Name: RNA onipresente e específico para tecidos em Drosophila Melanogaster usando CRISPR/CasRx (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a usar o sistema CRISPR/CasRx para redução de transcritos de RNA onipresente e específico para tecidos em Drosophila melanogaster. Este método permite a manipulação programável da expressão gênica in vivo com avaliação fenotípica.

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Este trabalho foi apoiado em parte por financiamento de uma Bolsa do Programa de Genes Seguros darpa (HR0011-17-2-0047), e prêmios NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) concedidos à O.S.A.

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A O.S.A é uma das fundadoras da Agragene, Inc., tem participação acionária e atua no Conselho Consultivo Científico da empresa. Os termos deste acordo foram revisados e aprovados pela Universidade da Califórnia, San Diego, de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Todos os outros autores não declaram interesses concorrentes.

Com três diferentes projetos de aplicação do sistema CasRx, este trabalho demonstrou direcionamento in vivoprogramável de RNA em moscas. As diferentes estratégias atendem às diferentes necessidades de projeto, como direcionamento genético endógeno versus exógeno e segmentação onipresente versus RNA específica do tecido. Os efeitos do direcionamento do RNA incluíram alterações fenotípicas específicas do gene alvo, redução da transcrição do RNA e fenótipos de letalidade ocasionais associados à alta expressão da proteína CasRx e atividade colateral. No geral, esses resultados mostraram que o sistema CasRx é capaz de direcionar a redução da transcrição do RNA no nível do organismo de forma programável e eficiente.
Um dos principais fatores na personalização bem-sucedida do sistema CasRx é o design de gRNAs. Especificamente, o seguinte conselho deve ser cuidado: a sequência de destino é de cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, o comprimento dos trechos poli-U na sequência de destino é de 4 pares de base ou menos, a sequência de destino GC o conteúdo está na faixa de 30% a 70%, a sequência de alvo não é prevista para formar estruturas fortes de grampo de RNA, e a sequência de alvo contém estrutura mínima prevista de RNA secundária ou terciária5.
Além dos projetos de gRNA, a etapa genética da mosca em cada protocolo também é fundamental em uma implementação bem sucedida. A presença ou falta dos fenótipos definidos passados pelos pais nos progens são importantes para identificar e quantificar fenótipos induzidos pelo sistema CasRx nos progens transheterozigos. Além disso, configurar cruzes de controle usando as moscas dCasRx em paralelo também são úteis na excluindo fenótipos não específicos nos progens transheterozigos.
Vale ressaltar que esses resultados revelaram problema de toxicidade introduzido pela onipresente expressão da proteína CasRx e dCasRx na mosca, uma limitação do sistema CasRx. A expressão onipresente de CasRx ou dCasRx sob o promotor Ubiq sozinho, sem gRNAs, veio com custos de fitness não trivial, já que nem as moscas Ubiq-CasRx nem Ubiq-dCasRx poderiam ser estabelecidas como linhas homozigas. Pelo contrário, as moscas UASt-CasRx e UASt-dCasRx podem ser estabelecidas como estoques homozigos saudáveis, embora devido ao desenho do esquema cruzado eles foram mantidos como estoques de equilíbrio duplo, fato que suporta a existência de toxicidade induzida pela onipresente expressão proteica CasRx. Outra evidência de apoio é que em experimentos de controle envolvendo dCasRx, que é cataticamente inativo, as porcentagens de moscas carregando tanto dCasRx quanto construções de gRNA do número total de moscas na geração F1 foram consistentemente inferiores a 50%, a razão esperada com base na genética mendeliana se não houvesse toxicidade associada ao dCasRx. Isso indicou que a expressão onipresente do dCasRx, juntamente com os gRNAs, induz a toxicidade na mosca, resultando em uma razão de herança menor do que a esperada. As razões de herança do UASt-dCasRx transheterozigous, gRNA, GAL4 seguiram a genética mendeliana, o que sugere novamente a toxicidade induzida especificamente pela expressão onipresente das proteínas CasRx e dCasRx. A toxicidade no sistema CRISPR/Cas não é nova. Altas quantidades de proteína Cas9 tem se mostrado tóxicas em vários organismos, incluindo moscas29,30,31,32. Um estudo recente desenvolveu um sistema GAL4/UAS personalizado que pode ajustar a quantidade de proteína Cas9 expressa em moscas adicionando um quadro de leitura aberta de comprimento variado entre a sequência UAS e a sequência Cas9 na construção UAS-Cas933. Portanto, vale a pena explorar maneiras de reduzir a toxicidade induzida pelo CasRx, afinando o nível de expressão da proteína CasRx.
Além da toxicidade induzida pela expressão onipresente das proteínas CasRx e dCasRx, os resultados também mostraram letalidade ligada aos efeitos colaterais não específicos fora do alvo do sistema CasRx, uma característica de muitos sistemas CRISPR1,2,7,34. Em algumas das moscas casrx e não essenciais que expressam gRNA dupla ou triplamente transheterozgous, por exemplo, ao atingir notch, as moscas CasRx transheterozigous têm níveis significativamente mais baixos de taxa de sobrevivência em comparação com as moscas transheterozgyous dCasRx. Na análise rna-seq dessas moscas transheterozigos que expressam CasRx e gRNA, tanto a redução dos níveis de transcrição genética-alvo quanto a redução de transcrições genéticas não-alvo foram observadas. Esses efeitos colaterais foram dependentes de CasRx e dependentes de alvos, pois só foram observados em moscas transheterozigous expressando tanto a proteína CasRx quanto o gRNA. Vale ressaltar que um dos genes-alvo, branco, apresentou apenas uma redução limitada e não estatisticamente significativa nas transcrições quando o gene branco foi alvo do CasRx, que contrastava com o fenótipo de redução de pigmento claro. Acredita-se que isso possa ser devido ao fato de que 1) o tempo da coleta de amostras de RNA-seq não estava bem alinhado com o momento em que o gene branco atinge seu pico de expressão durante o desenvolvimento precoce, e 2) a expressão localizada do gene branco nos olhos torna desafiador coletar os tecidos relevantes durante a fase de desenvolvimento precoce quando apenas a coleta de amostras de corpo inteiro é viável. Para reduzir a atividade colateral no sistema CasRx, estudos futuros são solicitados a compreender completamente os mecanismos subjacentes ao sistema de fenômenos fora do alvo no nível do organismo.
Curiosamente, um estudo recente35 descrevendo ferramentas Cas13 direcionadas ao RNA em moscas parecia amenizar a toxicidade geral associada à expressão CasRx, por várias razões possíveis. Em primeiro lugar, os autores recodificaram os transgênicos Cas13 para otimizar a expressão em Drosophila e utilizaram um promotor mais fraco (actin 5C) em comparação com o promotor de ubiquitina utilizado no presente estudo, provavelmente levando a níveis mais baixos de expressão Cas13 e, portanto, menos toxicidade. De fato, isso é apoiado pelas observações de que a expressão CasRx e dCasRx, impulsionadas pelo UASt, não era, por si só, tóxica, pois este estudo (e os autores em 35) não observaram nenhuma letalidade óbvia nas moscas UASt-CasRx. Além disso, esses autores codificaram suas gRNAs de forma diferente em relação a este estudo, o que pode ter afetado sua expressão e reduzido a toxicidade do sistema em moscas Cas13/gRNA transheterozigous. Por exemplo, em seu estudo dois gRNAs foram expressos usando o promotor U6:3 e ladeados por tRNAs para permitir o processamento de gRNA após o amadurecimento do tRNA sem exigir CasRx35. Por outro lado, neste estudo, os gRNAs foram codificados como matrizes que visam até 4 locais por gene e imitam a estrutura endógena da matriz Cas13 encontrada em bactérias, o que requer que a enzima Cas13 processe cada gRNA. Essas diferentes abordagens podem ter levado a diferenças nos níveis de expressão do gRNA e outros fatores que podem ter efeitos inerentes à toxicidade de todo o sistema. Finalmente, Huynh et al. atingiram genes diferentes dos alvos no presente estudo, que resultam em diferenças na interação alvo-Cas/gRNA e atividade colateral e podem ter efeitos sobre os níveis observados de letalidade. Essas diferenças na toxicidade observada justificam uma investigação mais aprofundada para identificar maneiras de que os sistemas globais possam ser melhorados.
No geral, este estudo é a primeira demonstração de um sistema de Cas programável programável geneticamente codificado funcional em D. melanogaster, embora uma otimização adicional do sistema CasRx (em linha com o que é relatado35) será necessária para reduzir ainda mais a letalidade fora do alvo e aumentar a eficácia do decote casrx no alvo. O direcionamento de RNA com enzimas Cas é um campo em rápida evolução com muitas aplicações potenciais que vão desde o controle de vetores de insetos até usos terapêuticos1,2,3,4,5,6,7, e este protocolo oferece um pacote inicial para qualquer pessoa interessada em projetar seu primeiro sistema CasRx em moscas, ao mesmo tempo em que é compatível com a personalização e otimização do sistema. Os exemplos aqui apresentados demonstram uma série de resultados que se pode encontrar durante a implementação deste sistema in vivo e pode servir de benchmark para outros usuários na avaliação do desempenho do sistema CasRx em seus aplicativos.

Desde o advento das tecnologias Clustered Regularmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), grande parte do foco neste campo tem sido na edição de DNA, que oferece aplicações transformadoras em medicina e biotecnologia1. A alteração permanente das sequências de DNA, no entanto, nem sempre é desejada devido a considerações éticas. À luz disso, estudos recentes começaram a desenvolver ferramentas baseadas em CRISPR para direcionar o RNA e demonstraram que as tecnologias CRISPR podem de fato ser usadas para direcionamento de RNA em uma variedade de sistemas biológicos2, 3,4,5,6,7. Em muitos desses sistemas testados, a abordagem atual amplamente utilizada para direcionar a redução de RNA e transcrição é a interferência de RNA (RNAi), que está longe de ser perfeita, muitas vezes exibindo eficácia variada e atividade fora do alvo quando usada no vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Portanto, dado o status dessas tecnologias, vale a pena explorar ainda mais os potenciais de ferramentas baseadas em CRISPR para segmentação de RNA.
Um estudo recente notável relatou que a ribonuclease CasRx, um membro da classe Cas13d, pode reduzir eficientemente os níveis de transcrição genética na cultura celular humana e possui um perfil atraente fora do alvo4. Esse achado levou à questão de saber se essa nova ribonuclease pode manter sua eficácia e baixa taxa de RNA para o alvo do RNA no nível do organismo. Um estudo recente abordou essa questão mostrando que o sistema CasRx pode ser usado para alcançar a redução onipresente e específica da transcrição genética em Drosophila melanogaster5.
Para agilizar a usabilidade desta abordagem recentemente publicada, este protocolo detalha os métodos deste trabalho recente, que consiste em três partes principais: 1) onipresente direcionamento in vivo RNA utilizando um sistema CasRx de dois componentes; 2) alvo onipresente de RNA exógeno in vivo usando um sistema CasRx de três componentes; e 3) segmentação de RNA vivo específica de tecido usando um sistema CasRx de três componentes.
Os RNAs guias (gRNA) que visam diferentes genes-alvo sob o controle de um promotor onipresente foram projetados e linhas de mosca expressando essas construções contendo gRNA foram geradas. As construções casRx sob o controle de um promotor onipresente, ou uma sequência de ativação a montante condicional (UASt) ativada pelo fator de transcrição GAL4, também foram projetadas e linhas de mosca que abrigam esses construtos contendo CasRx gerados. Construções casrx catalyticamente inativas, dCasRx, foram projetadas e usadas como controles negativos. O alvo onipresente do RNA em moscas é alcançado cruzando linhas aéreas que expressam gRNA com linhas aéreas onipresentes de expressão CasRx. A prole que expressa tanto o projeto gRNA visando uma transcrição genética específica quanto a proteína CasRx tem uma redução onipresente das transcrições genéticas direcionadas. O direcionamento de RNA específico para o tecido em moscas é alcançado pela primeira vez cruzando moscas que expressam gRNA com moscas expressas UASt-CasRx, obtendo moscas transheterozigous carregando tanto gRNA quanto construções UASt-CasRx. Tais moscas, por sua vez, são cruzadas com moscas de forma específica de tecido, resultando na geração de expressão CasRx específica do tecido e direcionamento de RNA em moscas.
A natureza programável do sistema CasRx oferece a possibilidade de personalização e otimização para ajudar a alcançar alta eficácia e baixa atividade fora do alvo para o RNA in vivo. As aplicações potenciais de RNA-targeting baseada em CRISPR são numerosas, incluindo a substituição do RNAi no laboratório e a contribuição para o controle de vetores de insetos na natureza. Desta última, uma das necessidades globais não atendidas é o desenvolvimento de ferramentas eficientes para combater infecções de vírus RNA transmitidas por mosquitos. Muitos vírus do RNA, como o vírus da dengue, zika e chikungunya, são transmitidos através de mosquitos, afetando a saúde humana e contribuindo com a mortalidade. Muitas propostas para a engenharia de populações de mosquitos com resistência ao vírus para prevenção de doenças foram feitas; no entanto, nenhuma tecnologia atual é capaz de tornar os mosquitos simultaneamente resistentes a todos os vírus RNA significativos18,19,20,21,22,23. Os sistemas Cas direcionados ao RNA podem fornecer um ponto de partida para tal tecnologia, permitindo uma plataforma programável para atingir todos os vírus RNA transmitidos por mosquitos.

<table><tbody><tr><td>100% Suco de Uva</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Seca Ativa (908g)</td> <td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 câmera colorida</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 Luminômetro</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 Sequenciador</td><td>Illumina, Inc.</td>Estereomicroscópio fluorescente <td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Espectrofotômetro UV-vis OneC</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 112686</td><td>Addgene</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 112688</td><td>Addgene</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132416</td><td>Addgene</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132417</td><td>Addgene</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132419</td><td>Addgene</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132420</td><td>Addgene</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132421</td><td>Addgene</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132422</td><td>Addgene</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>Endonucleases de restrição XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Kit Pico para Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc moscas</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla voa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Kits de Recuperação de DNA em Gel Zymoclean</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

rna onipresente e específico para tecidos em drosophila melanogaster usando crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, um membro da família Cas13 que visa o RNA, é uma nova adição promissora das tecnologias CRISPR/Cas na redução eficiente da transcrição genética com um perfil atraente fora do alvo em níveis celulares e organismos. Recentemente é relatado que o sistema CRISPR/CasRx pode ser usado para alcançar a redução onipresente e específica da transcrição genética em Drosophila melanogaster. Este artigo detalha os métodos do trabalho recente, composto por três partes: 1) onipresente direcionamento de RNA endógeno in vivo usando um sistema CasRx de dois componentes; 2) alvo onipresente de RNA exógeno in vivo usando um sistema CasRx de três componentes; e 3) segmentação in vivo RNA específica do tecido usando um sistema CasRx de três componentes. Os efeitos do direcionamento do RNA observado incluem alterações fenotípicas específicas de genes direcionados, redução de transcrição de RNA direcionada e fenótipos de letalidade ocasionais associados à alta expressão da proteína CasRx e atividade colateral. No geral, esses resultados mostraram que o sistema CasRx é capaz de direcionar a redução da transcrição do RNA no nível do organismo de forma programável e eficiente, demonstrando que o direcionamento do transcrito in vivo, e a engenharia é viável e estabelece as bases para futuras tecnologias de segmentação de RNA baseadas em CRISPR.

Alvo in vivo in vivo RNA usando um sistema CasRx de dois componentes As moscas transheterozigous F1 expressando tanto o Ubiq-CasRx quanto o gRNA (visando genes endógenos e exógenos) mostraram fenótipos marcados em comparação com as moscas de controle expressando as construções Ubiq-dCasRx e gRNA (Figura 2 e Figura 4). Especificamente, as moscas CasRx transheterozigous têm níveis significativamente mais baixos de taxa de sobrevivência em comparação com as moscas transheterozgyous dCasRx, indicando toxicidade do sistema Ubiq-CasRx (Figura 2A e Figura 4A). Vale ressaltar que tanto as moscas transheterozigous CasRx quanto dCasRx têm menos de 50% de taxa de herança, que é a razão esperada com base na genética mendeliana. Dos três genes alvo, o Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ voa e Ubiq-CasRx/+; As moscas U6-gRNAy/+ são inviáveis (herança de 0%) e não cresceram além do segundo estágio de larvas instar (Figura 2A-2B). O sobrevivente Ubiq-CasRx/+; As moscas U6-gRNAw/+ , a herança da qual era de 12,9%, mostraram um fenótipo de olhos brancos totalmente penetrante (Figura 2B). Além dos traços observáveis associados ao CasRx, pudemos confirmar uma redução significativa das transcrições genéticas-alvo para 3 genes-alvo: Entalhe, amarelo e GFP (Figura 2E-2G). A redução das transcrições genéticas brancas foi observada em moscas Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ em comparação com o controle Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ voa, embora a redução não tenha sido estatisticamente significante (Figura 2E - 2F). Evidências de atividade fora do alvo induzida pelo CasRx foram encontradas ao comparar as transcrições expressas diferencialmente entre amostras de moscas expressas por CasRx e amostras de moscas expressas por dCasRx (Figura 2E, 2G). O número de transcrições não-alvos expressas significativamente diferencialmente são os seguintes: branco, 253 (1,4% do total de transcrições); Notch, 300 (1,7%); amarelo, 41 (0,23%); GFP, 5.880 (33%) (Figura2G). Do total de 17.779 transcrições diferentes, 6 transcrições não-alvo foram expressas significativamente diferencialmente em todos os 4 grupos de amostras. Uma das 6 transcrições identificadas foi Gadd45, um gene envolvido em apoptose e prisão celular em moscas, levantando a possibilidade de que a ação enzimática do CasRx possa desencadear diretamente apoptose celular ou desencadear indiretamente a má expressão de outros genes, o que, por sua vez, leva à apoptose. Finalmente, vale a pena notar que as moscas Ubiq-CasRx e Ubiq-dCasRx não foram estabelecidas como estoques homozigosos, presumivelmente devido à toxicidade conferida pela alta expressão onipresente. Como resultado, as moscas heterozigous Ubiq-CasRx/CyO e Ubiq-dCasRx/CyO foram usadas para atravessar com linhas de moscas gRNA homozigous. Em suma, o sistema Ubiq-CasRx de dois componentes é capaz de alcançar alvos onipresentes de RNA para alvos endógenos e exógenos, resultando em fenótipos observáveis e redução de transcrições. Esses resultados também mostraram que o direcionamento de RNA mediado pelo CasRx pode introduzir toxicidade in vivo.
Alvo de RNA exógeno in vivo onipresente usando um sistema CasRx de três componentes Os resultados da cruz de duas etapas mostraram que, apesar da natureza exógena do gene alvo (ou seja, Fluc), expressando todos os três transgenes em transheterozigotes f2 triplos (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resultou em 100% de letalidade em comparação com cruzamentos de controle envolvendo Ubiq-dCasRx, onde nenhuma letalidade foi observada nas transheterozygotes F2 triplas (Ubiq-dCasRx/+; gRNAc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Figura 3B-C ). Mais especificamente, apenas a combinação de todos os três transgenes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resultou em 100% de letalidade (Figura 3B e D), enquanto (Ubiq-CasRx/+; gFluRNAc/TM6) e (Ubiq-CasRx/+; Os genótipos Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6 eram viáveis e não tinham fenótipos com suas taxas de herança que correspondiam às taxas de transmissão mendelianas esperadas, sugerindo que a disponibilidade da sequência de destino (ou seja, luciferase de vagalume) em combinação com Ubiq-CasRx/+ e o gRNAFluc foi o que resultou nos fenótipos de letalidade observados, presumivelmente decorrentes da atividade colateral das enzimas Cas132,8 . Além disso, nenhum fenótipo distinto ou influência dramática sobre a herança em transheterozygotes F1 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ ou Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) foram observados em comparação com os controles Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ ou Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figura 3B), indicando que uma enzima catalíticamente ativa é essencial para obter os fenótipos de letalidade observados. Além disso, os níveis de expressão fluc e rluc em moscas de todos os genótipos viáveis não mostraram redução significativa na expressão Fluc no Ubiq-dCasRx triple transheterozygotes (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) em comparação com controles duplos de repórteres luciferase. Isso sugere que os níveis de expressão da proteína Fluc não foram reduzidos pela segmentação dCasRx (Figura 3D). Juntos, o fenótipo de letalidade comum nos dois diferentes experimentos de alvo onipresentes do RNA mediados por CasRx indicam que, quando usado em tecidos onipresentemente, o alvo de RNA mediado por CasRx pode ser tóxico para o organismo.
Segmentação in vivo RNA específica do tecido usando um sistema CasRx de três componentes O alto nível de toxicidade observado em experimentos onipresentes de segmentação de RNA nos levou a explorar o direcionamento de RNA específico do tecido usando um projeto de sistema CasRx de três componentes detalhado na seção de métodos. De fato, o nível de toxicidade observado foi reduzido quando a expressão geral casRx foi reduzida usando o promotor UASt em comparação com o do promotor ubiq, isso é exemplificado em três aspectos: 1) as linhas UASt-CasRx e UASt-dCasRx foram mantidas como linhas homozigas, embora com base no esquema cruzado de duas etapas duplamente equilibradas as linhas UASt-CasRx e UASt-dCasRx foram usadas para executar as cruzes, 2) todas as taxas de herança transheterozigous triplas da geração F2 coincidiram com a taxa de herança mendeliana esperada de 25%, e 3) o fenótipo de letalidade transheterozigous da geração F2 CasRx foi moderadamente reduzido. No experimento de segmentação branca, das taxas de herança mendeliana de 25% esperadas nas transheterozigotes triplas F2, apenas 0,57% foram observadas moscas adultas viáveis (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4), todas com pigmentação específica do olho grave e fenótipos de morfologia (Figura 4A e 4B). Para a cruz de alvo branco, a taxa de herança F2 tríplice transheterozigous que expressa CasRx foi significativamente menor do que a do grupo de controle triplo transheterozigos (27,6%) (Figura 4A). No experimento de alvo notch, casRx-expressing triplo tranheterozygous carregando todos os três transgenes foram 100% letais, enquanto a taxa de herança de controle dCasRx foi de 29,3% (Figura 4A). No experimento de mira amarela, f2 triplo transheterozigous CasRx-expressing, gRNAy, e y-GAL4 mostrou redução marginal de pigmento de quitina como pequenas manchas de cutícula amarela no tórax e abdômen com uma taxa de herança de 2,67%, muito menor do que a do grupo de controle dCasRx (25,2%) (Figura4A) (Figura4A ). Todos os dCasRx controlam moscas transheterozigous triplas não apresentaram fenótipos óbvios como as moscas que expressam CasRx, indicando que a atividade catalítica do CasRx contribuiu para os fenótipos observados. A baixa taxa de herança no grupo transheterozigos triplo CasRx sugeriu que existem duas fontes de toxicidade na segmentação casrx RNA: uma está associada à alta expressão do CasRx, a toxicidade da qual foi reduzida pela expressão restritiva CasRx, a outra está associada à atividade colateral. Juntos, esses resultados mostraram que o sistema CasRx pode alcançar o direcionamento in vivo RNA específico do tecido, aproveitando o sistema clássico Gal4/UASt e, entretanto, reduzir a toxicidade. No entanto, a toxicidade e os fenótipos de letalidade ocasionais ainda foram observados em um nível mais baixo de gravidade em comparação com o das abordagens onipresentes, indicando que a atividade de decote colateral está associada à toxicidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral geral do alvo do RNA usando um sistema Cas13D. (A) Esquemas da cruz genética de um passo na onipresente segmentação in vivo RNA usando um sistema CasRx de dois componentes. (B) Esquemas de uma cruz genética de duas etapas no onipresente direcionamento de RNA exógeno in vivo usando o sistema CasRx de três componentes. (C) Esquemas de uma cruz genética de duas etapas no alvo in vivo RNA específico do tecido usando um sistema CasRx de três componentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Figura 2: Onipresente in vivo RNA targeting usando um sistema CasRx de dois componentes (reimpressa5). (A) Percentuais totais de herança de moscas transheterozigous herdando Ubiq-CasRx (ou Ubiq-dCasRx) e gRNAs. Sombreamento azul no enredo da caixa indica penetração de fenótipo. (B) Fenótipos de moscas transheterozigous. As flechas indicam necrose tecidual no olho. Mosca preta e branca marcada com ''X'' representa letalidade. (C) Percentua totais de herança de moscas transheterozigous de cruzes bidirecionais entre as moscas Ubiq-CasRx (ou Ubiq-dCasRx) e gRNAGFP-OpIE2-GFP. M, herança materna de CasRx; P, herança paterna de CasRx. (D) Larvas de F1 progenies na cruz paterna. (E) As estimativas máximas de a posteriori das transcrições para a alteração da dobra logarítmica. O gasoduto DESeq2 foi usado. (F) Transcrições por milhão (TPM) direcionadas com CasRx ou dCasRx. (G) CasRx-depentent percentual de transcrição despententetada diferencialmente expressa das transcrições. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Figura 3: Onipresente in vivo exógeno RNA targeting usando um sistema CasRx de três componentes. (A) Esquemas da cruz genética de duas etapas. (B) Percentuais totais de herança para todos os genótipos emergentes na geração F2 . Herdar todos os três transgenes (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc e gRNAFLuc) na progênero F2 resultou em 100% de letalidade e foi significativamente menor em comparação com o grupo de controle de transheterozygotes triplo Ubiq-dCasRx (p = 0,001, t-test). (C) Carregar apenas Ubiq-CasRx/gRNAFluc ou Ubiq-CasRx e Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc por si só não levou a letalidade grave, e as razões de herança entre Ubiq-CasRx e Ubiq-dCasRx transheterozygotes não foram significativamente diferentes (p = 0,41 e p = 0,51, respectivamente, t-test). (D) Proporções de luciferase normalizando as leituras fluc para leituras de Rluc. Moscas transheterozigous triplas expressando Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc eram letais embrionárias, que era representada por uma mosca com um "X", e como resultado a expressão luciferase não foi medida. A razão Fluc/Rluc de Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes foi significativamente menor que a dos outros grupos de expressões Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc (p = 1,2e-06 ou inferior, t-test). Os resultados do grupo somente gRNAFLuc foram significativamente inferiores aos de todos os outros grupos (p = 1,2e-06 ou inferior, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Figura 4: Segmentação in vivo RNA específica do tecido usando um sistema CasRx de três componentes (reimpressa5) (A) Percentual total de herança de moscas transheterozigous triplas transportando três transgenes (UASt-CasRx ou UASt-dCasRx, gRNAs e Gal4-driver. (B) Fenótipos das moscas transheterozigous triplas. A seta branca indica redução do pigmento de quitina no tórax. Mosca preta e branca marcada com ''X'' representa letalidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Construir</td>
			<td>Descrição</td>
			<td>Cartilha</td>
			<td>Sequência de primer (5' a 3')</td>
			<td>Modelo PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">Promotor do UASt</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTCTTTCTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">Promotor do UASt</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 promotor</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">Promotor da Ubiq</td>
			<td>1052B. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052B. C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Promotor reverso da Ubiq</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgene plasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAAATAGAG ATGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Lista de construtos moleculares e primers utilizados neste estudo. Esta lista inclui todos os construtos (tanto o ID quanto a descrição) e os primers associados de cada construção (tanto o ID quanto as sequências (5' a 3')) e os modelos utilizados.

Este artigo descreve um protocolo detalhado para o uso da enzima Cas13D com destino a RNA (RfxCas13D) em moscas.

RNA onipresente e específico para tecidos em Drosophila Melanogaster usando CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Como nosso protocolo mostra, as tecnologias CRISPR CasRx podem ser usadas para alcançar reduções onipresentes e específicas de transcrição genética em moscas de frutas. Nossa técnica oferece um pacote inicial para quem estiver interessado em usar a redução de transcrição genética baseada em CRISPR em moscas de frutas, ao mesmo tempo em que é compatível com mais personalização e otimização. Para configurar um RNA in vivo onipresente usando um sistema CasRx de dois componentes, colete 10 moscas fêmeas adultas virgens da linha de interesse gRNA homozigous e cinco moscas machos adultos do equilibrado heterozigoso Ubiq CasRx CurlyO.Coloque as moscas dos pais em um frasco complementado com 100 microgramas de fermento seco em pó eguarde os frascos por 48 horas a 26 graus Celsius. Observe os frascos todos os dias para ver se alguma nova descendência adulta emergiu do púbico da geração F1 e anestesia qualquer um dos adultos com dióxido de carbono por 10 segundos. Uma vez que as moscas se tornam imóveis esvaziar o frasco em uma plataforma de mosca conectada ao tanque de dióxido de carbono com dióxido de carbono contínuo e usar uma câmera colorida conectada a um microscópio estéreo fluorescente para marcar e imagem os fenótipos das moscas.Em seguida, conte os números de progênero com diferentes fenótipos, de acordo com a expressão do sinal fluorescente. Com base na genética mendeliana, espera-se que 50% da prole expresse o RNA direcionado. Observe que a toxicidade do sistema Ubiq CasRx pode reduzir a proporção de RNA direcionado expressando progênero para menos de 50% Para configurar um RNA exógeno in vivo onipresente usando um sistema CasRx de três componentes, coletar de oito a dez moscas fêmeas adultas virgens de uma linha expressa de luciferase dupla e quatro a cinco moscas machos adultos do equilibrado heterozigous Ubiq CasRx Curly mais TM6, Linha STB que exibe olhos brancos, asas encaracoladas e fluorescência vermelha ds simultaneamente.Coloque o passo dos pais um passo em um frasco complementado com 100 microgramas de fermento seco em pó e coloque esta cruz por 48 horas a 26 graus Celsius. No final da incubação, remova todas as moscas dos pais de cada frasco e devolva os frascos para a incubadora Celsius de 26 graus por pelo menos 14 dias. Ao longo de 14 dias, como mencionado anteriormente, coletarei oito a dez virgens femininas da luciferase de vagalume homozigous que tem como alvo a linha gRNA três vezes.Observe o passo um frascos cruzados todos os dias para ver se algum novo gênio adulto emergiu da pupa, anestesiando com dióxido de carbono para permitir a coleta de quatro a cinco moscas machos expressando tanto o Ubiq CasRx quanto o repórter dual Luciferase como disponível. Coloque as moscas em um novo frasco com 10 fêmeas virgens da luciferase de mosca de frutas visando a linha gRNA, e coloque estas cruzes passo dois a 26 graus Celsius por 48 horas. Colete outros cinco machos de um dia de idade expressando tanto o Ubiq CasRx quanto o repórter de luciferase dupla do passo um frascos cruzados e incubar as moscas por dois a quatro dias sozinhos a 26 graus Celsius antes de transferi-los para uma centrífuga de 1,5 mililitro para menos 80 graus Celsius de armazenamento.No final da incubação, remova todos os frascos parentais de cada um dos frascos cruzados da etapa dois. E devolva os frascos para a incubadora 26 graus Celsius por pelo menos 20 dias. Observe o passo dois frascos cruzados todos os dias para ver se alguma nova descendência adulta emergiu do púbico, anestesiando as moscas com dióxido de carbono à medida que se tornam disponíveis, e marcando e visualizando seus fenótipos como demonstrado.A genética mendeliana sugere que, se todas as moscas forem viáveis, 25% da prole deve expressar o RNA alvo. Para realizar um ensaio de luciferase, gere as moscas tríplices trans heterozigous, bem como as moscas de controle como demonstrado. Recolher as moscas machos ao nascer, e envelheci-las até três dias de idade.Transfira as moscas de três dias de idade em tubos de centrífugas de 1,5 mililitro, e lise-os usando um tampão no tampão de luciferase de um kit de ensaio de luciferase disponível comercialmente. Em seguida, use cinco microliters de tecido liose de cada amostra e luminômetro para medir tanto as moscas das frutas quanto a atividade da Luciferase, de acordo com os protocolos padrão de ensaio de luciferase. F1, CasRx heterozigos trans, têm taxas de sobrevivência significativamente menores em comparação com moscas dCasRx heterozigosas trans.Confirmando a toxicidade do sistema Ubiq CasRx dos três genes alvo, as moscas heterozigous U6 gRNA Y são inviáveis e não crescem além do segundo estágio larval instar. As moscas heterozigous Ubq CasRx e U6 gRNA W, demonstram um fenótipo de olhos arregalados totalmente penetrante. Além disso, também é observada uma redução significativa das transcrições genéticas-alvo para três genes-alvo.Evidências de atividade fora do alvo induzida pelo CasRx também são observadas quando transcrições diferenciadas expressas entre amostras de CasRx expressando moscas e amostras de moscas expressas dCasRx são comparadas. Na cruz de dois passos, apenas a combinação de todos os três genes trans resulta em uma letalidade de 100%. Quando o direcionamento específico de RNA de tecido usando um design de sistema CasRx de três componentes é empregado, o nível de toxicidade é reduzido quando a expressão geral casRx é reduzida usando o promotor UAST em comparação com o do promotor Ubiq.É importante configurar o processo genético corretamente usando moscas de gênero correto e fenótipos corretos.

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