Colorindo, Visualização e Análise de Papilas de Fungos, Circunvalolados e Paladar
11 de fevereiro de 2021
Este artigo descreve métodos para preparação de tecidos, coloração e análise de papilas gustativas de fungos, circunvallato e paladar inteiros que produzem consistentemente papilas gustativas inteiras e intactas (incluindo as fibras nervosas que os inervam) e mantêm as relações entre estruturas dentro das papilas gustativas e a papila circundante.
Este fluxo de trabalho de dissecção e análise de todo o montagem fornece uma nova abordagem para analisar a morfologia completa das arboris nervosas de paladar individuais, transduzindo números do tipo celular e as relações físicas entre as células. Coletar todo o epitélio lingual nos permite medir o número absoluto de células e o volume de inervação dentro de toda a papila gustativa. Essa abordagem é mais precisa do que as estimativas da estrutura celular com base na amostragem de seções, o que reduz a variabilidade técnica.
Este também é o primeiro método que fornece análise detalhada das células gustativas em relação à sua inervação. Esse método pode aprimorar investigações sobre os circuitos potenciais dentro da papila gustativa, bem como processos de doenças e quimioterápicos que interrompem a função normal do sabor. Na maioria desses casos, não está claro qual estrutura ou relacionamento é interrompido, então manter todos esses fatores intactos permite todas as análises dentro de uma única preparação.
O erro mais comum é tentar evitar danificar o epitélio por não dissecar perto o suficiente da parte inferior do epitélio. É imperativo remover o máximo de tecido subjacente possível antes de congelar o tecido no molde do tecido. Também é importante garantir que o epitélio esteja na parte inferior do molde do tecido.
Comece descongelando e enxaguando a língua em 0,1 tampão molar fosfato. Em seguida, coloque 1/2 da língua anterior contendo as papilas fungiformes em um deslizamento de vidro sob um microscópio dissecando. Use fórceps e tesouras de dissecção para remover o músculo e mantenha o tecido aberto à medida que o epitélio lingual é curvo, garantindo uma orientação plana do tecido mantendo as lâminas da tesoura de dissecção grosseira paralela à epitélio.
Descarte o epitélio ventral não queratinizado da língua, pois não contém papilas gustativas. Em seguida, use uma tesoura de dissecção fina para dissecção mais próxima à parte inferior do epitélio queratinizado. Use fórceps sem corte para colocar um pedaço de epitélio em um molde de tecido e garantir que ele se deite plano.
Em seguida, adicione uma gota de composto de temperatura de corte ideal, ou OCT, ao tecido. Coloque o molde de tecido em uma base metálica previamente resfriada sob o escopo de dissecação, em seguida, continue a tocar o tecido levemente com os fórceps até que o OCT tenha congelado, garantindo que o tecido congele o mais plano possível. Uma vez que o OCT tenha congelado, adicione rapidamente oct adicional e coloque o molde em um béquer de 2-metilbutano resfriado até congelar.
Monte o molde OCT no criostat e corte-o em seções de 20 mícrons. Colete cada seção e visualize-a sob o microscópio de luz para avaliar sua proximidade com a base do epitélio. Depois que o tecido for raspado da parte inferior do epitélio, descongele o epitélio e enxágue-o duas vezes em 0,1 pb molar em um agitador.
Corte o paladar duro anterior à junção do paladar macio e duro, em seguida, separe o paladar macio do tecido subjacente, certificando-se de que quaisquer fragmentos ósseos restantes sejam cortados e removendo músculos adicionais e tecido conjuntivo. Segure o paladar com fórceps sem corte e remova as glândulas restantes e perca tecido conjuntivo raspando-os suavemente com uma lâmina de barbear. Botões de paladar inteiros e toda a inervação do paladar em camundongos Phox2b-Cre TdTomato foram rotulados pela coloração do epitélio lingual com anticorpos para DsRed e queratina oito.
O volume da papila gustativa foi medido e não revelou correlações entre volumes de paladar e volumes de inervação nas regiões de medição de fungos ou circunvalladas. A administração de uma baixa dose de tamoxifen em camundongos TrkB CreER TdTomato causa recombinação genética e rotulagem de um pequeno número de neurônios. Uma papila gustativa de montagem inteira manchada com marcadores celulares transdutores de sabor, anidrato 4 e fosfolipase C beta dois é mostrado aqui.
Esta papila gustativa tem duas arbors terminais rotuladas, que são mostradas com a papila gustativa removida após a reconstrução das fibras. O uso de um software de imagem baseado em pixels celulares para determinar a proximidade mais próxima entre fibras nervosas e células transdutoras de sabor revelou que de 19 células transdutoras de sabor, a árvore terminal azul estava dentro de 200 nanômetros da anidrádrada carbonoica azul clara quatro mais células. A árvore terminal associada ao rastreamento verde é mostrada em magenta e está dentro de 200 nanômetros da anidrádrada carbonoica azul clara e escura quatro células.
A queratina de montagem total oito e 5-ethynyl-2'deoxyuridina ou a coloração da EdU de papilas gustativas fungiformes revelaram que as células rotuladas pela EdU estavam presentes dentro e fora das papilas gustativas. Os núcleos magenta e roxo são observados fora da queratina oito mais borda da papila gustativa. As células amarelas, teal e azul estavam dentro da papila.
Ao tentar este protocolo, a dissecção tecidual e as etapas de congelamento são cruciais. Esses métodos de dissecção tecidual podem ser seguidos pela coloração de uma variedade de células e estruturas para analisar as relações dentro da papila gustativa e fora da papila gustativa, mas dentro da papila. Esta é a primeira análise de arbors de gosto inteiro dentro da papila gustativa, bem como suas relações com células transdutoras de sabor.
A preservação e a coloração de vários desses elementos em uma única preparação ampliam as possibilidades de análise e refinam as medidas possíveis.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método inovador para a dissecação e análise em montagem inteira de botões gustativos, especificamente botões gustativos fungiformes, circunvalados e do palato, preservando suas estruturas e inervações. A técnica permite medições precisas do número de células e dos volumes de inervação, aprimorando nosso entendimento da circuitaria dos botões gustativos e dos efeitos de doenças na função gustativa.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia de Sistemas
Contexto
- A análise completa das papilas gustativas fornece informações sobre sua morfologia e circuitaria funcional.
- As metodologias existentes frequentemente apresentam alta variabilidade devido à amostragem.
- Compreender a função gustativa é essencial em pesquisas relacionadas a distúrbios do paladar.
- Este estudo tem como objetivo definir a estrutura completa das papilas gustativas em relação à sua inervação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a dissecação e análise de botões gustativos intactos.
- Investigar as relações entre as células dos botões gustativos e suas fibras nervosas inervantes.
- Destacar as implicações dessa pesquisa para a compreensão da circuitaria envolvida na sensação do gosto.
Métodos Utilizados
- Este estudo utiliza uma técnica de dissecação em montagem inteira para papilas gustativas da língua.
- O modelo biológico inclui papilas gustativas de camundongos Phox2b-Cre TdTomato e TrkB CreER TdTomato.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica foi utilizado neste estudo.
- Os passos críticos incluem a dissecação cuidadosa e o congelamento adequado do tecido.
- Em seguida, as amostras foram analisadas utilizando técnicas de coloração para visualizar diferentes tipos celulares.
Resultados Principais
- A técnica preservou e corou com sucesso as papilas gustativas intactas, revelando sua arquitetura celular.
- As medições não mostraram correlações entre os volumes das papilas gustativas e os volumes de inervação.
- A imagem baseada em pixels celulares demonstrou proximidade entre as fibras nervosas e as células transdutoras do sabor.
- A marcação com EdU indicou proliferação celular dentro e fora do limite das papilas gustativas.
Conclusões
- O estudo apresenta um protocolo inovador para analisar botões gustativos, o que pode auxiliar em pesquisas futuras.
- Embora a análise multiômica não tenha sido incluída, os achados ampliam nossa compreensão sobre a função dos botões gustativos.
- Este método permite um exame detalhado das relações celulares, o que é valioso para investigar distúrbios do paladar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise em preparação inteira de botões gustativos permite a quantificação precisa de parâmetros celulares e de inervação, reduzindo a variabilidade técnica inerente a abordagens baseadas em cortes histológicos. Este método apoia a desmistificação mecanicista em neurociência e biologia sensorial, preservando as relações espaciais entre células transdutoras e fibras nervosas. Ele fornece uma plataforma reprodutível para avaliar a função quimiossensorial em modelos de doenças e estudos de intervenção terapêutica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de transdução do paladar por meio da contagem absoluta de células e mapeamento espacial de terminais nervosos.
- Valor Operacional: Reduz viés e variabilidade ao preservar a arquitetura intacta das papilas gustativas para análise reprodutível.
- Valor Preditivo: Apoia a confiança no alvo ao associar marcadores moleculares a padrões funcionais de inervação in situ.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas, como volume das papilas gustativas, volume da inervação e contagem de células transdutoras, para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Facilita fluxos de trabalho de imagem de alta fidelidade, compatíveis com coloração múltipla e análise automatizada de imagens.
- Prontidão do Ensaio: Fornece um sistema escalonável para triagem de compostos que afetam a integridade das papilas gustativas ou a conectividade neural.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a análise de alterações induzidas por doenças ou terapias nas relações entre botões gustativos e nervos, utilizando modelos com marcação genética.
- Valor Operacional: Possibilita estudos longitudinais ao permitir colorações e imagens repetidas de preparações inteiras a partir do mesmo tecido.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica ao preservar a arquitetura nativa do tecido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia descritiva ao permitir testes de hipóteses sobre mecanismos de sensação gustativa e conectividade neural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação funcional de tipos celulares transdutores do paladar por meio de análise de co-localização espacial.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis essenciais para triagem de compostos em pesquisas de quimiossensores.
- Análises: Utiliza imagem baseada em pixels celulares para medir distâncias subcelulares entre fibras nervosas e receptores gustativos, permitindo comparações baseadas em dados.
- Pesquisa Translacional: Mantém a integridade estrutural para o estudo de disfunções do paladar em modelos de quimioterapia, envelhecimento ou distúrbios genéticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado de preparação de tecidos aplicável a diversas regiões gustativas e modelos de camundongos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao eliminar artefatos de amostragem e permitir a observação direta das interações entre células e nervos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de dissecação, congelamento e coloração.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento de fármacos sensoriais ao fornecer subsídios mecanicistas sobre o engajamento do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos na estrutura das papilas gustativas e na inervação.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação microcirúrgica e manipulação de tecidos para preservar a integridade epitelial.
- Depende da infraestrutura de crioestato e inclusão em OCT para orientação adequada do tecido e congelamento.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos consistentes de montagem e coloração de tecidos.
- Deve levar em conta a variabilidade na densidade e no tamanho das papilas gustativas nas regiões fungiforme, circunvalada e palatina.
- Limitado pela necessidade de ferramentas especializadas de imagem e análise para reconstruir arborizações nervosas e quantificar a proximidade subcelular.
