Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Esta técnica é uma adaptação de métodos comumente utilizados para examinar a liberação de monoamina, permitindo a medição da liberação endógena em vez de monoaminas radiolabeled pré-carregadas em múltiplas condições farmacológicas ao mesmo tempo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é bastante econômica, múltiplas condições farmacológicas podem ser examinadas de uma só vez, e podemos estudar a liberação endógena da monoamina com a capacidade de distinguir entre a liberação mediada vesicular e transportadora. Para preparar fatias cerebrais de ratos machos adultos de 250 a 350 gramas após a colheita, imediatamente coloquei o tampão de dissecção oxigenada do cérebro e do gelo, e adquiriu 300 seções cerebrais coronais de 300 mícrons de cada região de interesse.

Para maior dissecção das fatias cerebrais, mova cuidadosamente os tecidos para lâminas de vidro e use um atlas cerebral de rato para identificar o estriado dorsal baseado em sua estrutura estriada escura, e identificar o hipocampo com base em sua proximidade com o córtex e sua estrutura espiral única. Separe os hemisférios direito e esquerdo para seu uso como controle e fatias experimentais. O estriado dorsal pode ser ainda dissecado em socos de dois milímetros.

Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico com uma ponta modificada para transferir as amostras para pequenos recipientes imersos em tampão de dissecção gelada oxigenado com borbulhante de oxigênio. Para induzir a liberação de monoamina, transfira as amostras de tecido para cada poço de uma câmara efflux feita sob medida contendo 0,5 a um mililitro de tampão efflux por poço com borbulhamento suave constante e permita que as amostras se recuperem por 30 a 50 minutos a 37 graus Celsius. Ao final do período de equilíbrio, mova o suporte tecidual com tecido cerebral para poços contendo 500 microliters de tampão efflux oxigenado com ou sem agente farmacológico, tocando o suporte na borda do poço para evitar a transferência mínima de tampão entre poços para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, mova o suporte para um novo conjunto de poços contendo 500 microliters de tampão efflux com ou sem a droga de interesse e devolva a placa à incubadora de cultura celular por mais 20 minutos. Durante a segunda incubação, transfira a solução dos poços da primeira incubação para tubos de microcentrifuge contendo 50 microliters de um polclorórico normal ou ácido fosfórico no gelo, e rotular os tubos número um”No final da segunda incubação, mova o suporte de tecido para poços vazios com a placa no gelo e transfira os supernaentes da segunda incubação para novos tubos de microcentrifuuge contendo 50 microlitradores de um polemizador normal ou fosfórico ácido no gelo. Rotule esses tubos número dois”Quando todos os supernantes forem transferidos, adicione um mililitro de tampão de dissecção gelada a cada poço de tecido e use pinças pequenas para transferir cada amostra de tecido para um novo tubo de microcentrifusagem.

Remova o tampão dos tubos de amostra e armazene os tecidos a menos 80 graus Celsius, depois transfira as soluções de incubação coletadas em tubos de filtro de microcentrifusagem para centrifugação e coloque o filtrado no gelo até a análise do HPLC. Defina o potencial da ECD e a taxa de fluxo à recomendação do fabricante para detectar monoaminas. Carregar e alíquota apropriada de cada amostra, incluindo padrões neurotransmissores no HPLC para injeção e detecção automática e permitir que o instrumento complete a análise.

Em seguida, use o software de análise HPLC para adquirir e analisar os dados do cromatógrafo usando uma curva padrão composta por cada monoamina para obter a área sob a curva com base nas diretrizes do fabricante. Após seis horas de análise funcional, as amostras de tecido permanecem viáveis, enquanto amostras incubadas com 1%Triton X-100 demonstram uma redução significativa na transformação de MTT. Tratamento agudo de 20 minutos de seções cerebrais hipocampais e pré-frontais com anfetamina induz um aumento significativo no nível extracelular de cada monoamina.

Quando as amostras são pré-tratadas com fluoxetina, um inibidor seletivo de recaptação de serotonina, o aumento induzido pela anfetamina na serotonina extracelular dentro do hipocampo e no córtex pré-frontal não ocorre, enquanto o aumento da produção extracelular de dopamina e norepinefrina não é afetado. Além disso, o tratamento agudo de 20 minutos de socos dorsais com anfetamina induz um aumento de 35 vezes na expressão de nível de dopamina extracelular, enquanto o tratamento de perfuração de estriatum dorsal com cocaína, um bloqueador de transporte de monoamina, resulta em uma inibição significativa da dopamina extracelular induzida por anfetamina. Aumentar a concentração de cloreto de potássio extracelular para evocar a despolarização da membrana é suficiente para induzir a liberação exototótica de monoaminas em comparação com condições de controle não tratadas, e nem fluoxetina nem tratamento de cocaína bloqueiam esse aumento induzido por polarização profunda.

É imperativo ter seções de corte limpo, uma localização precisa de socos, e manter a oxigenação consistente durante todo o experimento. As seções cerebrais podem ser usadas pós-experimentação para posterior processamento e análise bioquímica, como mancha ocidental e histologia.