Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais
6 de fevereiro de 2021
Neste protocolo, descrevemos como gerar monótolais de cólon epitelial primário murina diretamente de criptas intestinais. Fornecemos abordagens experimentais para gerar monocamadas confluentes em filtros permeáveis, monocamadas confluentes para cura de feridas de risco e estudos bioquímicos, e monocamadas esparsas e confluentes para análise de imunofluorescência.
Nosso protocolo fornece um método rápido, reprodutível e confiável para gerar monocamadas epiteliais primárias diretas em diferentes superfícies com detritos mínimos. As principais vantagens deste protocolo são o baixo consumo de mídia e a manutenção de baixo custo da cultura celular. É um método rápido para realizar testes funcionais e aplicações rápidas a jusante.
Este protocolo fornecerá insights no estudo da reparação de feridas, barreira de permeabilidade e migração transepitelial de diferentes tipos de células. Além disso, este modelo pode ser útil na interação hospedeiro-patógeno, epitelial danificada e descoberta de drogas. Para começar, adicione 200 microliters de solução de revestimento a cada poço de uma placa de 48 poços e slide de câmara.
Pré-incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas. Revestimento de 0,4 inserções de membrana celular de micrômetro com 200 microliters de solução de colágeno. Incubar a placa com as pastilhas de membrana a quatro graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, transfira-a para uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por duas horas.
Desinfetar um rato eutanizado com 70% de etanol, em seguida, dissecar o cólon do reto para o ceco com a ajuda de tesouras e fórceps. Limpe suavemente as fezes com PBS gelado em uma seringa de 10 mililitros equipada com um tubo de alimentação de calibre 20. Remova o cólon proximal e deslize o cólon distal suavemente para o tubo de alimentação de 20 medidores.
Amarre o cólon no final do tubo com rosca de seda 4-0. Inverta o cólon do avesso sobre a extremidade amarrada e amarre a outra extremidade com rosca, em seguida, corte o cólon abaixo da ponta do tubo de alimentação usando uma tesoura cirúrgica. Abra suavemente a extremidade desamaste do cólon invertido na ponta de uma seringa repetida de 1,25 mililitro usando seu êmbolo.
Deslize a extremidade desamascada do cólon invertido sobre a seringa e amarre-a firmemente com um fio. Insira o êmbolo na seringa e infle o cólon até parecer turgente sem rugas visíveis. Coloque a linguiça de cólon inflada em um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de solução de recuperação celular no gelo por 20 minutos.
Infle e esvazie o cólon uma vez a cada cinco minutos. Amarre o cólon inflado abaixo da ponta da seringa repetida usando rosca de sutura de seda 4-0. Corte a linguiça de cólon da seringa repetida e coloque-a em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de 50 mililitros EDTA por 40 minutos.
Gire o tubo a 4 graus Celsius. Substitua a solução EDTA por cinco mililitros de tampão de shake e agite a salsicha manualmente na posição vertical por dois minutos. Decante a solução de agitação em um novo tubo de 15 mililitros e repita o passo de agitação até que um total de 10 mililitros de criptas e tampão de agitação seja coletado.
Conte o número de criptas em 20 microlitros da suspensão sob um microscópio e dilua a amostra para obter a concentração de cinco criptas por microliter. Centrifugar a amostra de cripta a 400 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Enquanto isso, remova as pastilhas de placa e membrana de 48 poços da incubadora e coloque-a no armário de biossegurança.
Aspire a solução de revestimento usando uma pipeta P200 e deixe a placa com a tampa ligeiramente compensada até que as células estejam prontas para serem banhadas. Após a centrifugação da suspensão da cripta, remova o buffer de agitação e resuspenda a pelota intacta em três mililitros de mídia completa LWRN. Adicione 200 microliters de criptas a cada poço da placa pré-revestida de 48 poços e slide de câmara e incubar ambos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, aspire a mídia e adicione novas mídias. Geralmente, as células se tornam confluentes em 24 a 48 horas. Para as pastilhas de membrana de cultura celular, adicione 200 microliters de criptas ao topo das pastilhas e 600 microliters de mídia LWRN completa à parte inferior.
No dia seguinte, aspire a mídia e adicione mídia fresca apenas à câmara superior. Incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Meça a resistência elétrica transepitelial todos os dias usando um medidor de volt/ohm epitelial.
Após isolar as criptas de um cólon murino e verificar a concentração, a suspensão da cripta foi concentrada em cinco criptas por microliter. Poços de placas de 48 poços foram submetidos a um ensaio de ferida de arranhão ao atingir a confluência celular. Após 24 horas, observou-se reparo da ferida indicando que a cultura era saudável e viável.
Valores de nível mais elevados foram alcançados quando a mídia foi alterada de LWRN para mídia de diferenciação. Além disso, observou-se uma diminuição dos marcadores ISC e um aumento nos marcadores de diferenciação indicando que as monocamadas diferenciadas foram geradas com sucesso. Além disso, o aparecimento de subtipos de células epiteliais diferenciadas cultivadas em diferentes condições foi demonstrada pela imunofluorescência.
Ao tentar este protocolo, é importante garantir que o cólon não seja rompido em nenhum momento durante a preparação e permaneça inflado para liberar criptas em preparação extremamente limpa. Uma vez que as monocamadas de células epiteliais intestinais 2d se formam, podemos realizar ensaios de imunofluorescência, ferida de arranhão e permeabilidade e outras aplicações a jusante. Isso fornecerá conhecimento em cicatrização de feridas, migração de diferentes tipos de células e estudos de reparação epitelial e danos.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método confiável para gerar monocamadas epiteliais intestinais primárias de camundongos a partir de criptas intestinais, permitindo estudos sobre reparo de feridas e funções da barreira de permeabilidade. As principais vantagens incluem baixo consumo de meio e aplicação experimental rápida.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Mecanismos de reparação de feridas
- Estudos de migração transepitelial
Contexto
- As células epiteliais intestinais desempenham um papel essencial na função de barreira e na absorção de nutrientes.
- O estudo dessas células contribui para a compreensão das interações entre hospedeiro e patógeno.
- Modelos de cultivo celular primário são necessários para relevância fisiológica.
Métodos Utilizados
- Isolamento de criptas intestinais do cólon de camundongos.
- Cultivo em inserts de membrana e placas de 48 poços.
- Imunofluorescência e ensaios de ferimento por arranhão para avaliação funcional.
Resultados Principais
- Gerou com sucesso monocamadas confluentes para diversas análises.
- As monocamadas exibiram características saudáveis das células e diferenciação.
- Observou-se cicatrização eficaz de ferimentos e medições de resistência elétrica.
Conclusões
- O estudo estabelece uma estrutura para o uso de células epiteliais intestinais murinas primárias em pesquisas.
- Esse modelo pode facilitar avanços na descoberta de fármacos e na compreensão dos processos de reparo epitelial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a geração rápida de monocamadas epiteliais intestinais primárias de camundongos diretamente a partir de criptas, reduzindo a dependência de linhagens celulares imortalizadas e melhorando a relevância fisiológica em modelos pré-clínicos. O modelo suporta ensaios funcionais essenciais para avaliar a integridade da barreira, cicatrização de feridas e interações entre hospedeiro e patógeno na fase inicial de descoberta. Seu baixo custo, reprodutibilidade e compatibilidade com aplicações posteriores aumentam a confiança translacional na validação de alvos gastrointestinais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da função da barreira epitelial e dos mecanismos de reparo utilizando células primárias fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Oferece um sistema rápido e de baixo custo para testar os efeitos de compostos sobre a integridade e permeabilidade do monocamada.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera monocamadas confluentes adequadas para medições quantitativas de permeabilidade e resistência elétrica transepitelial (TEER).
- Valor Operacional: Permite ensaios de cicatrização por arranhão e imunofluorescência para avaliar reparo de feridas e diferenciação celular em formatos de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: As alterações nos marcadores de diferenciação confirmam a maturidade do modelo, permitindo o estudo de subtipos epiteliais e o comprometimento com a linhagem.
- Valor Operacional: Facilita a avaliação pré-clínica de candidatos a fármacos em um sistema que simula as respostas epiteliais in vivo a lesões e reparo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer uma plataforma primária baseada em células para testes de hipóteses em biologia gastrointestinal, conectando o isolamento de criptas a leituras funcionais de fenótipos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista de alvos envolvidos na homeostase epitelial, reparação e função de barreira.
- Triagem: Permite ensaios padronizados e reprodutíveis para triagem de compostos utilizando TEER e cicatrização de feridas como pontos finais quantitativos.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, incluindo valores de TEER, taxas de fechamento de feridas e intensidade de sinal de imunofluorescência para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas da pesquisa básica à validação pré-clínica por meio de monocamadas com capacidade de diferenciação que modelam respostas epiteliais humanas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de células primárias reutilizável, aplicável em múltiplos projetos nas áreas de gastroenterologia, imunologia e doenças infecciosas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir artefatos decorrentes de linhagens celulares transformadas e aprimorar a validação de alvos em contextos epiteliais nativos.
- Valor Operacional: Minimiza o consumo de reagentes e a carga de manutenção de culturas, favorecendo o uso escalável entre equipes de descoberta.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção de projetos ao fornecer leituras funcionais precoces sobre a integridade epitelial e a capacidade de reparo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em seus efeitos em um modelo fisiologicamente relevante de barreira epitelial.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas de dissecação de tecidos murinos e isolamento de criptas.
- Depende de infraestrutura e equipamentos de cultura celular estéril para medição de TER e imagem de imunofluorescência.
- Necessita padronização da concentração de criptas e densidade de semeadura entre usuários e laboratórios.
- A adaptação a tecidos humanos ou de outras espécies pode exigir otimização das etapas de dissociação enzimática e mecânica.
- A estabilidade em cultura de longo prazo e a maturação completa da diferenciação podem ser limitadas em comparação com modelos derivados de organoides.
