os lados confinados de uma inserção de cultura). Após o tempo de gelação, o colágeno deve ser sólido, ou seja, não deve fluir quando a placa estiver inclinada. Sob microscopia de contraste de fase, o colágeno deve parecer homogêneo e claro. Bolhas ocasionais de sementes de colágeno são normais, mas grandes bolhas amorfas de colágeno opaco dentro do gel claro indica um problema provável devido à mistura insuficiente, pH errado e/ou falha em manter o colágeno refrigerado durante a mistura.
As quantidades de semeadura de células e a mídia podem ser ajustadas. No protocolo acima, as quantidades de células encapsuladas foram otimizadas para uma inserção de 12 poços em 7,5 x 104 fibroblastos e 7,5 x 105 células endoteliais por mL de colágeno com 1,7 x 105 queratinócitos semeados em cima da construção dérmica. As densidades celulares foram otimizadas para este protocolo VHSE com base nos estudos preliminares e na pesquisa anterior que investigou a geração de rede vascular 3D em várias concentrações de colágeno48 e HSE geração22,80,81. Em sistemas semelhantes, as densidades de células endoteliais publicadas são 1,0 x 106 células/mL colágeno48; as concentrações do fibroblasto muitas vezes variam de 0,4 x 105 células/mL de colágeno22,28,82 a 1 x 105 células/mL de colágeno8,58,83,84,85; e as concentrações de queratinócitos variam de 0,5 x 105 [células/cm2]80 a 1 x 105 [células/cm2]8. As densidades celulares podem ser otimizadas para células específicas e questões de pesquisa. Culturas tridimensionais com células contratuais, como fibroblastos, podem se contrair levando à redução da viabilidade e perda de cultura86,87. Experimentos preliminares devem ser concluídos para testar a contração do compartimento dérmico (que pode ocorrer com mais células dérmicas, mais células dérmicas contratuais, culturas de submersão mais longas ou matrizes mais macias) e testar a cobertura epidérmica da superfície. Além disso, o número de dias em submersão e a taxa de afunilamento do conteúdo do soro também podem ser personalizados se a contração dérmica excessiva estiver ocorrendo ou uma taxa diferente de cobertura de queratinócitos for necessária. Por exemplo, se a contração for notada durante o período de submersão dérmica ou enquanto os queratinócitos estão estabelecendo uma monocamada superficial, movendo-se mais rapidamente através do processo de afunilamento do soro e levantando VHSEs para ALI pode ajudar na prevenção de contração adicional. Da mesma forma, se a cobertura de queratinócitos não for ideal, alterar o número de dias em que o VHSE está submerso sem soro pode ajudar a aumentar a cobertura epidérmica de monocamadas e mitigar a contração, uma vez que o soro é deixado de fora. Mudanças nas densidades celulares ou outras sugestões acima devem ser otimizadas para as culturas específicas e objetivos de pesquisa.
Para estabelecer uma estratificação adequada da epiderme durante o período de interface líquida de ar (ALI), é fundamental verificar e manter regularmente os níveis de fluidos em cada poço para que a ALI e a hidratação apropriada de cada construção sejam mantidas durante todo o comprimento da cultura. Os níveis de mídia devem ser verificados e rastreados diariamente até que os níveis consistentes de ALI sejam estabelecidos. A camada epidérmica deve parecer hidratada, não seca, mas não deve haver piscinas de mídia na construção. Durante a ALI, a construção desenvolverá uma cor branca/amarela opaca que é normal. A camada epidérmica provavelmente se desenvolverá de forma desigual. Comumente, os VHSEs são inclinados devido à semeadura de colágeno ou contração dérmica. Também é normal observar uma porção epidérmica mais alta no meio do construto em construções menores (24 de tamanho) e uma formação de cume em torno do perímetro do VHSE em 12 tamanhos. A contração dos construtos13 pode alterar essas formações topográficas e/ou não ser observada.
A coloração e a imagem dos VHSEs introduzem manipulação mecânica aos VHSEs. É muito importante planejar e limitar a manipulação de cada cultura. Quando a manipulação for necessária, mantenha movimentos suaves ao remover VHSEs das membranas de inserção, ao adicionar soluções de coloração ou lavagem à superfície do construto e ao remover e substituir VHSEs em seus poços de armazenamento/imagem durante a preparação de imagens. Especificamente, as camadas apical do componente epidérmico podem ser frágeis e correm o risco de tirar as camadas epidérmicas basais. As camadas apical da epiderme são frágeis e passam por desquamação mesmo no tecido nativo4,mas para análise precisa da estrutura epidérmica é importante minimizar danos ou perdas. Se as camadas epidérmicas decolarem da construção, elas podem ser imagens separadamente. As camadas basais da epiderme provavelmente ainda estão ligadas à derme, enquanto porções das camadas apical podem se desprender. Para visualização da epiderme, uma mancha nuclear é útil para observar isso, uma vez que núcleos densos são uma característica de camadas inferiores e médias da epiderme.
A imagem confocal da pós-fixação VHSE foi discutida no protocolo, mas também é possível imaginar os VHSEs em toda a cultura através da tomografia de coerência óptica baseada em vertical (OUT)88,89,90,91,92,93. VHSE são estáveis o suficiente para suportar imagens sem incubação ou umidificação por pelo menos duas horas sem efeitos perceptíveis. Como o OCT é livre de rótulos e não invasivo, é possível rastrear a espessura epidérmica durante a maturação. Outras modalidades de imagem não invasivas também podem ser empregadas.
A imagem volumosa das estruturas dérmicas e epidérmicas combinadas pode ser desafiadora devido à atenuação a laser mais profunda no VHSE. Isso pode ser mitigado por imagem do construto em duas orientações, do lado epidérmico(Figura 1) e do lado dérmico(Figura 2),permitindo uma boa resolução das estruturas vasculares dérmicas e da epiderme. Além disso, a amostra pode ser limpa, permitindo imagens volumosas de toda a estrutura com atenuação mínima. No entanto, foram tentados vários métodos de compensação, no entanto, o método de salicilato de metanol/metila descrito produziu os melhores resultados. Pesquisadores interessados em otimizar outros métodos de compensação são direcionados para essas revisões49,61,62. Se for limpa, é sugerido a imagem completa da amostra antes da limpeza, pois o método pode danificar os fluoroforos e/ou a estrutura. Além disso, a imagem deve ser concluída o mais rápido possível após a clareira, pois a fluorescência pode desaparecer em poucos dias.
Para simplicidade e acessibilidade, este protocolo utilizou as misturas de mídia mais simples encontradas na literatura anterior11,80. Embora existam muitas vantagens em usar misturas de mídia simples, as limitações dessa escolha também são reconhecidas. Outros grupos estudaram os efeitos de componentes específicos da mídia sobre a saúde epidérmica e dérmica e descobriram que outros aditivos de mídia94, como ácidos graxos/lipídios livres externos, melhoram o corneum estrato da epiderme e melhoram a função da barreira cutânea. Embora nossos marcadores imunofluorescentes mostrem diferenciação e estratificação adequadas na epiderme, dependendo dos estudos que estão sendo conduzidos, pode ser necessária otimização adicional da mídia. Além disso, não foi realizada uma extensa análise da BM epidérmica ao avaliar as VHSEs aqui apresentadas. A integridade do BM é uma importante indicação de equivalentes de pele; vários grupos fizeram pesquisas sobre a duração da cultura e seu efeito sobre as marcas de MMC95, bem como a análise da presença do fibroblasto e adicionados efeitos do fator de crescimento na expressão BM14. É importante ressaltar que a análise do componente BM deve ser avaliada e otimizada ao utilizar este protocolo.
Neste protocolo é descrito um procedimento para a geração VHSE, demonstrando resultados após 8 semanas na ALI. As culturas VHSE foram cultivadas até 12 semanas na ALI sem mudanças perceptíveis ou perda de viabilidade, e é possível que elas possam ser viáveis por mais tempo. É importante ressaltar que este protocolo é prontamente adaptável aos tipos de células comumente disponíveis, como demonstrado pela substituição de fibroblastos dérmicos por fibroblastos pulmonares IMR90. Dependendo da necessidade do pesquisador e dos recursos disponíveis, os tipos de células e misturas de mídia sobre a cultura podem ser ajustados, embora tipos de células mais diferentes possam exigir otimização da mídia. Em resumo, esses procedimentos visam fornecer clareza sobre a cultura das VHSEs para o estudo da biologia da pele e da doença. Para maximizar a acessibilidade, o protocolo foi desenvolvido tão simples e robusto utilizando equipamentos comuns, linhas celulares e reagentes como uma abordagem mínima e eficaz que pode ser ainda mais personalizada às necessidades específicas de estudos de pesquisa.

A pele humana desempenha muitas funções biológicas essenciais, incluindo atuar como uma barreira imune/mecânica, regular a temperatura corporal, participar da retenção de água e dos papéis sensoriais1,2,3,4. Anatomicamente, a pele é o maior órgão do corpo humano e é composta por três camadas principais (epiderme, derme e hipoderme) e possui um complexo sistema de componentes do sistema estroma, vascular, glandular e imunológico/nervoso, além de células epidérmicas. A epiderme em si é composta por quatro camadas de células que são continuamente renovadas para manter a função de barreira e outras estruturas de pele nativa (ou seja, glândulas de suor e sebáceos, unhas)3. A fisiologia da pele é importante na função imunológica, cicatrização de feridas, biologia do câncer e outros campos, levando os pesquisadores a usar uma ampla gama de modelos, desde monoculturas in vitro até modelos in vivo animais. Modelos animais oferecem a capacidade de estudar toda a complexidade da fisiologia da pele, no entanto, modelos animais comumente usados, como camundongos, têm diferenças fisiológicas significativas quando comparados aos humanos5. Essas limitações, e o aumento do custo dos modelos animais, levaram muitos pesquisadores a se concentrarem no desenvolvimento de modelos in vitro que refletem mais de perto a fisiologia da pele humana1,6. Destes, um dos tipos de modelos mais simples é o equivalente epidérmico humano (HEE; também referido como modelos de pele de meia espessura) que são compostos apenas de queratinócitos epidérmicos em uma matriz dérmica acelular, mas capturam diferenciação epidérmica e estratificação vistas in vivo. Com base nisso, modelos contendo componentes dérmicos e epidérmicos (queratinócitos e fibroblastos) são frequentemente referidos como equivalentes de pele humana (HSE), modelos de pele de espessura total ou construtos de pele organotípicas (OSC). Resumidamente, esses modelos são gerados encapsulando células dérmicas dentro de matrizes de gel e semeando células epidérmicas no topo. A diferenciação epidérmica e a estratificação podem então ser alcançadas através da mídia especializada e da exposição ao ar7. Os equivalentes de pele têm sido gerados na maioria das vezes através de técnicas de auto-montagem usando géis dérmicos feitos de colágeno tipo I (de cauda de rato ou origem bovina)1,8, mas modelos semelhantes incorporaram outros componentes matriciais, como fibrina9,10, fibroblast dederivados 11,12, membranas subêmias desepinômicas13,14,15,16, géis comercialmente disponíveis e outros1,12,13,17,18,19. Atualmente, existem equivalentes de pele disponíveis comercialmente (conforme revisado anteriormente1,2). No entanto, estes são desenvolvidos principalmente para fins terapêuticos e não podem ser facilmente personalizados para questões específicas de pesquisa.
As ESH foram aplicadas em estudos de cicatrização de feridas, enxertos, toxicologia e doença/desenvolvimento da pele11,12,13,16,8,20,21,22,23. Embora a cultura 3D modele de forma mais abrangente as funções do tecido humano em comparação com as culturas 2D24,a inclusão de diversos tipos de células que refletem com mais precisão a população in vivo permite estudos de coordenação celular-célula em tecidos complexos24,25,26. A maioria dos HSEs incluem apenas fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos27,embora o ambiente de pele in vivo inclua muitos outros tipos de células. Estudos recentes começaram a incluir mais populações de células; estas incluem células endoteliais na vasculatura10,28,29,30,31,32,33,34, adipócitos em tecido subcoojoano35,36, componentes nervosos19,21, células-tronco27,37,38, células imunes10,39,40,41,42, e outros modelos específicos da doença/câncer16,40,43,44,45,46,47. Particularmente importante entre eles é a vasculatura; enquanto algumas HSEs incluem células vasculares, no geral elas ainda carecem de elementos capilares abrangentes com conectividade em toda a derme10,29 , estabilidade in vitro estendida28e densidade adequada do vaso. Além disso, os modelos de HSE são tipicamente avaliados através de seção histológica pós-cultura que limita a análise da estrutura tridimensional das HSEs. A análise tridimensional permite a avaliação volumosa da densidade vascular48,49, bem como variação regional da espessura e diferenciação epidérmica.
Embora os HSEs sejam um dos modelos organotípicos mais comuns, existem muitos desafios técnicos na geração desses construtos, incluindo identificação de matriz extracelular apropriada e densidades celulares, receitas de mídia, procedimentos adequados de interface líquida de ar e análise pós-cultura. Além disso, embora os modelos HEE e HSE tenham publicado protocolos, um protocolo detalhado incorporando vasculatura dérmica e imagem volutiva em vez de análise histológica não existe. Este trabalho apresenta um protocolo acessível para a cultura de equivalentes vascularizados de pele humana (VHSE) a partir principalmente de linhas celulares comerciais. Este protocolo é escrito para ser facilmente personalizável, permitindo uma adaptação direta a diferentes tipos de células e necessidades de pesquisa. No interesse da acessibilidade, disponibilidade e custo, o uso de produtos simples e técnicas de geração foi priorizado sobre o uso de produtos disponíveis comercialmente. Além disso, são descritos métodos de imagem volutrica e quantificação volumosas simples que permitem a avaliação da estrutura tridimensional do VHSE. Traduzir esse procedimento em um protocolo robusto e acessível permite que pesquisadores não especialistas apliquem esses modelos importantes em medicina personalizada, engenharia de tecidos vascularizados, desenvolvimento de enxertos e avaliação de medicamentos.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(Diluído do estoque de laboratório)</td></tr> <tr><td>4% Paraformaldeído</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lote # B0143461</td><td>Feito com Paraformaldeído sólido em PBS, pH ajustado para 6.9</td></tr><tr><td>Pinça autoclavada</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 pinça</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>Cat # BP510-250, Lote # 190231</td><td>Rnase, Dnase, linha celular livre de protease</td></tr><tr><td>, endotelial: Célula endotelial microvascular (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Célula endotelial microvascular imortalizada. Ressalta-se que foram utilizadas 750.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Linha celular, fibroblastos: fibroblasto humano dérmico, adulto</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Células dérmicas primárias. Ressalta-se que foram utilizadas 75.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Linhagem celular, fibroblastos: firbroblasto de pulmão humano (IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Células embrionárias primárias. Ressalta-se que foram utilizadas 75.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Linhagem celular, queratinócitos: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>Imortalizado via expressão de hTERT. O N/TERT-1 foi confeccionado utilizando um vetor retroviral que confere resistência à higromicina. Linha celular estabelecida por Dickson et al. 2000. Pode ser substituído por ATCC PCS-200-010 ou PCS-200-011. Observe que 170.000 células foram usadas por construto; As células N/TERT1 devem ser usadas a partir de placas que são 30% confluentes - duas placas de cultura de tecidos de 90 mm 30% confluentes fornecem células mais do que suficientes. Os autores agradecem ao Dr. Jim Rheinwald e à Dra. Ellen H. van den Bogaard por seu generoso presente de linhagens de células N / TERT.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td><td></td> <td>(equipamento de laboratório padrão)</td></tr> <tr><td>Software Computacional</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica TCS SPEII confocal</td><td></td><td>Varredura a laser confocal. Pode ser substituído por outros confocais ou microscopia de deconvolução.</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0.13-0.17 mm No.1 Espessura</td></tr><tr><td>Cianoacrilato super cola ou graxa de silicone</td><td>Cola Masters</td><td>#THI0102</td><td>Cola Mestres, GROSSA, Cola Instantânea, Cianoacrilato; super cola é preferida</td></tr><tr><td>Base de mídia DMEM</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM; Lote # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Modificação de Dulbecco do Meio de Eagle) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV; Lote # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. De Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) com L-glutamina</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(reagente de laboratório padrão)</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lote # AE29451050</td><td>Soro Fetal Bovino de Grau de Pesquisa, Triplo 0.1 um estéril filtrado</td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 fórceps</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico Humano (FEG)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lote # 0318AFC05 D0218</td><td>Composto em 0,1% BSA em</td></tr><tr><td>PBS Hidrocortisona</td><td>Alpha Easar</td><td>Lote # 5002F2A</td><td>composto em</td></tr><tr><td>DMSO Insulina (humana)</td><td>Peprotech</td><td>Lote # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Contraste de Fase/Luz Invertida</td><td>VWR</td><td>76317-470</td>(<td>equipamento de laboratório padrão)</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>Cloridrato de DL-isoproterenol, 98%</td></tr> <tr><td>Keratinocyte-SFM (1x) base de mídia</td><td>Gibco; Corporação de Tecnologias de Vida</td><td>REF #: 10724-011; Lote # 2085518</td><td>Keratinocyte-SFM (1X); meio livre de soro</td></tr><tr><td>L-Ascórbico Acid</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lote # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>Cristalino. O ácido L-ascórbico também pode ser comprado como sal</td></tr><tr><td>L-glutamina (sólida)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOTE # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-Glutamina, cristais brancos ou pó cristalino</td></tr><tr><td>MCDB 131 base de mídia</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lote # 03062021</td><td>MCDB 131 Base Média, Sem L-Glutamina, perfuradores de metal filtrados estéreis</td></tr><tr><td></td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Conjunto de Punção de Couro Oco, Aço Carbono de Alta Qualidade, Dureza: 48HRC; (vários tamanhos, incluindo): 1/8 ", 5/32", 3/16 ", 7/32 ", 1/4", 9/32 ", 5/16 ", 3/4 ", 7/16 ", 1/2 ", 5/8 :, 3/4 ". Este conjunto de punção é útil, mas a faca x-acto também pode funcionar. O tamanho do punção de metal que funciona bem para VHSE de 12 poços transwell é de 3/8 "ou 1/2".</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td> <td>(opcional). Para limpar a etapa de desidratação.</td></tr><tr><td>Salicilato de metila</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500; Lote # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(opcional). Para compensação.</td></tr><tr><td>Microtubos, 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td><td>Cat # 24-282; Lote # 19467</td><td>Microtubos de 1,7 ml, Transparentes; À prova de fervura, polipropileno, Rnase certificado, Dnase, DNA, inibidor de PCR e PBS livre de endotoxinas</td></tr><tr><td>, 10x grau de cultura ou autoclavado</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>Cat # 20-134, Lote # 202237</td><td>Tampão PBS, 10x Dry Pack; adicione o conteúdo da embalagem ao recipiente e adicione água a 1 litro para produzir 10x concentrado.</td></tr><tr><td>PBS, 1x Grau de cultura, (-) Cálcio, (-) magnésio</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Lote # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>produtos APEX Bioresearch</td> de grau não cultural <td>Cat # 20-134, Lote # 202237</td><td>PBS Buffer, 10x Dry Pack; adicione o conteúdo da embalagem ao recipiente e adicione água a 1 litro para produzir 10x concentrado. Dilua para 1x com água.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Lote # 2199839</td><td>Estreptococos para caneta (10.000 unidades/mL de penicilina; 10.000 ug/mL de estreptomicina)</td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidro, pequeno</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(opcional). Para ser usado como um recipiente de limpeza</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Use para fazer PDMS.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td> <td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Lote # H04719H035</td><td>Base de elastômero de silicone Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Lote # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Agente de Cura de Elastômero de Silicone</td></tr><tr><td colspan="4">nota: O PDMS é geralmente vendido como um kit que inclui os componentes da base e do agente de cura.</td></tr><tr><td>Pipetas de Deslocamento Positivo (1000 e 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL:</td><td>T12269L capacidade da pipeta M1000 (100-1000 uL); Capacidade da pipeta M250 até 250 uL</td></tr><tr><td>Pontas/pistões de deslocamento positivo (1000 e 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: CAT # F148180, LOTE # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, LOTE # B05549718S</td><td>Capilares e pistões esterilizados</td></tr><tr><td>Escópula</td><td></td><td></td> de ponta redonda <td>(opcional; equipamento de laboratório padrão) Para manipulação de VHSEs antes da imagem</td></tr><tr><td>Suplementos para meios</td> <td>de Keratinocyte-SFMGibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 37000-015, Lote # 2154180</td><td>Contém EGF Recombinante Humano (Cat # 10450-013), Extrato de Pituitária Bovina (Cat # 13028-014)</td></tr><tr><td>Inserções de Placa de Cultura de Tecidos, tamanho de 12 poços, 3 &micro; tamanho de poro m</td><td>Corning; Costar</td><td>REF # 3462 - Transparente; Lote # 14919057</td><td>Transwell; Inserções de 12 mm de diâmetro, tamanho de poro de 3,0 um, tratadas para cultura de tecidos, membrana de poliéster, placas de poliestireno,&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Tecidos, 12 tamanhos de poços</td><td>Greiner Bio-one; CellStar</td><td>Cat # 665 180; Lote # E18103QT</td><td>placa de cultura de células de 12 poços; estéril, com tampa; os produtos são estéreis, livres de Dnase, Rnase, DNA humano e pirogênios detectáveis. Conteúdo placas de cultura de tecidos não citotóxicas</td></tr><tr><td>, área de crescimento de 60,8 cm ^ 2</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202; Lote nº: 191218-177B</td><td>Placas de cultura de tecidos; tratadas, área de crescimento 60,8 cm ^ 2; estéril, Dnase, Rnase, Livre de pirogênio; poliestireno virgem</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lote # 4708R34</td><td>Agente umectante</td></tr><tr><td>Tripsina 0,25%</td> <td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] bicarbonato de sódio</td></tr><tr><td>Tipo 1 Colágeno isolado da cauda de rato</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>As caudas de rato Sprauge-Dawley podem ser compradas congeladas da Pel-Freez ou de outros fornecedores. O colágeno pode ser isolado dos tendões da cauda. Referências do protocolo de isolamento [Cross et al., 2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958]. Alternativamente, colágeno de cauda de rato de alta concentração pode ser adquirido de fornecedores, incluindo Corning (número de catálogo: 354249)</td></tr> <tr><td>Câmara de vácuo, bancada</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(equipamento de laboratório padrão)</td></tr> <tr><td>Faca de precisão portátil</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(faca X-Acto opcional se comprado punções de aço)</td></tr></tbody></table>

geração de equivalentes de pele humana vascularizada auto-montado

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Os equivalentes de pele humana (HSEs) são construções de tecido projetados que modelam componentes epidérmicos e dérmicos da pele humana. Esses modelos têm sido usados para estudar o desenvolvimento da pele, a cicatrização de feridas e técnicas de enxerto. Muitas HSEs continuam sem vasculatura e são ainda analisadas por meio de seção histológica pós-cultura que limita a avaliação volumosa da estrutura. Apresentado aqui é um protocolo simples utilizando materiais acessíveis para gerar equivalentes vascularizados de pele humana (VHSE); descritas ainda são técnicas volumosas de imagem e quantificação desses construtos. Resumidamente, os VHSEs são construídos em 12 inserções de cultura de poços nas quais células dérmicas e epidérmicas são semeadas em colágeno de cauda de rato tipo I gel. O compartimento dérmico é composto de fibroblasto e células endoteliais dispersas ao longo do gel de colágeno. O compartimento epidérmico é composto de queratinócitos (células epiteliais da pele) que se diferenciam na interface ar-líquido. É importante ressaltar que esses métodos são personalizáveis com base nas necessidades do pesquisador, com resultados demonstrando a geração de VHSE com dois tipos diferentes de células fibroblastos: fibroblastos dérmicos humanos (hDF) e fibroblastos pulmonares humanos (IMR90s). As VHSEs foram desenvolvidas, imagens por meio de microscopia confocal e analisadas volumétricamente usando software computacional em pontos de tempo de 4 e 8 semanas. Um processo otimizado para corrigir, manchar, imagem e VHSEs claras para exame volumoso é descrito. Este modelo abrangente, técnicas de imagem e análise são facilmente personalizáveis às necessidades específicas de pesquisa de laboratórios individuais com ou sem experiência prévia de HSE.

O objetivo deste protocolo é descrever a geração e a análise volumosa de equivalentes vascularizados da pele humana utilizando técnicas acessíveis e simples para a cultura de longo prazo. Na medida do possível, a lógica das etapas é descrita para permitir aos pesquisadores a capacidade de personalizar com base em suas necessidades de pesquisa.

Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

O detalhe fornecido neste protocolo, aborda a geração equivalente da pele humana, que muitas vezes é tecnicamente desafiadora. Novos elementos de protocolo equivalentes à pele humana, como vasculatura e imagem volumosa estão incluídos. A técnica permite a construção direta de um modelo de pele que combina mais de perto o tecido in vivo para o estudo de doenças, envelhecimento e medicina personalizada.A parte mais desafiadora deste protocolo é uma transição entre submersão e interface ar-líquido. Provavelmente serão necessários alguns testes para otimizar o tempo e os níveis de mídia para resultados consistentes. Para começar, adicione 516 microliters de mídia a um tubo de tampa fria, e adicione imediatamente 375 microliters de colágeno frio usando a pipeta de deslocamento positivo de 1000 microliteres.Remova a ponta de pipeta vazia e mude para a pipeta de deslocamento positiva preparada de 250 microliter para misturar. Misture rapidamente, mas suavemente para evitar o excesso de formação de bolhas. Mantendo a ponta na solução, misture uniformemente de diferentes posições do tubo até que a solução seja de cor homogênea, que normalmente leva cerca de cinco ciclos de pipeta ou 10 segundos.Disperse imediatamente 125 microliters de colágeno acelular na membrana da inserção de cultura de 12 poços. Para garantir a cobertura uniforme, incline a placa e use a ponta da pipeta para pintar a membrana, espalhando suavemente o colágeno ao redor. Mova imediatamente a placa de 12 poços para uma incubadora de cultura celular Celsius de 37 graus para deixá-la gel por pelo menos 20 minutos.Após o período de gelação, tire a placa de 12 poços de colágeno acelular da incubadora. Retire o tubo tampado de 1,7 mililitro do gelo molhado e, em seguida, remova o colágeno de estoque da refrigeração e coloque-o em gelo molhado com a tampa aberta. Adicione 516 microliters de suspensão celular resfriada ao tubo tampado frio.Use a pipeta de 1000 microliteres para imediatamente pipeta 375 microliters de solução de colágeno frio diretamente na solução dentro do tubo tampado. Expulse todo o colágeno da pipeta para dentro do tubo e descarte a ponta de pipeta de deslocamento positiva. Mude imediatamente para a pipeta de 250 microliteres e misture a solução de colágeno Uma vez misturado, transfira 250 microliters de solução de colágeno celular para o colágeno acelular suporta na inserção de cultura de 12 poços, em seguida, mova a placa de 12 poços para uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius.Após o tempo de gel de 30 minutos, incline suavemente a placa para avaliar a gelação e certifique-se de que o colágeno se solidificou. Adicione 500 microliters e 1000 microliters de mídia de mistura à câmara superior e câmara inferior da inserção, respectivamente. Certifique-se de que o gel de colágeno está submerso, adicionando mais mídia, se necessário.Coloque a placa do poço na incubadora de cultura celular para incubação durante a noite. No sétimo dia de submersão, use uma pipeta manual para coletar e descartar mídia da câmara inferior e superior de cada poço de construção. Para coletar a mídia presa diretamente sob a membrana permeável, coloque a ponta da pipeta sob a membrana, derrubando a inserção do lugar temporariamente.Adicione um mililitro de pele humana equivalente ou mídia HSE complementada com 5% FPS à câmara inferior de cada poço e 200 microliters de suspensão celular à câmara superior de cada poço. Semente os queratinócitos diretamente na superfície de construção dérmica e permita que eles se acomodem por duas horas na incubadora. Duas horas após a semeadura dos queratinócitos, adicione cuidadosamente 300 microliters de mídia HSE, complementados com 5%FPS na câmara superior de cada poço de construção.Depois de carregar a mídia, coloque a construção de volta na incubadora. Usando uma pipeta manual, levante cada construção para sua interface ar-líquido, ou ALI, removendo resíduos de mídia apenas da câmara superior. Tente chegar o mais perto possível da camada epidérmica sem tocá-la ou danificá-la.Incline as placas ligeiramente em diferentes ângulos para coletar a mídia, em seguida, adicione aproximadamente dois mililitros de água estéril aos poços circundantes na placa para manter a umidade consistente. Verifique a placa algumas horas depois para ter certeza de que os queratinócitos ainda estão no ALI. Remova qualquer mídia na câmara superior, acompanhando a quantidade de mídia removida de cada poço.As camadas epidérmicas devem parecer hidratadas, não secas, mas não deve haver mídia agrupada em cima da construção. Para preparar a construção para coloração imunofluorescente, vire uma inserção de cabeça para baixo e coloque-a sobre seu poço na placa do poço. Estabilize a inserção com uma mão enquanto usa fórceps finos ou uma faca de precisão para cortar cerca de metade da circunferência da membrana.Corte o mais perto possível da caixa de plástico. Usando os fórceps finos da ponta, pegue a borda do retalho da membrana cortada e retire delicadamente a membrana porosa da inserção, bem como a construção VHSE. Se a construção ficar presa na lateral da câmara, use os fórceps finos ou uma pequena scoopula para movê-la para o poço.Uma vez que o VHSE esteja no poço, descarte quaisquer pedaços restantes da membrana de inserção e mantenha a carcaça de inserção de cultura em cada poço para manter os VHSEs em uma posição submersa durante a coloração. Dois dias antes da imagem, prepare polidimtilsiloxano ou PDMS. Coloque qualquer recipiente de mistura limpo em um equilíbrio de pesagem e coloque a balança.Adicione a base e adicione o crosslinker. Mexa a solução vigorosamente por pelo menos quatro minutos, criando pequenas bolhas. Depois de misturar o suficiente, despeje o PDMS em uma placa de Petri de 90 ou 100 milímetros.Degas o PDMS em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas desapareçam e o PDMS esteja limpo. Solte o vácuo lentamente e remova o PDMS. Coloque o prato em um forno para curar durante a noite a 50 a 60 graus Celsius, certificando-se de que o prato está sentado plano para PDMS curar uniformemente.Um dia antes da imagem, use um soco de aço ou uma faca de precisão portátil para perfurar ou cortar um poço circular da folha PDMS, em torno do mesmo tamanho da construção VHSE. Corte um patch quadrado ao redor do poço circular para criar um único PDMS bem. Usando um deslizamento de tampa de vidro de tamanho semelhante ao do PDMS adicione cola cianoacrilato à superfície inferior do PDMS e esfregue uniformemente com uma ponta de pipeta descartável.Centralizar o vidro e pressioná-lo para o PDMS bem, deixando uma janela de vidro transparente dentro do círculo perfurado. Deixe a cola secar durante a noite antes de usar. A caracterização da epiderme e da derme mostram marcadores imunofluorescentes apropriados para a pele humana nas construções VHSE.Cytokeratin 10 é um marcador de queratinócito de diferenciação precoce que geralmente marca todas as camadas suprabásiais em equivalentes de pele. Involucrina e filaggrina são marcadores de diferenciação tardia em queratinócitos e marcam as camadas mais suprabásas mais altas em equivalentes de pele. A limpeza do VHSE permitiu uma imagem simples em uma configuração e eliminou a necessidade de reorientar a construção para imagem da derme e epiderme separadamente.Imagens volumosas possibilitam gerar renderizações 3D para mapear vasculatura em cada construção. Pilhas de imagens foram carregadas em software computacional e um algoritmo personalizado foi usado para renderização e quantificação 3D. A esqueletização determinou o centro definitivo de cada vaso marcado por colágeno IV e os dados resultantes foram utilizados para calcular o diâmetro do vaso, bem como a fração vascular.Após esse procedimento, métodos de caracterização como análise de barreiras, microscopia eletrônica de varredura, perfis lipídeis e outros podem ser realizados para entender como a vasculatura afeta especificamente a maturação e estabilidade epidérmica. Este protocolo permite estudos específicos do tecido e do tipo celular em um modelo de pele vascularizada. É particularmente adequado para pesquisas em envelhecimento e medicina personalizada.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Geração de Equivalentes de Pele Humana Vascularizada Auto-montado

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