Name: Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de infecção cerebral por EcoHIV em ratos para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. Este método utiliza injeção estereotáxica para investigar alterações microgliais e comportamentais.

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Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028). Seis ratos F344/N machos adultos foram alojados em um ambiente controlado sob uma luz de 12/12: ciclo escuro com acesso ad libitum a alimentos e água. Todos os animais foram atendidos utilizando-se orientações estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Embalagem de vírus em células de 293 FT
<ol><li>Cultura as células de 293 FT (5×105/mL) em gelatina revestida 75 cm2 frascos com DMEM mais 10% FBS11. Crescer células a 37 °C para ser 50% confluente na transfecção.</li>
	<li>Diluir 22,5 μL de reagente transfecção (por exemplo, Lipofectamina 3000) em 750 μL de médio (por exemplo, Opti-MEM) em um tubo micro-centrífuga de 1,5 mL e vórtice para 3 s.</li>
	<li>Diluir 20 μg de DNA plasmídeo EcoHIV em 750 μL de meio em um tubo de microcrédito de 1,5 mL e misturar bem.</li>
	<li>Adicione DNA diluído no tubo de reagente de transfecção diluído e misture suavemente. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione a mistura a 10 mL de mMEM médio pré-armado em frasco de 75 cm2. Incubar células por 2 dias a 37 °C.</li>
	<li>Colher e combinar 24 mL de meio condicional dos dois frascos que incluem o lentivírus embalado.</li>
	<li>Centrifugar todos os 24 mL de meio condicional a 500 x g por 10 minutos a 4 °C. Transfira o supernante esclarecido para um tubo estéril de 50 mL.</li>
	<li>Combine 8 mL de concentrador Lenti-x com 24 mL de supernanato esclarecido (proporção 1:3). Misture por inversão suave. Incubar a mistura a 4 °C durante dois dias.</li>
	<li>Mistura centrífuga a 1.500 x g por 45 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o supernatante.</li>
	<li>Suspenda suavemente a pelota com 100 μL de 100 mM PBS.</li>
	<li>Concentração do vírus Titer com um kit P24 ELISA.</li>
</ol>2. Cirurgias estereóxiis do vírus EcoHIV-EGFP
<ol><li>Anesthetize ratos usando 3% de sevoflurano. Prossiga para a etapa 2.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.</li>
	<li>Raspe os cabelos da região cerebral e esterilize a pele duas vezes com 70% de etanol e um esfoliante à base de clorexidina. Fixar o rato em uma posição propensa no aparelho estereotaxico.</li>
	<li>Faça uma incisão (5-6 cm) através da pele ao longo da linha média do couro cabeludo.</li>
	<li>Marque duas posições de perfuração a 0,8 mm laterais, 1,2 mm rostral para bregma. Faça um orifício (diâmetro 0,4 mm) em cada posição do crânio.</li>
	<li>Encha a solução de lentivírus EcoHIV (1,04 × 106 TU/mL) em uma seringa de injeção de 10 μL. Fixar a seringa no aparelho estereotaxico.</li>
	<li>Mova a agulha para baixo perto da superfície do furo de perfuração. Meça e mova 2,5 mm de profundidade.</li>
	<li>Infundir 1 μL de solução de vírus a uma taxa de 0,2 μL/min. Mantenha a agulha dentro da área de injeção por 5 minutos. Mova lentamente a agulha até que esteja fora do crânio do rato.</li>
	<li>Suture a pele com um fio de seda 4-0.</li>
	<li>Esterilize a incisão com 70% de etanol uma vez. Injetar butorfenol subcutâneamente (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Transfira o rato para uma câmara de recuperação com uma almofada de aquecimento até acordar.</li>
</ol>3. Visualização de seções cerebrais
NOTA: Aguarde de uma a oito semanas após a infusão viral do EcoHIV.
<ol><li>Anestesiar o rato com 5% de sevoflurano. Continue a passo 3.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.</li>
	<li>Conserte o rato em uma posição supina dentro de um capô de fumaça.</li>
	<li>Inciso a pele ao longo da linha média torácica. Corte o diafragma e abra a cavidade torácica.</li>
	<li>Insira uma agulha de 20 G × 25 mm no ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Abra imediatamente o átrio direito com uma tesoura.</li>
	<li>Perfuse 50 mL de PBS pré-100 mM a uma taxa de 5 mL/min.</li>
	<li>Perfuse 100 mL de paraformaldeído frio de 4% a uma taxa de 5 mL/min.</li>
	<li>Decapitar o rato, abrir o couro cabeludo e remover o cérebro.</li>
	<li>Pós-fixado durante a noite com 4% de paraformaldeído.</li>
	<li>Transfira o cérebro para 40 mL de 30% de sacarose em 100 mM PBS em tubo de 50 mL até que o cérebro flutue até o fundo (cerca de 3 dias).</li>
	<li>Es clique para congelar o cérebro em metilbutanol por 2 min a - 80 °C.</li>
	<li>Fixar o tecido cerebral em uma plataforma metálica dentro de um criostat de -20 °C.</li>
	<li>Corte seções coronais de 50 μm de espessura usando o criostat.</li>
	<li>Transfira as fatias cerebrais para lâminas de vidro com uma escova fina.</li>
	<li>Monte seções em 0,3 mL de meio antifado e cubra com tampas de 22 mm de 50 mm.</li>
	<li>Mantenha os deslizamentos de vidro no escuro à temperatura ambiente até secar.</li>
	<li>Imagem dos neurônios alvo com um microscópio confocal usando z-stack baseado em limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios. NOTA: As configurações do microscópio confocal utilizada foram: ampliação de 60 X (A/1.4, óleo) e um intervalo de plano Z de 0,15 μm (tamanho pinhole 30 μm; raio pinhole projetado para trás 167 nm) usando um comprimento de onda de 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.

Neste protocolo, estabelecemos um modelo de infecção por HIV induzida pelo EcoHIV em ratos. Especificamente, descrevemos uma injeção estereotaxa bilateral de EcoHIV no córtex que induziu com sucesso a infecção ativa do HIV no cérebro de rato 7 dias após a injeção. Futhermore, demonstramos que a infecção pelo EcoHIV em ratos pode ser um bom sistema biológico para estudar aspectos-chave da MÃO. Oito semanas após a infecção pelo EcoHIV, os ratos apresentaram prejuízos neurocognitivos significativos, que incluíram as alteraç...

Os sistemas biológicos melhoraram nossa compreensão das doenças neurocognitivas associadas ao HIV-1 (HAND) e seus mecanismos neurais subjacentes2. Determinar qual sistema biológico é mais adequado para qualquer estudo, muitas vezes depende da questão do interesse2. A limitação da gama de modelos animais hospedeiros desafia os estudos sobre o desenvolvimento da doença do HIV-1. Para investigar a replicação viral e a patogênese do HIV-1, Potash et al.3 criaram um modelo de camundongo de infecção ativa pelo HIV-1, substituindo a região de codificação da glicoproteína de envelope de superfície do HIV, gp120, por gp 80 MLV ecotropic, que levou à replicação viral bem sucedida em camundongos4. Após injeções de veias na cauda em camundongos quióricos de HIV (EcoHIV), muitas características foram observadas semelhantes às de indivíduos soropositivos HIV-1 (por exemplo, linfócitos e macrófagos infectados, destinados a respostas imunes antivirais, e inflamação3,5,6).
Embora camundongos e ratos sejam ambos membros do Muridae, diferenças fundamentais de espécies podem influenciar sua adequação para questões experimentais específicas7. Portanto, a extensão do modelo de infecção do EcoHIV aos ratos (comumente utilizado em estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos) seria vantajosa no estudo do neuroHIV. Por exemplo, seu tamanho maior torna a implantação do cateter jugular para procedimentos de autoadministração de medicamentos mais práticos8. Técnicas de autoadministração de medicamentos em ratos têm sidoutilizadas para avaliar a motivação no HIV-19 . Além disso, muitas tarefas neurocognitivas/comportamentais foram inicialmente projetadas para ratos10. Aqui, relatamos a utilização de injeções estereotribuíficas de EcoHIV em ratos para ampliar o modelo de infecção do EcoHIV e dar uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuroHIV e à MÃO.

<table><tbody><tr><td>Células 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótica-Antimicótica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatina 75cm&sup2; Balão retangular de cultura de células com pescoço inclinado com tampa ventilada</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM com L-glutamina, 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>broca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrífuga Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibacteriano, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td></td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA p24 associado a lentivírus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>aparelho estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Precision</td><td>Instruments 500086</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Tem sido bem estudado que o modelo de camundongo infectado pelo EcoHIV é de utilidade significativa na investigação de complicações neurológicas associadas ao HIV. O estabelecimento do modelo de ratos infectados pelo EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos seria benéfico no estudo de distúrbios neurocognitivos associados ao neurocognitivo neurocognitivo neurocognitivo (HAND) neurohiv e HIV-1. No presente estudo, demonstramos a criação bem-sucedida de um modelo de rato de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV). Primeiro, a construção lentiviral do EcoHIV foi embalada em células cultivadas de 293 FT por 48 horas. Em seguida, o meio condicional se concentrou e se concentrou. Em seguida, realizamos injeções estereóxicas bilaterais do EcoHIV-EGFP no tecido cerebral de rato F344/N. Uma semana após a infecção, sinais de fluorescência EGFP foram detectados no tecido cerebral infectado, indicando que o EcoHIV induz com sucesso uma infecção ativa pelo HIV em ratos. Além disso, foi realizada a imunostaining para o marcador de células microgliais, Iba1. Os resultados indicaram que a microglia era o tipo de célula predominante que abrigava o EcoHIV. Além disso, os ratos EcoHIV apresentaram alterações no processamento temporal, um potencial mecanismo neuroabportavioral subjacente da MÃO, bem como disfunção sináptica oito semanas após a infecção. Coletivamente, o presente estudo estende o modelo EcoHIV de infecção pelo HIV-1 ao rato oferecendo um valioso sistema biológico para estudar reservatórios virais do HIV-1 no cérebro, bem como comorbidades associadas à MÃO e comorbidades associadas, como o abuso de drogas.

O meio condicionado foi coletado a partir de células infectadas pelo EcoHIV-EGFP de 293FT. Em seguida, foi concentrado e titulado, em seguida, estereotaxicamente injetado no cérebro (região cortical) de ratos F344/N. Sete dias após a injeção, os ratos foram sacrificados e as imagens foram tiradas de fatias cerebrais coronais que variavam de bregma de 5,64 mm a bregma -4,68 mm. Na Figura 1A,há sinais ecohiv-egfp significativos em todo o cérebro, especialmente no córtex e no giro dento de hipo...

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV), que é fundamental para melhorar nossa compreensão dos reservatórios virais do HIV-1 no cérebro e oferecer um sistema para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e comorbidades associadas (ou seja, abuso de drogas).

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Usando ratos, este protocolo pode ser usado para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico. com ratos, o estabelecimento do modelo de infecção do EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos pode ser benéfico para o estudo de distúrbios neurológicos e neurocognitivos associados ao HIV-1. O procedimento de demonstração será Hailong Li, um pesquisador associado do meu laboratório.Para a embalagem do vírus em 293 células T, semente cinco vezes 10 para a quinta 293 células T por mililitro de DMEM complementado com 10% FBS em cada um dos dois frascos de 75 centímetros quadrados revestidos de gelatina e incubar as células a 37 graus Celsius até que as culturas atinjam 50% de confluência. No dia da transfecção, diluir 22,5 microliters de reagente de transfecção em 750 microliters de frasco médio por frasco em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vórtice da solução por três segundos. Diluir 20 microgramas do DNA plasmídeo quimérico EcoHIV em 750 microlitres de meio em um segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por frasco com mistura completa.Combine o DNA diluído com o reagente de transfecção diluído com mistura suave e incubar a solução resultante por 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, adicione cada suspensão do vírus a 10 mililitros de meio DMEM pré-guerra e adicione cada solução suplementada por vírus a um frasco de 293 células T. Após dois dias de cultura celular, acumule o supernacido dos frascos em um único tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e transfira o supernante esclarecido para um novo tubo de 50 mililitros.Adicione oito mililitros de Concentredor Lenti-X ao supernanato esclarecido e misture com inversão suave. Após uma incubação de dois dias a quatro graus Celsius, centrifugar a mistura e remover cuidadosamente o supernascer, em seguida, resuspenque suavemente a pelota com 100 microliters de 100 milmolarES PBS e use um kit P24 ELISA para titer a concentração do vírus. Para a injeção EcoHIV-EGFP, após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, raspe os cabelos da região cerebral e esterilize a pele exposta duas vezes com 70% de etanol e um esfoliante à base de clorexidina.Fixar o rato em uma posição propensa em um aparelho estereotaxic e fazer uma incisão de cinco a seis centímetros através da pele ao longo da linha média do couro cabeludo. Marque uma posição de perfuração a 0,8 milímetros lateral e uma rostral de 1,2 milímetros para bregma e fure um buraco de 0,4 milímetros de diâmetro em cada posição do crânio. Carregue 1,04 vezes 10 para a sexta unidade de transdução por mililitro da solução de lentivírus EcoHIV em uma seringa de injeção de 10 microliteres e fixe a seringa no aparelho estereotaxico.Mova a agulha perto da superfície de um orifício de perfuração e insira a agulha 2,5 mililitros no orifício. Infundir um microliter de solução de vírus a uma taxa de 0,2 microliters de vírus por minuto. Quando todo o vírus tiver sido injetado, deixe a agulha dentro da área de injeção por cinco minutos antes de retirar lentamente a agulha até que ela esteja fora do crânio do rato.Feche a incisão da pele com uma sutura de fio de seda 4-0 e esterilize a solução com 70% de etanol, em seguida, coloque o rato em uma câmara de recuperação com uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recumbência. Uma a oito semanas após a infusão viral, depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, fixar o rato em uma posição supina dentro de um capô de fumaça e incisar a pele ao longo da linha média torácica. Corte o diafragma para abrir a cavidade torácica e insira uma agulha de 20 por 25 milímetros no ventrículo esquerdo.Abra imediatamente o átrio direito com tesouras e perfunda 50 mililitros de PBS de 100 mililitros pré-refrigerados a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. Quando todo o PBS for entregue, perfuse com 100 mililitros de frio 4%paraformaldeído. Quando todo o fixador tiver sido entregue, remova o cérebro do crânio e fixe o tecido durante a noite em um fresco 4% de desidida.Na manhã seguinte, coloque a amostra em 40 mililitros de 30% de sacarose em 100 mililitros pbs em um tubo de 50 mililitros por cerca de três dias até que o cérebro se instale no fundo do tubo antes de estalar o tecido cerebral em butanol metil por dois minutos a menos 80 graus Celsius. Após o congelamento, use um criostat de menos 20 graus Celsius e um pincel fino para adquirir seções coronais de 50 mícrons de espessura. Quando todas as seções tiverem sido obtidas, cubra as amostras com 300 microliters de meio anti-fade e monte-as com 22 tampas de 50 mililitros.Quando o meio secar, imagem as seções por microscopia confocal. Sete dias após a injeção de Lentivírus, imagens de fatias cerebrais coronal de ratos revelam uma presença significativa de sinais EcoHIV-EGFP em todo o tecido cerebral, especialmente dentro do córtex e do giro dentonato hipocampal. A rotulagem dupla com e as sondas Iba1 e EcoHIV-EGFP fornecem fortes evidências de que a microglia é o tipo de célula predominante que abriga a expressão EcoHIV no cérebro.Oito semanas após a infecção, os animais injetados pelo EcoHIV apresentam uma relativa insensibilidade à manipulação do intervalo interestimuloso, como evidenciado por uma função de intervalo relativamente mais plana em comparação com os controles salinos. Além disso, os ratos injetados pelo EcoHIV apresentam alterações profundas em sua morfologia dendrítica da coluna vertebral, como evidenciado por uma frequência relativa aumentada de espinhos dendráticos mais curtos com aumento dos diâmetros da cabeça e pescoço em relação aos animais de controle. A concentração e titulação do meio da condição antes da injeção estereotaxica é fundamental para garantir os resultados consistentes e replicáveis em experimentos.Esta injeção estereotaxa regional específica do EcoHIV fornece uma infecção eficiente pelo HIV dentro do cérebro e produz déficits de processamento temporal em ratos. A utilização de injeções estereotaxas de HIV em ratos para estender o modelo de infecção pelo EcoHIV oferece uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuro HIV em questão.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O modelo de ratos pós-natal para hipóxico-isquêmica lesão cerebral é um modelo bem estabelecido de humanos encefalopatia hipóxico isquêmica neonatal (HIE). Neste artigo, descrevemos o modelo de HIE em filhotes de ratos pós-natal.

O Modelo de encefalopatia hipóxico isquêmica Perinatal da Isquemia

Este vídeo demonstra o procedimento de injeção de vírus HIV quiméricos no córtex do cérebro de um rato, onde o RNA do vírus se integra ao genoma do hospedeiro, se replica e se espalha para estabelecer uma infecção ativa pelo HIV no modelo experimental.

Estabelecendo uma infecção ativa pelo HIV em um modelo de rato

A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

O protocolo aqui apresentado permite a reprodução de uma desmielinização de matéria cinzenta generalizada de ambos os hemisférios corticais em ratos agouti machos adultos. O método compreende a implantação intracerebral de um cateter, imunização subclínica contra glicoproteína de oligodendrocyte de mielina e injeção intracerebral de uma mistura de citocinas pró-inflamatórias através do cateter implantado.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Aqui, nós apresentamos um protocolo para criar um modelo murino imuno-competente do ICR (Instituto do cancer da pesquisa) da infecção do sistema nervoso central para indicar o desenvolvimento da neuropatia. A monitoração de desordens encefalalitic virais agudas por contagens idênticas da doença podia ser executada mostrando a neuropatia vírus-induzida dengue in vivo.

Um modelo murino da doença da encefalite viral aguda induzida pelo vírus da dengue

O objetivo deste estudo é estabelecer e validar um modelo animal para pesquisa nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral testando infarto cerebral e função sensóriomotor após oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) após 1-90 dias em ratos.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) pode ser modelada em ratos neonatais combinando corioamnionite e hemorragia intraventricular. A combinação desses eventos pré-natais e pós-natais recapitula com precisão as características clínicas da PHHP, incluindo macrocefalia, ventriculomegalia e pressão intracraniana elevada, ao longo da vida.

Modelagem da hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade em ratos

Este protocolo descreve como a combinação da infecção por EcoHIV com camundongos Tmem119-EGFP oferece um sistema biológico valioso para investigar alterações microgliais e reservatórios virais em modelos de roedores de distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Este artigo apresenta um protocolo para a indução de um modelo único de transtorno bipolar em ratos que captura tanto o comportamento semelhante à mania quanto o depressivo.

Desenvolvendo um modelo de rato para transtorno bipolar

Aprenda a estabelecer um modelo de infecção cerebral por EcoHIV em ratos para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. Este método utiliza injeção estereotáxica para investigar alterações microgliais e comportamentais.

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

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