Name: Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia da lisotripsia para trombose venosa profunda usando atividade de bolhas para aumentar a fibrinólise. Este método não invasivo combina histotripsia com drogas líticas para dissolver coágulos sanguíneos.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Grant R01HL13334. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kevin Haworth por ajudar com o ensaio de Drabkin e o Dr. Viktor Bollen por seu apoio na concepção do protocolo. Os autores também agradecem ao Dr. Adam Maxwell por sua orientação sobre o projeto da fonte histotripsy.

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo proposto apresenta um modelo para quantificar a eficácia do tratamento da lysotripsy. Embora os detalhes-chave tenham sido discutidos, há certos aspectos críticos a serem considerados para o sucesso deste protocolo. A atividade enzimática do RT-PA tem uma dependência de temperatura de Arrhenius30. A temperatura também é um fator contribuinte para a velocidade do som na água e no tecido, e variações de temperatura podem causar pequenas alterações na geometria da zona focal. Assim, a tem...

Trombose é a condição de formação de coágulos em um vaso sanguíneo saudável que obstrui a circulação1,2. O tromboembolismo venoso tem um custo anual de saúde de US $ 7-10 bilhões, com 375.000-425.000 casos nos Estados Unidos3. Embolia pulmonar é a obstrução da artéria pulmonar e é a consequência mais grave do tromboembolismo venoso. A principal fonte de obstrução pulmonar é o trombo venoso profundo, principalmente dos segmentos venosos iliofemoral4,5,6. Trombose venosa profunda (DVT) tem sequelas inerentes além de obstruções pulmonares, com complicações de longo prazo que resultam em dor, inchaço, ulcerações nas pernas e amputações de membros7,8,9. Para obstruções críticas, o cateter direcionado trombolítico (CDT) é a abordagem de linha de frente para a recanalização do vaso10. O resultado do CDT depende de uma série de fatores, incluindo idade do trombo, localização, tamanho, composição, etiologia e risco do paciente categoria11. Além disso, o CDT está associado a danos vasculares, infecções, complicações hemorrágicas e longo tempo de tratamento10. Os dispositivos de próxima geração visam combinar tromboctomia mecânica com trombolíticos (ou seja, trombioscaica farmacomecchanical)12,13. O uso desses dispositivos diminui a dosagem lítica levando a complicações hemorrágicos reduzidas, e encurtou o tempo de tratamento12,13,14 em comparação com o CDT. Estes dispositivos ainda mantêm problemas de efeitos colaterais hemorrágicos e remoção incompleta do trombo crônico15. Assim, é necessária uma estratégia adjuvante que pode remover o trombo completamente com complicações de sangramento mais baixos.
Uma abordagem potencial é o tratamento trombolítico auxiliado por histotripsy, chamado de lysotripsy. Histotripsy é uma modalidade de tratamento não invasiva que usa ultrassom focalizado para nuclear nuvens de bolhas nos tecidos16. A atividade bolha é gerada não através de núcleos exógenos, mas pela aplicação de pulsos de ultrassom com tensão suficiente para ativar núcleos intrínsecos aos tecidos, incluindo coágulo17,18. A oscilação mecânica da nuvem de bolhas transmite tensão ao coágulo, desintegrando a estrutura em detritos acelulares19. A atividade da bolha histotripsy proporciona uma degradação efetiva de coágulos sanguíneos retraídos e não retraídos tanto in vivo quanto in vitro20,21,22. Estudos anteriorestêm 23,24 demonstraram que a combinação de histotripsia e o ativador de plasminogen recombinante lítico (rt-PA) aumenta significativamente a eficácia do tratamento em comparação apenas com a lítico ou histotripsia. Acredita-se que dois mecanismos primários associados à atividade da bolha histotripsia são responsáveis pela melhor eficácia do tratamento: 1) aumento da fibrinolise devido ao aumento da isca e 2) hemólise dos glóbulos vermelhos dentro do coágulo. A maior parte da massa do coágulo é composta por glóbulos vermelhos24, e, portanto, o rastreamento da degradação do eritrócito é um bom substituto para a ablação da amostra. Outros elementos de coágulos formados também são provavelmente desintegrados sob atividade de bolhas histotripsy, mas não são considerados neste protocolo.
Aqui, uma abordagem de bancada para tratar DVT in vitro com lysotripsy é delineada. O protocolo descreve parâmetros operacionais críticos da fonte de histotripsia, avaliação da eficácia do tratamento e orientação de imagem. O protocolo inclui projetar um canal de fluxo para imitar um segmento venoso iliofemoral e fabricar coágulos sanguíneos inteiros humanos. O procedimento experimental descreve o posicionamento da fonte de histotripsia e da matriz de imagens para alcançar a exposição à histotripsia ao longo do coágulo colocado no canal de fluxo. São definidos parâmetros relevantes de insalação para atingir a interrupção do coágulo e minimizar a atividade da bolha fora do alvo. O uso de ultrassom para orientação e avaliação da atividade bolha é ilustrado24. Métricas para quantificar a eficácia do tratamento, como perda de massa de coágulos, D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) são delineadas23,24,25,26,27. No geral, o estudo fornece um meio eficaz para executar e avaliar a eficácia da lysotripsy para tratar DVT.

<table><tbody><tr><td>Folhas absorventes</td><td>Acústica de precisão</td><td>F28-SMALL-M</td><td>300mm x 300 mm x 10 mm</td></tr><tr><td>Borosilicato Pipetas de Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>14,6 cm de comprimento, capacidade de 2 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1,5 mL de capacidade</td></tr><tr><td>Ensaio de Drabkin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5941-6VL</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td> <td>de traçãoCole-Parmer</td><td>EW-07945-43</td><td>Capacidade de 60 mL</td></tr><tr><td>Sacos de filtro</td><td>McMaster-Carr</td><td>5162K111</td><td>Remova o tamanho das partículas de até 1 mícron</td></tr><tr><td>Tubulação de canal de fluxo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5154K25</td><td>Tubulação de plástico EVA revestida de polietileno (Diâmetro externo: 3/8", Diâmetro interno: 1/4"</td></tr><tr><td>Elementos de aquecimento</td><td>Won Brothers</td><td>HT 300 Titânio</td><td>Hastes de titânio colocadas no fundo do tanque</td></tr><tr><td>Matriz de imagem</td><td>Verasonics</td><td>L11-5v</td><td>128 elemento com sensibilidade de -55 a -49 dB</td></tr><tr><td>Baixa agarose gelificante</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Embarcação modelo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5234K98</td><td>6,6 cm de comprimento, 0,6 cm de diâmetro interno, 1 mm de espessura</td></tr><tr><td>Água nanopura</td><td>Barnstead</td><td>Nanopure Diamond</td><td>ASTM tipo I, resistividade de 18 Mohm-cm</td></tr><tr><td>Plasma</td><td>Vitalant</td><td>4PF000</td><td>Plasma congelado em 24 horas</td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Biotek</td><td>Synergy Neo HST Leitor de placas</td><td>Para quantificação de hemoglobina</td></tr><tr><td>Tampa da sonda</td><td>Civco</td><td>610-362</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de programação</td><td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, EUA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ativador de plasminogênio recombinante do tipo tecido (rt-PA)</td><td>Genentech</td><td>Activase</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07945-43</td><td>Capacidade de 60 mL</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74900-20</td><td>acoplada à seringa para puxar o fluxo no canal de fluxo a uma taxa de alimentação pré-determinada</td></tr><tr><td>Transdutor</td><td>personalizado</td><td></td> internamente <td>Transdutor de oito elementos, com foco elíptico (eixo maior de 9 cm, eixo menor de 7 cm e distância focal de 6 cm), alimentado por classe D projetada e construída sob medida amplificador e rede correspondente</td></tr><tr><td>Sistema de varredura de ultrassom</td><td>Verasonics</td><td></td><td>Vantage Research Sistema de ultrassom</td></tr><tr><td>Tanque de água</td><td>Acrílicos avançados</td><td>C133</td><td>14 x 14 x 12, 1/2"</td></tr></tbody></table>

um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

A trombose venosa profunda (DVT) é uma preocupação global para a saúde. A abordagem primária para alcançar a recanalização do vaso para obstruções críticas é a trombolíticos orientados pelo cateter (CDT). Para mitigar os efeitos colaterais cáusticos e o longo tempo de tratamento associado ao CDT, abordagens adjuvantes e alternativas estão em desenvolvimento. Uma dessas abordagens é a histotripsia, uma ultrassonografia focada para ablate tecido através da nucleação de nuvens de bolhas. Estudos pré-clínicos demonstraram forte sinergia entre histotripsia e trombolíticos para degradação do coágulo. Este relatório descreve um método de bancada para avaliar a eficácia da terapia trombolítico auxiliada em histotripsia, ou lysotripsy.
Coágulos fabricados a partir de sangue venoso humano fresco foram introduzidos em um canal de fluxo cujas dimensões e propriedades acousto-mecânicas imitam uma veia iliofemoral. O canal foi perfundido com plasma e o ativador de plasminogen recombinante lincático. Nuvens de bolha foram geradas no coágulo com uma fonte de ultrassom focada projetada para o tratamento de coágulos venosos femorais. Posicionadores motorizados foram usados para traduzir o foco de origem ao longo do comprimento do coágulo. Em cada local de inssonação, as emissões acústicas da nuvem bolha foram passivamente registradas e antenadas para gerar imagens de cavitação passiva. As métricas para medir a eficácia do tratamento incluíram perda de massa de coágulos (eficácia geral do tratamento), e as concentrações de D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) no perfusato. Há limitações para este design in vitro, incluindo a falta de meios para avaliar efeitos colaterais in vivo ou mudanças dinâmicas na taxa de fluxo à medida que o coágulo lise. No geral, a configuração fornece um método eficaz para avaliar a eficácia das estratégias baseadas em histotripsia para tratar DVT.

O protocolo descrito neste estudo destaca os detalhes da modelagem de coágulos venosos, da linsotripsia para interrupção do coágulo e da ultrassom em uma configuração in vitro de DVT. O procedimento adotado demonstra as etapas necessárias para avaliar a interrupção do coágulo devido aos efeitos combinados da atividade da nuvem de bolhas rt-PA e histotripsy. A configuração do bancada foi projetada para imitar as características de uma veia iliofemoral venosa. A Figura 1A mostra um vaso modelo...

A entrega de líticos auxiliados por histotripsy ou a lysotripsy está em desenvolvimento para o tratamento de trombose venosa profunda. Um procedimento in vitro é apresentado aqui para avaliar a eficácia desta terapia combinada. São discutidos protocolos-chave para o modelo de coágulo, orientação de imagem e avaliação da eficácia do tratamento.

Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Este protocolo fornece um método benchtop para avaliar a eficácia e os mecanismos de ação da histotripsia auxiliada terapia trombolítico ou lysotripsy, uma abordagem alternativa não invasiva para o tratamento da trombose venosa profunda crítica. Esta técnica usa a atividade bolha para ter um efeito bidirecionário através de uma fibrinólise aumentada devido a uma entrega lítica aprimorada e à hemólise dos glóbulos vermelhos dentro do coágulo. Essa abordagem de bancada para o tratamento da trombose venosa profunda facilita a modelagem de coágulos sanguíneos, tratamento com lise e imagem simultânea durante o tratamento.Geração de nuvens de bolhas, planejamento de tratamento e orientação de imagem podem ser usados para investigar tratamentos in vitro baseados em histotripsia de outras doenças, como tumores renais e hepáticos. Para configurar a fonte histotripsy, monte a fonte em um sistema de posicionamento motorizado. Cubra a matriz de imagens com uma tampa de sonda e fixe a matriz coaxialmente na abertura da fonte histotripsy.Conecte a matriz de imagens a um sistema de varredura de ultrassom e submerga completamente a fonte de histotripsy e a matriz de imagem no tanque. Use uma seringa para remover suavemente quaisquer bolhas de ar e use o conjunto de imagens e o scanner para adquirir imagens de água desgaseadas no modo B a 20 quadros por segundo. Ao adquirir as imagens, ajuste a posição do conjunto de imagens dentro da abertura do transdutor confocal até que a nuvem de bolha esteja localizada aproximadamente no centro da janela da imagem e registe a localização focal detectada na janela de imagem.Em seguida, descontinua a insssonação e defina a tensão aplicada à fonte histotripsia a zero. Para preparar um coágulo para análise, use um alicate para cortar a extremidade selada de uma pipeta contendo um coágulo e deixar o coágulo e o soro deslizarem em uma placa de petri. Use um bisturi para cortar o coágulo a um centímetro de comprimento e use uma limpeza para borrar suavemente a seção de corte para remover qualquer excesso de fluido.Use pinças para colocar cuidadosamente a seção do coágulo em uma balança e registrar o peso. Em seguida, levante manualmente o canal de fluxo de um reservatório de água desgase reverso e remova o vaso modelo do canal. Use pinças para colocar cuidadosamente o coágulo no vaso modelo sem danificar o coágulo e anexar o vaso ao canal de fluxo.Abaixe o canal de fluxo para dentro do tanque de tal forma que a extremidade proximal do estágio em relação ao reservatório seja baixa em comparação com o lado distal, e use uma pipeta para adicionar 30 microliters de 37 graus Celsius de plasma aquecido ao reservatório. Monitore a temperatura do reservatório de água até atingir pelo menos 36 graus Celsius, e use uma pipeta para adicionar 80,4 microgramas de rt-PA no reservatório de plasma. Para preparar o canal de fluxo, use uma bomba de seringa para atrair plasma do reservatório para o canal até que o vaso modelo tenha sido preenchido.Em seguida, nivele manualmente o vaso modelo para garantir que não haja bolhas de ar no vaso modelo, como visto dentro da janela de imagem. Para planejar um caminho para a fonte de histotripsy e a matriz de imagem para uma exposição uniforme de histotripsy ao longo do comprimento do coágulo, use o script de imagem para usar os posicionadores motorizados para alinhar a matriz de imagem paralelamente ao comprimento do coágulo e confirmar que não há bolhas de ar presentes no vaso. Use os posicionadores motorizados para alinhar a matriz de imagem de forma que o plano de imagem seja paralelo à seção transversal do coágulo.Usando a janela de imagem como guia, mova a fonte de histotripsia para a extremidade proximal do coágulo, em relação ao reservatório. Para determinar o caminho de inseção ao longo do comprimento do coágulo, defina pontos de passagem ao longo do comprimento do coágulo em incrementos de cinco milímetros. Antes de finalizar cada ponto de passagem, o teste de fogo pulsa da fonte histotripsy com os mesmos parâmetros de insalação que demonstrados, mas com a exposição geral reduzida a 10 pulsos totais.Em cada ponto de passagem, salve as posições do motor usando os comandos designados pelo fabricante. Para tratar o coágulo ao longo de seu comprimento de acordo com o caminho definido na etapa de pré-tratamento, coloque a bomba de seringa em 0,65 mililitros por minuto, e espere o menisco do plasma se mover. Interpolar o caminho de tratamento com passos intermediários entre os pontos de passagem estabelecidos com um tamanho de passo fixo, e use os posicionadores para mover a fonte de histotripsia em cada local do caminho, usando os parâmetros de inseção originalmente definidos.Em seguida, crie um script para definir o conjunto de imagens para adquirir uma imagem de modo B do coágulo e do vaso modelo alguns segundos antes da aplicação do pulso histotripsy em cada local. Em seguida, aplique o pulso histotripsy em cada ponto de passagem, adquirindo as emissões acústicas no script para formar imagens passivas de cavitação após a análise. Use a janela de imagem para imagem da atividade da bolha durante a aplicação do pulso histotripsy em cada local do caminho.Após a análise, levante manualmente o vaso modelo para fora do reservatório de água para drenar o perfusado via gravidade, e use a bomba de seringa para retirar a solução de plasma do canal de fluxo para permitir a coleta de todo o perfusato em um pequeno béquer. Desconecte o vaso modelo e remova o coágulo. Em seguida, limpe o coágulo com tecidos de laboratório e pese o coágulo para avaliar a perda de massa do coágulo.Após a aplicação de tensão suficiente à fonte histotripsia, uma nuvem de bolha é gerada na região focal do transdutor e visualizada através de imagens de ultrassom. A posição focal é definida como o centro da nuvem de bolha. Este controle perfusado de um coágulo exposto apenas ao plasma, e este perfusato de um coágulo tratado de lysotripsy foi usado para avaliar o teor de hemoglobina e D-dimer como demonstrado.A variabilidade na concentração de hemoglobina pode ser quantificada por absorvância óptica. Aqui, um coágulo pode ser visualizado dentro de um vaso modelo via imagem do modo B antes da exposição à histotripsia para determinar a posição do coágulo para segmentação da imagem de cavitação passiva. Como esta imagem de cavitação passiva co-registrada com a imagem do modo B do coágulo confirma, a energia acústica é contida principalmente dentro do coágulo durante a exposição à histotripsia.Em amostras expostas à histotripsia, a interrupção é restrita principalmente ao centro do coágulo, consistente com os locais observados de atividade de bolhas rastreados por meio de imagens de cavitação passiva. Com a adição de lítico, a perda de massa também ocorre em regiões mais próximas da periferia do coágulo. Alternativamente, lipossomos ecológicos contendo rt-PA podem ser usados no lugar da entrega sistêmica de rt-PA para permitir a avaliação da entrega de medicamentos direcionados ao coágulo.A lysotripsy fornece uma abordagem alternativa não invasiva ao tratamento de muitas doenças. Este protocolo in vitro permite a avaliação da eficácia do tratamento e seu potencial sucesso na aplicação in vivo.

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Bioengenharia

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Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

Apresentado aqui é um protocolo para um modelo de loop hemodinâmico in vitro padronizado. Este modelo permite testar a hemocompatibilidade de tubos de perfusão ou stents vasculares de acordo com a norma ISO (Organização Internacional para Padronização) 10993-4.

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