Name: Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a dissociar células do epitélio e mesenquima da língua de camundongos embrionários e adultos. Este protocolo produz células viáveis de alta qualidade para sequenciamento de RNA de célula única e culturas de organoides.

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Este estudo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, número de subvenção R01DC012308 e R21DC018089 para HXL. Agradecemos a Brett Marshall (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) e Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por assistência técnica e consulta sobre a dissociação celular; para Francisca Gibson Burnley (Universidade da Geórgia, Atenas, GA) para edição em inglês.

O uso de animais (C57BL/6 camundongos ao longo do estudo) foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Geórgia e esteve de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para cuidados e uso de animais para pesquisa.
1. Uso de animais
NOTA: Os camundongos foram criados e mantidos na instalação animal do departamento de Ciência Animal e Leite na Universidade da Geórgia a 22 °C sob ciclos de dia/noite de 12h.
<ol><li>Designe meio-dia do dia da detecção de plugue vaginal em camundongos como embrionário (E) dia 0,5. Use embriões em E12,5 e camundongos pós-natais com 8 semanas de idade para os seguintes experimentos.</li>
</ol>2. Preparação antes do experimento
NOTA: Os instrumentos necessários para este protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
<ol><li>Instrumentos autoclave antes do experimento. Esterilizar instrumentos usando um esterilizador de contas durante o experimento.</li>
	<li>Limpe a área cirúrgica, o microscópio de dissecação e o armário de biossegurança usando 70% de lenços de etanol. Ligue a luz UV do armário de biossegurança e mantenha-a acesa por 20 minutos antes do procedimento experimental.</li>
	<li>Prepare uma mistura enzimática de 1:1 dispase (5.0 mg/mL) e colagenase (2,0 mg/mL) para uma concentração final de 2,5 e 1,0 mg/mL, respectivamente, e filtre a solução usando filtro de seringa 0,22 μm7.<ol>
<li>Prepare 1 mL de mistura enzimápica para uma língua adulta ou 0,5 mL para uma região específica da língua (por exemplo, posterior ou língua anterior).</li>
		<li>Prepare 2 mL de mistura enzimápica para línguas embrionárias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça 10 mL de 2,5% BSA em 0,1 M PBS e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.</li>
	<li>Faça 500 μL de 5% de FBS em DMEM/F12.</li>
	<li>Faça 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA e filtre a solução usando seringa de 1 mL e filtro de seringa de 0,22 μm.</li>
</ol>3. Separação do epitélio da língua do mesenquime/tecido conjuntivo subjacente
<ol><li>Separação do epitélio do mesenquime de uma língua de rato E12.5<ol>
<li>Eutanize camundongos gestantes cronometrado carregando embriões E12,5 colocando-o em uma câmara de CO2 seguido de luxação cervical. NOTA: Os embriões de camundongos no E12.5 são coletados após as 12:00 (tarde) no 12º dia após a detecção do plugue vaginal nos camundongos gestantes.</li>
		<li>Transfira ratos para a área cirúrgica. Molhe o abdômen do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.</li>
		<li>Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam embriões. Disseque os chifres uterinos usando tesouras dissecando e transfira para 15 mL de solução fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.</li>
		<li>Dissecar os embriões (Figura 1A1) a partir de chifres uterinos sob um microscópio dissecando usando mini-tesouras e fórceps finos.</li>
		<li>Abra cuidadosamente a cavidade da boca, usando fórceps finos e dissecando a língua fora da mandíbula usando mini-tesoura(Figura 1A2).</li>
		<li>Lave as línguas usando 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm.</li>
		<li>Transfira os tecidos para 2 mL de mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) em um prato de cultura de 35 mm com espátula e fórceps finos em um armário de biossegurança. Incubar por 20 min a 37 °C.</li>
		<li>Transfira as línguas para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm e remova suavemente o mesenquime do epitélio do lado ventral usando fórceps finos. NOTA: As folhas epiteliais podem ser separadas sem força mecânica durante a incubação.</li>
		<li>Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mL de solução estéril fresca de Tyrode em um prato de cultura de 100 mm. NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Separação do epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de camundongos adultos<ol>
<li>Eutanize o rato com 8 semanas de idade colocando-o em uma câmara de CO2. Confirme se o mouse é eutanizado sem respiração e resposta de pressão dianteira.</li>
		<li>Transfira os ratos para a área cirúrgica. Molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que os peles entrem na cavidade oral.</li>
		<li>Corte os cantos da boca ao longo da bochecha usando uma tesoura dissecando para abrir a cavidade oral. Dissecar a língua com mandíbula(Figura 1B1) e coloque-a em um prato plástico com uma camada de plástico.</li>
		<li>Utilizando fórceps cirúrgicos para segurar a língua sob um microscópio dissecando, injete a mistura enzimática de dispase (2,5 mg/mL) e colagenase (1,0 mg/mL) no espaço sub-epitelial da língua através da borda de corte(Figura 1B1, setas) da língua posterior.<ol>
<li>Injete 1 mL de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido tanto da língua anterior quanto posterior.</li>
			<li>Injete 0,5 mL de mistura de enzima localmente à língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para a coleta de tecido de papila circunvaltada. NOTA: A língua vai inchar à medida que a enzima se acumula(Figura 1B2). A injeção suave da enzima pode evitar que a pressão danifique o epitélio e mantenha o máximo de enzimas possível na língua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enrole a língua com plástico e incubar a língua por 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Use mini-tesoura para dissecar a ponta da língua e/ou papila circunvaltada, e use espátula e fórceps finos para transferir tecido para 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm.</li>
		<li>Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço sub-epitelial digerido pela enzima usando mini-tesouras. Corte os tecidos em um tamanho adequado de acordo com a exigência de experimentos a jusante.</li>
		<li>Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mL de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 mm. NOTA: As atividades de dispase e colagem serão inibidas por EDTA no procedimento de dissociação celular (etapa 4.1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Dissociação celular
NOTA: O protocolo de dissociação celular descrito aqui pode ser aplicado ao epitélio da língua e ao tecido mesenquime/conjuntivo em camundongos embrionários E12,5 e 8 semanas de idade. Para reduzir a perda de celular durante a agitação e transferência de suspensão celular, use dicas comerciais de pipeta de baixa retenção ou pontas de pipeta pré-revestidas com 2,5% de BSA em 0,1 M PBS no pH 7.48.
<ol><li>Transfira os tecidos usando espátula e fórceps finos para 3 mL de 0,25% trypsin-EDTA em um novo prato de cultura de 35 mm por 30 min a 37 °C. Agitar suavemente tecidos a cada 5 minutos com pontas de pipeta de 1 mL. NOTA: Não corte a ponta da pipeta, pois a borda de corte pode danificar fisicamente as células dissociadas.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 5% de FBS no DMEM/F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de 5 mL.</li>
	<li>Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente e remova o supernasce.</li>
	<li>Suspenda suavemente as células em 3 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 1% BSA usando pontas de pipeta de 1 mL e filtre as células usando um coador de células de 70 μm, seguido por um coador de células de 35 μm.</li>
	<li>Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 8 min a temperatura ambiente. Remova a maior parte do meio e deixe 50-300 μL como o volume final para re-suspender as células. NOTA: Ajuste a concentração das células de acordo com os requisitos dos experimentos a jusante alterando o volume final de suspensão de célula única.</li>
</ol>5. Teste de contagem de células e viabilidade usando hemótmetro
NOTA: Para melhorar a precisão da medição, são recomendadas 3 réplicas técnicas para cada amostra.
<ol><li>Misture suavemente 5-10 μL da suspensão de célula única com um volume igual de azul Trypan e adicione ao hemócito. NOTA: Limpe bem o hemótmetro usando 70% de etanol antes de usar. As partículas de poeira no hemócito ficarão manchadas em azul escuro e afetarão a precisão do teste de viabilidade. Verifique o hemótmetro sob um microscópio.</li>
	<li>Conte o número total de células, o número de células vivas (brancas) e o número de células mortas (azul escuro) manchadas pelo azul Trypan(Figura 2, setas) respectivamente em 4 quadrados com 16 grades(Figura 2) usando microscópio invertido com sistema de imagem.</li>
	<li>Calcule a concentração celular: Concentração celular = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg"><ol>
<li>Calcule a viabilidade: Viabilidade = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Até o momento, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e do tecido conjuntivo/mesenquime subjacente. Este protocolo de dissociação celular atual fornece um procedimento reprodutível para gerar uma única suspensão celular com uma alta viabilidade celular (>90%) de tecidos de língua de camundongos, incluindo folhas epiteliais e tecidos mesenquime/conjuntivos em estágios embrionários e pós-natais, embora células isoladas de E12,5 e camundongos adultos sejam diferentes...

A língua dos mamíferos é um órgão complexo crítico para o sabor, fala e processamento de alimentos. É composta por vários tipos de tecidos altamente organizados compartimentados por mesenchyme/tecido conjuntivo e cobertos por uma folha epitelial estratificada contendo papilas gustativas e papilas gustativas. Populações celulares em epitélio de língua e tecido mesenquime/conjuntivo são heterogêneas. Para entender melhor as funções e distribuição de um determinado tipo de células na língua, são necessários estudos com células dissociadas. Por exemplo, o sequenciamento de RNA de célula única é um método poderoso e de alto rendimento para o perfil transcriômico em células individuais, que é projetado para entender o transcriptome de tecido complexo em uma resolução unicelular1,2,3,4. A cultura celular primária tem sido comprovadamente uma ferramenta útil para estudar a função e diferenciação de células-tronco/progenitoras para as papilas gustativas5,6. Esses estudos requerem uma grande quantidade de populações de células isoladas de alta qualidade (por exemplo, número celular total suficiente com concentração adequada e alta viabilidade).
Assim, é necessário isolar células de diferentes regiões dos tecidos linguais e em diferentes estágios de desenvolvimento. Atualmente, não há um protocolo detalhado disponível para dissociação celular a partir do epitélio da língua e tecido mesenquime/conjuntivo subjacente. Aqui, relatamos um método otimizado de dissociação celular para preparar células para experimentos que requerem uma alta qualidade de células vivas, como para sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Descobrimos que a seleção de tampão de digestão enzimática, pipetação suave, seleção de meio de resuspensão e tempo e velocidade de centrifugação ideais são cruciais para gerar essas grandes quantidades de células de alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongo (C57BL/6J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>colagenase (Collagenase A)</td>Placa de cultura <td>10103586001</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(35 mm de diâmetro)</td><td>Placa de cultura Genesee Scientific</td><td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>(100 mm de diâmetro)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>dispase (Dispase II)</td>Tesoura de dissecação <td>de 04942078001</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>(Tesoura Fina de Estudante)</td><td>Encontre a Ferramenta Científica</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal (FBS)</td>Pinça <td>fina de C838U82</td><td></td> <td>Hyclone</td></tr><tr><td>(Dumount #3 Forceps)</td><td>Encontre a Ferramenta Científica</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>microscópio invertido com sistema de imagem (EVOS XL Core Cell Imaging System)</td><td>Pontas</td> de pipeta <td>de baixa retenção AMEX1000</td><td></td>Life</tr><tr><td></td><td>Technologies Mini-tesoura 17014342</td><td></td><td></td>METTLER TOLEDO</tr><tr><td>(Tesoura de Mola Evo)</td><td>Ferramenta de Ciência Fina</td><td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>urdidura de plástico</td><td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>espátula (Moria Spoon)</td><td>Fine Science Tool</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>pinça cirúrgica (Dumount #2 Laminectomy Forceps)</td><td>Fine Science Tool</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s solução</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2145-10L</td><td>feita de sais de Tyrode</td></tr><tr><td>0,25% typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Hoefer</td><td>33946</td><td>feita de 1 M PBS</td></tr><tr><td>0,22-&mu; filtro de seringa m</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>feito de 100% etanol</td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga de baixa ligação de 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>agulha 30-G</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; filtro de célula m</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

dissociação celular do epitélio da língua e mesenquime/tecido conjuntivo de ratos embrionários 12,5 e 8 semanas

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

A dissociação celular tem sido um procedimento essencial para estudos no nível de células individuais e/ou a nível de população celular (por exemplo, sequenciamento de RNA de células únicas e cultura celular primária). Produzir células viáveis e saudáveis em grandes quantidades é crítico, e as condições ideais para fazê-lo são dependentes de tecidos. As populações celulares no epitélio da língua e no tecido mesenquime/conjuntivo subjacente são heterogêneas e as estruturas teciduais variam em diferentes regiões e em diferentes estágios de desenvolvimento. Testamos protocolos para isolar células do epitélio da língua do rato e do tecido mesenquime/conjuntivo nas fases de desenvolvimento inicial [dia embrionário 12.5 (E12.5)] e jovens adultos (8 semanas). Uma separação limpa entre o epitélio e o tecido mesenquime/conjuntivo subjacente foi fácil de realizar. No entanto, para processar e isolar ainda mais as células, produzir células saudáveis viáveis em grandes quantidades, e seleção cuidadosa de tampão de digestão enzimática, tempo de incubação e velocidade e tempo de centrifugação são críticos. Incubação de epitélio separado ou tecido conjuntivo/mesenquime subjacente em 0,25% Trippsin-EDTA por 30 min a 37 °C, seguido por centrifugação a 200 x g por 8 min resultou em um alto rendimento de células a uma alta taxa de viabilidade (>90%) independentemente dos estágios do rato e regiões da língua. Além disso, descobrimos que tanto células epiteliais dissociadas quanto mesenquimais/conjuntivas de línguas embrionárias e adultas poderiam sobreviver no meio baseado na cultura celular por pelo menos 3 h sem uma diminuição significativa da viabilidade celular. Os protocolos serão úteis para estudos que requerem a preparação de células isoladas de línguas de camundongos em estágios de desenvolvimento precoce (E12,5) e jovens adultos (8 semanas) que requerem dissociação celular de diferentes compartimentos teciduais.

Separação do epitélio da língua do tecido mesenquime/conjuntivo subjacente Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço sub-epitelial é visível após a digestão adequada da enzima. Folhas epiteliais de algumas línguas são separadas sem força mecânica durante a incubação.
Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas (Figura 1B2), o que sugere que a enzi...

Desenvolvemos um protocolo generalizado para dissociar uma grande quantidade de células únicas de alta qualidade a partir do epitélio e mesenquime/tecido conjuntivo de línguas de camundongos embrionários e adultos.

Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Alto rendimento e qualidade das células de tecidos complexos são essenciais para análises experimentais comumente utilizadas, como sequenciamento de RNA de células únicas e culturas primárias de células-tronco. Este protocolo gera células saudáveis de alto rendimento e qualidade de diferentes regiões e compartimentos teciduais da língua mamífera, incluindo epitélio de língua e tecido conjuntivo. Para separar o epitélio do mesenquime de uma língua de rato E 12,5, transfira o rato gestante eutanizado para a área cirúrgica e molhe o abdômen do rato com 70% de etanol para evitar que a pele entre no local de operação.Abra o abdômen usando uma tesoura dissecando para expor os chifres uterinos que carregam os embriões, dissecar os chifres uterinos e transferi-los para 15 mililitros de solução de Tyrode fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Sob um microscópio dissecando, use mini tesoura e fórceps finos para dissecar os embriões dos chifres uterinos. Abra a cavidade bucal com os fórceps finos e disseca a língua da mandíbula usando mini tesoura.Lave as línguas com 15 mililitros de solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Em seguida, transfira os tecidos para dois mililitros de uma mistura enzimática de dispase e colágeno em um prato de cultura de 35 milímetros e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius. Transfira as línguas para 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco e separe suavemente o mesenquime e o epitélio do lado ventral usando fórceps finos.Lave a epitélio separada e mesenquime duas vezes em 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco. Para separar o epitélio da língua do tecido conjuntivo subjacente de um rato adulto, transfira o rato eutanizado para a área cirúrgica e molhe a cabeça do rato usando 70% de etanol para evitar que a pele entre na cavidade oral. Use uma tesoura dissecando para cortar os cantos da boca ao longo da bochecha para abrir a cavidade oral.Dissecar a língua com uma mandíbula, lave-a e coloque-a em um prato de plástico com uma camada de plástico. Usando fórceps cirúrgicos para segurar a língua, injete a mistura enzimática de dispase e colagem no espaço subepitelial da língua através da borda de corte da língua posterior. Injete um mililitro de mistura enzimada uniformemente na língua inteira para coleta de tecido, em seguida, injete 0,5 mililitros de mistura de enzima localmente para a língua anterior para coleta de tecido da ponta da língua ou para a língua posterior para coleta de tecido de papila circunvaltada.Enrole a língua com plástico e incuba-a por 30 minutos a 37 graus Celsius. Use mini tesoura para dissecar a papila circunvaltada e a ponta da língua. Em seguida, transfira um tecido para 15 mililitros de solução estéril fresca de Tyrode.Separe o epitélio do tecido conjuntivo subjacente no espaço subepitelelial digerido da enzima usando mini tesoura e corte os tecidos em um tamanho adequado, de acordo com a exigência de experimentos a jusante. Lave o epitélio separado e o tecido conjuntivo subjacente duas vezes em 15 mililitros da solução de Tyrode estéril fresco em um prato de cultura de 100 milímetros. Transfira os tecidos para três mililitros de 0,25% de trippsina EDTA em um novo prato de cultura de 35 milímetros.Incubar o prato por 30 minutos a 37 graus Celsius, agitando suavemente os tecidos a cada cinco minutos com uma ponta de pipeta mililitro. Adicione 500 microliters de 5%FBS no DMEM F12 para parar a reação e transfira o meio para um tubo de centrífuga de baixa ligação de cinco mililitros. Centrifugar a suspensão da célula a 200 vezes G durante oito minutos em temperatura ambiente e remover o supernatante.Resuspenque suavemente as células em três mililitros de DMEM F12 contendo 10% FBS e 1%BSA, e filtre as células com um coador de células de 70 micrômetros, seguido por um filtro de células de 35 micrômetros. Centrifugar a suspensão celular a 200 vezes G durante oito minutos em temperatura ambiente, em seguida, remova a maior parte do meio, deixando 50 a 300 microliters como o volume final para resuspend as células. Na língua do rato embrionário, uma lacuna no espaço subepiteliol é visível após a digestão adequada da enzima.Na língua do rato adulto, uma injeção de enzima bem sucedida é indicada pelo inchaço nas áreas injetadas, o que sugere que a enzima pode ser mantida pela língua. Após a junção das folhas epiteliais e camadas finas de mesenquime, a contagem manual de células demonstrou que o protocolo produziu 63.917 células no total com uma viabilidade de 95,2% das folhas epiteliais, e 294, 333 células no total com uma viabilidade de 96,3% do mesenquime. Quando 10 línguas adultas com oito semanas de idade foram usadas, o protocolo rendeu 187.333 células com viabilidade de 95,4% de folhas epiteliais da ponta da língua, 544.000 células com uma viabilidade de 96,3% de folhas epiteliais de papilas circunvaloladas, e 150,500 células com uma viabilidade de 93% de tecidos conjuntivos.Seguindo este protocolo, as células dissociadas podem ser usadas para sequenciamento de RNA de células únicas e cultura organoide de teste 3D para definir células progenitoras de teste não reconhecidas sob o epitélio lingual.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas...

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Neste vídeo, descrevemos o isolamento de células epiteliais de uma língua murina. Essas células podem ser cultivadas posteriormente para dar origem a colônias de células.

Isolamento e cultura de células epiteliais da língua murina: um procedimento para isolar e cultivar células epiteliais da língua a partir de modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a preparação da matriz extracelular da língua murina usando o método de descelularização, que envolve a exposição da língua colhida a uma série de tratamentos físicos, químicos e enzimáticos. O andaime TEM resultante retém sua composição de matriz extracelular nativa, removendo os componentes celulares.

Fabricação de Matriz Extracelular a partir de Modelo de Camundongo: Um Procedimento Eficaz para Preparar Matriz Extracelular de Língua Descelularizada a partir de Língua Murina

Neste vídeo, descrevemos o isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) de uma língua murina.

Isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) do modelo de camundongo: um procedimento enzimático para separar o epitélio da CVP da língua do camundongo

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e cultivar células primárias do córtex cerebral do telencéfalo dorsolateral de embriões de camundongos.

Isolamento e Cultura de Células de Telencéfalos Dorsolaterais de Embriões de Camundongos

Um protocolo para a separação da ectoderme embrionária facial e mesênquima é descrito. Usamos Dispase II para tratar embriões inteiros primeiro, dissecar todo proeminências faciais, e então separar o ectoderma facial e mesênquima.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

Apresentamos um protocolo de isolamento e cultura de células mesenquimais palatinas embrionárias primárias para imagens de lapso de tempo de crescimento bidimensional (2D) e ensaios de reparação de feridas. Também fornecemos a metodologia para análise dos dados de imagem de lapso de tempo para determinar a formação de fluxo celular e a motilidade direcional.

Isolamento e imagem de lapso de tempo das células mesenquima palatinas embrionárias do camundongo primário para analisar atributos de movimento coletivo

O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.

Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

Aprenda a dissociar células do epitélio e mesenquima da língua de camundongos embrionários e adultos. Este protocolo produz células viáveis de alta qualidade para sequenciamento de RNA de célula única e culturas de organoides.

Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

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