Name: Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a visualizar e quantificar danos de DNA específicos do local usando imunofluorescência e ChIP em células U2OS. Estas técnicas complementares permitem analisar a dinâmica espacial e temporal das proteínas de reparo.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, que concede GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, a Bolsa de Pesquisa János Bolyai da Academia Húngara de Ciências BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, bolsa de curto prazo da EMBO 8513 e a Fundação Tempus.

1. Imunodeseção de proteínas específicas
<ol><li>Preparação da cultura celular e configuração experimental
	<ol>
<li>Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM de glutamina e 1% solução antibiótico-antimicomolética. NOTA: Para indução de dano de DNA à base de endonuclease, use meio tratado com carvão ou sem esteroides para evitar vazamentos no sistema.</li>
		<li>Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de CO2 a 37 °C até 80% de confluência, renovando o meio a cada 2-3 dias.</li>
		<li>Aspire o meio e lave as células com 1x PBS. Desapegar células com solução Trypsin-EDTA. Quando as células se desprendem, pare a atividade de trippsina adicionando meio de cultura às células, gerando uma suspensão celular.</li>
		<li>Conte as células usando uma câmara de contagem de células. Placa 2 x 104 células/mL/bem em uma placa de 24 poços, com tampas redondas estéreis de 12 mm em cada poço.</li>
		<li>Incubar células por 24 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 para permitir o apego às tampas.</li>
		<li>Trate as células com 10 ng/mL de neocarzinostatina (NCS) ao canalizar diretamente o agente nocivo para o meio cultivado. Incubar as células com o meio contendo NCS por 15 minutos, depois lavá-las com 1x PBS e adicionar meio de cultura fresco e suplementado às células. Caso contrário, use o agente apropriado (ou seja, 4-OHT) para induzir DSBs através de sistemas baseados em endonuclease sem atualizar o médio22. NOTA: Alternativamente, use a irradiação para induzir danos ao DNA, variando de 30 min até 8h de tempo de recuperação usando fluxo de nêutrons entre 2-20 Gy23.</li>
		<li>Incubar células por 1-8 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 para seguir a cinética da reparação de DNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação de células NOTA: 300-500 μL de soluções/poços devem ser usados nas seguintes etapas (etapas 1.2-1.5) para cobrir todas as células adequadamente. Cada etapa de incubação e lavagem (exceto a incubação de anticorpos) deve ser realizada em um agitador orbital com agitação suave.<ol>
<li>Após a indução e incubação de células do DSB, remova o meio das células anexadas e lave as células uma vez com 1x PBS.</li>
		<li>Fixar células com solução de 4% de formaldeído-PBS por 20 min a 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Permeabilização das células
	<ol>
<li>Remova a solução de fixação e lave as células três vezes com 1x PBS por 5 minutos cada.</li>
		<li>Remova o PBS e adicione 0,2% Triton X-100 dissolvido em PBS. Incubar as amostras por 20 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio de sites de vinculação não específicos
	<ol>
<li>Lave as células três vezes com 1x PBS.</li>
		<li>Bloqueie locais de ligação não específicos com 5% de BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) diluído em PBST (1x PBS complementado com 0,1% Tween-20), e incubar as amostras permeabilizadas por pelo menos 20 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração de imunofluorescência
	<ol>
<li>Adicione a quantidade adequada de anticorpos primários (ou seja, anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) diluídos em 1% de solução BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cabeça para baixo em um filme de parafina sobre uma gota de 10 μL do anticorpo anti-γH2AX diluído. NOTA: No caso de co-imunostensão diluir adequadamente ambos os anticorpos na mesma solução BSA-PBST de 1%.</li>
		<li>Incubar as amostras em uma câmara de umidade por 1,5 h a 4 °C. NOTA: A incubação também pode ser realizada a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Coloque as tampas de volta sendo lateral para cima na placa de 24 poços e lave três vezes por 5 min com 1x PBS.</li>
		<li>Adicione a quantidade adequada de anticorpos secundários diluídos em 1% BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cabeça para baixo em um filme de parafina sobre uma gota de 10 μL do anticorpo diluído.</li>
		<li>Incubar as amostras em uma câmara de umidade a 4 °C por 1 h.</li>
		<li>Coloque as tampas de volta sendo lateral para cima na placa de 24 poços e lave três vezes por 5 min com 1x PBS.</li>
		<li>Antes de remover a última solução de lavagem PBS, retire delicadamente as tampas usando uma pinça e uma agulha e, em seguida, coloque-as de cabeça para baixo em lâminas de vidro com gotículas de meio de montagem (suplementadas com DAPI). NOTA: Evite a formação de bolhas de ar. Quando o meio de montagem seca, recomenda-se selar as bordas das tampas com esmalte para evitar o encolhimento das amostras.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imunoprecipitação de cromatina
<ol><li>Coleta celular, crosslinking, lise celular e nuclear e fragmentação de DNA
	<ol>
<li>Cultura aproximadamente 5 x 106 células/mL em um prato de 150 mm para cada amostra.</li>
		<li>Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com 1x pbs gelado.</li>
		<li>Fixar as células com 1% de solução formaldeído-PBS, colocar as placas em um agitador orbital e agitar suavemente por 20 minutos. NOTA: O formaldeído é volátil; sempre prepare uma nova solução de trabalho. Em alguns casos, a solução de formaldeído contém metanol para estabilizá-lo, mas é melhor usar uma solução livre de metanol para evitar interferências com reações a jusante.</li>
		<li>Pare a fixação com 125 mM de glicina e incuba em um agitador orbital com agitação suave por 5 min a 25 °C.</li>
		<li>Coloque as placas no gelo e lave duas vezes com 1x PBS gelado.</li>
		<li>Raspe as células em 1x PBS gelado e transfira-as para tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugar as células a 2.500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire cuidadosamente o supernasciente e resuspenque a pelota em 2 mL de tampão de lise celular [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (coquetel inibidor de protease)] e incubar no gelo por 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão da célula a 2.500 x g por 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte cuidadosamente o supernasciente e resuspenque a pelota em 500-1.500 μL de tampão de lise nuclear (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,8% SDS, 1x PIC) e incubar no gelo por 30-60 min. Transfira o lise para um tubo cônico de poliestireno adequado para a sônicação. NOTA: Uma vez que o tampão de lise nuclear contém SDS, ele precipitará no gelo, e a solução ficará branca. A solução deve tornar-se transparente após a sônicação.</li>
		<li>Sonicar o lise para cisalhamento dna para um tamanho médio de fragmento de 300-1.000 bp. NOTA: Os ciclos e condições de sônica apropriadas devem ser definidos de acordo com o tipo de célula e o equipamento de sônica. Fragmentos menores que 200 bp não são adequados para ChIP, porque as interações nucleossomo-DNA podem ser interrompidas.</li>
	</ol></li>
	<li>Reversão do crosslinking, determinação dos tamanhos de fragmentos sonicados
	<ol>
<li>Tire 100 μL da amostra sonicada para verificar o tamanho do fragmento da cromatina sônica. O restante da cromatina deve ser armazenado a −80 °C.</li>
		<li>Adicione 0,5 mg/mL RNase A a cada 100 μL da amostra e incuba-os a 37 °C por 20 min para ativar o RNase.</li>
		<li>Incubar as amostras a 65 °C durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, adicione 500 μg/mL de Proteinase K e 0,5% SDS, e incubar as amostras a 50 °C por 3h.</li>
		<li>Adicione 0,5 volume de fenol e 0,5 volume de mistura de álcool clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.</li>
		<li>Vórtice por 1 min.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Adicione 1 volume de mistura de clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.</li>
		<li>Vórtice por 1 min.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Adicione 2,5 volumes de 96% de etanol e 0,1 volume de 3 M de PH na-acetato 5,2.</li>
		<li>Incubar por pelo menos 20 min a −80 °C.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire o etanol e lave a pelota com 400 μL de 70% de etanol.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire o etanol e o ar seque a pelota.</li>
		<li>Resuspend a pelota em 10 μL de TE.</li>
		<li>Execute as amostras em um gel de 0,8% de agarose. O tamanho da cromatina sônica deve ser de cerca de 500 bp. NOTA: Use tampão de carregamento livre de bromofenol azul porque o tamanho deste corante é de aproximadamente 500 bp, o que pode perturbar a detecção adequada de fragmentos de cromatina. Em vez disso, recomenda-se usar tampão de carga complementado com xileno-cianola, que é de aproximadamente 3.000 bp.</li>
		<li>Se o tamanho da cromatina for aceitável, dilui as amostras de cromatina congelada da etapa 2.1. em 3 volumes de tampão de diluição (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) e misture as amostras via rotação por 10 min a 4 °C. NOTA: Esta etapa é necessária para diluir o SDS presente no tampão de lise nuclear para evitar interferências com reações a jusante, incluindo a medição da concentração de cromatina.</li>
		<li>Meça a concentração de DNA das amostras de cromatina em 260/280 nm usando um espectrofotômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de contas, pré-limpeza e imunoprecipitação
	<ol>
<li>Prepare contas (anti-coelho ou IgG de camundongos) para as etapas de pré-limpeza e imunoprecipitação. Lave contas duas vezes por 10 min a 4 °C com tampão RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl e 1X PIC).</li>
		<li>Resuspenha as contas no mesmo volume do buffer RIPA da etapa 2.3.1.</li>
		<li>Pré-claro 25-30 μg chromatina de cada amostra com 4 μL das contas via rotação para 1-2 h a 4 °C. NOTA: Adicione o buffer RIPA a cada amostra de cromatina até 500 μL de volume final para deixar as amostras se misturarem adequadamente sob rotação. Não se esqueça de tirar cromatina para NAC (No Antibody Control) e TIC (Total Input Control) no caso de cada conjunto amostral. Os TICs exigem apenas um volume final de até 200 μL.</li>
		<li>Precipitar as contas com um ímã e transferir o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Adicione a quantidade apropriada de anticorpo a cada amostra de cromatina (exceto NAC e TIC) e gire durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, adicione 40 μL de contas lavadas a cada amostra (exceto TIC) e incuba-as durante a noite, girando a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavagem
	<ol>
<li>Lave uma vez com 300 μL de tampão de sal baixo (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) por 10 min via rotação a 4 °C.</li>
		<li>Lave uma vez com 300 μL de tampão de sal alto (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) por 10 min via rotação a 4 °C.</li>
		<li>Lave uma vez com 300 μL de tampão LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) para 10 min via rotação a 4 °C.</li>
		<li>Lave duas vezes com 300 μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) para 10 min via rotação, para a primeira lavagem a 4 °C, e a segunda lavagem a 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Eluição
	<ol>
<li>Adicione 200 μL do tampão de elução (1% SDS e 100 mM NaHCO3) às contas e incubar a 65 °C em um termelétrica por 15 minutos com agitação contínua (aproximadamente 400 RPM). Transfira o supernatante para um novo tubo e contas elute novamente em 200 μL de tampão de Elução. Combine eluatos (volume final de 400 μL).</li>
		<li>Adicione NaCl a uma concentração final de 200 mM em cada amostra. Suplemente as amostras TIC com 200 μL de tampão de elução e adicione NaCl também. NOTA: A partir desta etapa, a TIC deve ser tratada nas mesmas condições das outras amostras.</li>
		<li>Incubar as amostras a 65 °C (sem tremer) por pelo menos 6 h.</li>
		<li>Adicione 1 mL de etanol frio 100% a cada amostra, gire os tubos duas vezes para misturar e precipitar o DNA durante a noite a −80 °C.</li>
		<li>No dia seguinte, centrífuga por 30 min a 13.000 x g a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o supernasce e lave a pelota com 70% de EtOH.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte o supernatante e o ar seque as pelotas.</li>
		<li>Resuspenque as pelotas em 100 μL de TE e adicione 0,5 mg/mL de RNase A a cada amostra. Incubar a 37 °C por 20 min para ativar o RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Reversão do crosslinking
	<ol>
<li>Adicione 500 μg/mL de Proteinase K e 0,5% SDS e incuba as amostras a 50 °C por 2 h. NOTA: Se seguir para ChIP-seq, evite a extração fenol-clorofórmio, pois inibe o processo de NGS a jusante. Em vez disso, recomenda-se usar um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Adicione 0,5 volume de fenol e 0,5 volume de mistura de clorofórmio-isoamil (24:1) a cada amostra.</li>
		<li>Vórtice por 1 min.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Adicione 1 volume de mistura de clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.</li>
		<li>Vórtice por 1 min.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.</li>
		<li>Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de DNA
	<ol>
<li>Adicione 2,5 volumes de 96% de etanol e 0,1 volume de 3 M de PH na-acetato 5,2.</li>
		<li>Incubar por pelo menos 20 min a −80 °C.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire o etanol e lave a pelota com 400 μL de 70% de etanol.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire o etanol e o ar seque a pelota.</li>
		<li>Resuspend a pelota em 50 μL de TE.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitylation-Mediated+Fine-Tuning+of+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair.</a> Cancers (Basel). 12 (6), (2020).</li>
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</ol>

Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está se expandindo rapidamente com a ajuda de vários métodos bioquímicos e microscópicos. Preservar informações genéticas é crucial para as células, uma vez que mutações que ocorrem em genes envolvidos em processos de reparação estão entre as principais causas da tumorigênese e, portanto, elucidar os passos-chave das vias de reparação do DNA é essencial.
Técnicas bioquímicas (ou seja, mancha ocidental...

Nosso genoma está constantemente sendo desafiado por vários agentes prejudiciais ao DNA. Esses ataques podem derivar de fontes ambientais, como luz UV ou irradiação, bem como de fontes endógenas, como subprodutos metabólicos causados por estresse oxidativo ou erros de replicação1,2. Essas lesões podem afetar a integridade de um ou ambos os fios de DNA, e se os erros gerados se tornarem persistentes, muitas vezes levam a translocações e instabilidade do genoma, o que pode resultar em tumorigênese3,4. Para manter a integridade do genoma, vários sistemas de reparo foram desenvolvidos durante a evolução. De acordo com as propriedades químicas e físicas de tipos específicos de dano de DNA, múltiplos mecanismos de reparação podem ser ativados. Incompatibilidades, locais abasic, quebras de fios únicos e 8-oxoguanina (8-oxoG) podem ser removidos por reparo de incompatibilidade ou via de reparo de excisão base5,6. Lesões causadas por fotoprodutos induzidos por UV e adutos volumosos podem ser reparadas pelo reparo nucleotídeo-excisão (NER) ou pelo processo de quebra de dois fios (DSBR) de DNA7,8. O NER consiste em duas subseções principais: NER (TC-NER) e NER genômica global (GG-NER). Em relação à fase do ciclo celular, após a indução de quebra de duplo fio do DNA, duas subsomidas podem ser ativadas: junção final não homólogo (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)1,9. O NHEJ, que é o caminho dominante nas células de descanso, pode ser ativado em todas as fases do ciclo celular, representando uma via mais rápida, mas propensa a erros10. Por outro lado, o RH é uma via livre de erros, na qual os DSBs são reparados com base na pesquisa seqüencial-homologia dos cromátides irmãs, portanto está presente principalmente nas fases de ciclo celular S e G211. Além disso, a junção final mediada pela microhomologia (MMEJ) é outro mecanismo de reparo DSB, distinto dos mencionados, baseado em uma maneira ku70/80 e RAD51 independente de religação de sequências microhomologos anteriormente resseccionadas flanqueando as extremidades de DNA quebradas. Portanto, o MMEJ é considerado propenso a erros e altamente mutagênico12. Durante o reparo do DNA, os DSBs podem induzir a resposta a danos de DNA (DDR), que resulta na ativação de quinases de ponto de verificação que param o ciclo celular durante o reparo13,14,15. O DDR é ativado como resposta ao recrutamento e ampla disseminação dos principais atores iniciadores do processo de reparo em torno das lesões, contribuindo para a formação de um foco de reparo. Nesta cascata de sinalização inicial, o ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) quinase desempenha um papel fundamental ao catalisar a fosforilação da variante histone H2AX em Ser139 (referida como γH2AX) em torno da lesão16. Este evento inicial é responsável pelo recrutamento de fatores adicionais de reparo e pelo início de processos de reparo a jusante. Embora a função exata das proteínas recrutadas no foco de reparo ainda não tenha sido totalmente caracterizada, a formação e a dinâmica dos focos de reparação têm sido investigadas por diversos laboratórios. Estes marcadores são amplamente usados para seguir a cinética de reparo, mas seu papel preciso durante o processo de reparo permanece indescritível. Devido à grande importância, mas má compreensão dos processos celulares relacionados à reparação de DNA, vários métodos foram desenvolvidos até agora para induzir e visualizar o DDR.
Vários métodos e sistemas foram estabelecidos para induzir o tipo desejado de dano de DNA. Por exemplo, alguns agentes [como neocarzinostatina (NCS), fleomicina, bleomicina, γ-irradiação, UV] podem induzir um grande número de quebras aleatórias de DNA em posições genômicas não preditivas, enquanto outras (endonucleases, como AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, bem como tira laser) podem induzir quebras de DNA em loci genômica conhecida17,18,19,20,21. Aqui, focamos nas técnicas baseadas em endonuclease atualmente utilizadas para estudar o DDR em células de mamíferos e leveduras. Além de destacar os princípios dessas técnicas, enfatizamos suas vantagens e desvantagens.

<table><tbody><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótica-Antimicótica (100&vezes;), Estabilizado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gama H2A. Anticorpo X (fosfo S139)</td><td>Abcam</td><td>ab26350</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Fração V albumina</td><td>Biosera</td><td>PM-T1725</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt&trade; Tampão de Carregamento Ciano/Amarelo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10482035</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com 1.0 g/L de Glicose, sem L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>12-707F</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; M-280 Ovelha Anti-Rato IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&trade; M-280 Ovino Anti-Coelho IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11204D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Molar Chemicals</td><td>02910-101-340</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (Origem da América do Sul), aprovado pela UE</td><td>Gibco</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído a 37% livre de ácido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.03999</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade; Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>IPure kit v2</td><td>Diagenode</td><td>C03010015</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isoamílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Na-DOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin de Streptomyces carzinostaticus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>PBS Pó sem Ca2+, Mg2+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L182-50-BC</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>TUBOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 20 (Tween 20)</td><td>Molar Chemicals</td><td>09400-203-190</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Prolong&trade; Mountant Antifade do ouro com DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Cocktail Inibidor de Protease I</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>P-S2056 DNAPKcs anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab18192</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Roche</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>CH3COONa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris acetato-EDTA tampão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91228</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Molar Chemicals</td><td>09370-006-340</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina do pâncreas suíno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando e quantificando danos de dna específicos do local baseados em endonuclease

Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage

As células são continuamente expostas a vários agentes prejudiciais ao DNA, induzindo diferentes respostas celulares. A aplicação de abordagens bioquímicas e genéticas é essencial para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Nos últimos anos, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local. Além disso, novas técnicas seminais nos permitem estudar esses processos no nível de resolução unicelular usando células fixas e vivas. Embora essas técnicas tenham sido utilizadas para estudar vários processos biológicos, aqui apresentamos os protocolos mais amplamente utilizados no campo da reparação de DNA, Fluorescence Imunostaining (IF) e Chromatin Imunoprecipitation (ChIP), que em combinação com danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease possibilitam visualizar e quantificar a ocupação genômica de fatores de reparação de DNA de forma direcionada e regulamentada, respectivamente. Essas técnicas fornecem ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para sua regulação de ajuste fino durante a reparação do DNA.

Estudar processos de reparo induzidos pelo DSB direcionados ao local nas células pode ser alcançado através de transfecção estável ou transitória. No entanto, deve-se notar que a transfecção estável garante uma população celular homogênea, o que dá uma resposta celular unificada e, portanto, mais confiável. No caso da transfecção transitória, apenas uma pequena proporção da população celular ocupa e mantém o plasmídeo, o que introduz a diversidade no experimento. Estabelecer sistemas celulares baseados em endonuclease ER...

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Cells are continuously exposed to various DNA damaging agents, inducing different cellular responses. Applying biochemical and genetic approaches is ...

Este vídeo de metodologia introduz as etapas cruciais dos protocolos de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina regularmente usados para estudar o processo celular relacionado ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA. Esta técnica fornece ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para a regulação afinada durante a reparação do DNA. Uma vez que essas técnicas podem ser aplicadas para estudar diferentes processos celulares, elas têm potencial relevância se uma microirradição a laser ou o DNA baseado em núcleo danificar sistemas de indução são usados.Recentemente, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local que podem ser usados para estender nossa compreensão da reparação de DNA. Aplicando abordagens bioquímicas e genéticas, esses utensílios são essenciais para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Além disso, essas técnicas permitem o estudo desses processos em resolução de células únicas utilizando células fixas e vivas.Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro 10% fetal, 2 glutamina milimililar, e a solução antimycótica 1%. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono a 37 graus até que 80% de confluência seja alcançada, renovando o meio a cada dois ou três dias. Aspire o meio e lave as células com PBS.Desapegar células com solução Trypsin-EDTA. Quando as células se desprendem, pare a atividade da trippsina adicionando mídia cultural às células, gerando uma suspensão celular. Conte as células usando uma câmara de contagem de células.Placa 20.000 células por mililitro por poço na placa de 24 poços com deslizamentos de cobertura redondas estéreis de 12 milímetros em cada poço. Incubar células por 24 horas a 37 graus em um ambiente umidificado de dióxido de carbono de 5% para permitir a fixação nos deslizamentos de cobertura. Trate as células com 10 nanogramas por neocarzinostatina mililitro ou use o método apropriado para induzir quebras de dois fios através de sistemas baseados em endonucleusa.Incubar células por uma a oito horas a 37 graus em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono para seguir a cinética do reparo do DNA. Fixar células com solução PBS de 4% de formaldeído por 20 minutos a 25 graus. Remova a solução de fixação e lave as células três vezes com PBS por cinco minutos cada.Retire o PBS e adicione 0,2% Triton X dissolvido em PBS. Incubar as amostras por 20 minutos. Lave as células três vezes com PBS.Bloqueie a ligação não específica com 5% de BSA diluída no BSA-PBST e incubar as amostras por pelo menos 20 minutos. Adicione a quantidade adequada de anticorpo primário diluído na solução 1%BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em um parafilme ou 10 gotículas de microliter do anticorpo diluído.Incubar as amostras em uma câmara de umidade por uma hora e meia a quatro graus. Coloque a tampa deslizando para trás sendo lateral para cima na placa de 24 poços e a lavagem três vezes com PBS. Adicione a quantidade adequada de anticorpos secundários diluídos em 1%BSA-PBST.Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em parafilm sobre uma gotícula de 10 microliter do anticorpo diluído. Incubar as amostras em uma câmara de umidade a quatro graus por uma hora. Coloque os deslizamentos de cobertura para trás sendo configurado na placa de 24 poços e lave três vezes com PBS.Antes da remoção da última solução de lavagem PBS, retire delicadamente os deslizamentos de cobertura com a metade da pinça e da agulha e, em seguida, coloque-os de cabeça para baixo sobre as lâminas de vidro com gotículas de meio de montagem. A imunoprecipitação de cromatina é uma técnica amplamente utilizada para identificar padrões de ligação de proteínas ao DNA. Para revelar a ocupação de uma proteína de reparação de desejo ao redor do DSB, um anticorpo específico é usado para imunoprecipitar a proteína de interesse da preparação da cromatina juntamente com a região de DNA à qual está ligada.Além disso, o ChIP tem sido comumente aplicado para mapear a presença de modificações pós-translacionais específicas em uso por DSBs em um determinado lócus genômico. Aproximadamente 20 milhões de células por mililitro devem ser cultivadas em um prato de 15 centímetros para cada amostra. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado.Fixar as células com solução 1%formaldeído-PBS. Coloque a placa em um agitador orbital e agitar suavemente por 20 minutos. Pare a fixação com glicina para alcançar uma concentração final de 125 milimilhas e incubar em um agitador orbital com agitação suave por cinco minutos a 25 graus.Coloque a placa no gelo e lave duas vezes com PBS gelado. Raspe as células em PBS gelado e transfira-as para tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugar as células a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus.Aspire cuidadosamente o supernasciente e resuspense a pelota em dois tampão de lise celular mililitro e incubar no gelo por 10 minutos. Centrífuga a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus. Descarte cuidadosamente o supernascer e resuspenque a pelota em 500 a 1.500 tampão de lise nuclear microliter e incubar no gelo por 30 a 60 minutos.Transfira o lise para um tubo cônico de poliestireno adequado para a sônicação. Sonicar o lise para cisalhamento do DNA para um tamanho médio de fragmento de 300 a 1000 pares de base. Prepare as dínas para as etapas de pré-limpeza e imunoprecipitação.Lave as contas duas vezes por 10 minutos a quatro graus com tampão RIPA. Resuspend Dynabeads no mesmo volume de buffer RIPA que você tirou da solução de estoque original nas etapas 3.1. Pré-claro 25 a 30 microgramas de cromatina de cada amostra com quatro dynabeads microliter via rotação por uma a duas horas a quatro graus.Precipitar as Dynabeads com um ímã e transferir o supernatante para um novo tubo Eppendorf. Adicione a quantidade apropriada de anticorpo a cada amostra de cromatina e gire durante a noite a quatro graus. No dia seguinte, adicione 40 microlitos de Dínamos lavados a cada amostra e incuba-as durante a noite girando a quatro graus.Lave uma vez com 300 tampão de sal baixo por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de sal de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de cloreto de lítio de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus.Lave duas vezes com 300 microliter TE por 10 minutos com rotação para a primeira lavagem a quatro graus e a segunda lavagem a 25 graus. Adicione 200 tampão de eluição de microliter às contas e incuba-as a 65 graus em um termelétrica por 15 minutos com agitação contínua. Transfira o supernatante para um novo tubo e contas elute novamente em 200 tampão de eluição de microliter.Adicione 500 microgramas por mililitro proteinase-K e meio por cento de SDS e incubar as amostras a 50 graus por duas horas. Realize a extração de clorofórmio e transfira a fase superior aquosa para um novo tubo Eppendorf. Adicione dois volumes e meio de etanol absoluto e 0,1 volume três acetato de sódio molar pH 5.2.Incubar por pelo menos 20 minutos a menos 80 graus. Retire o etanol e o ar seque a pelota. Resuspend a pelota em 50 microliter TE. Para estudar sua distribuição especial no DNA, deve-se aplicar a imunoprecipitação de cromatina.Um resultado experimental típico obtido por ChIP-qPCR é apresentado nesta figura, o que demonstra o enriquecimento temporal do gama histona AX como resposta aos danos induzidos pelo I-PpoI no DNA. Na parte esquerda da imagem, o sinal de histona gama detectado oportunamente é mostrado no lado da ruptura, enquanto na parte direita, a distribuição gama histone AX é apresentada na região do gene de controle na qual as quebras demonstradas não foram induzidas. Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está aumentando rapidamente com a ajuda de métodos bioquímicos e microscópicos.No entanto, técnicas bioquímicas, como uma mancha ocidental, imunoprecipitação e espectrometria de massa requerem uma grande quantidade de células. Os processos de reparação do estudo representam um instantâneo da população celular desejada. O campo microscópico tem sido revolucionado por técnicas de alta resolução, como microscópio de super resolução, que permite a visualização de processos celulares induzidos por danos de DNA no nível nucleosômico, além de garantir o mapeamento preciso da co-localização proteica.Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina é uma ferramenta poderosa, especialmente combinando-a com métodos de sequenciamento para visualizar seu padrão de ligação em todo o genoma de uma proteína relacionada à reparação de DNA desejada e quebras de fios duplos em regiões de cromatina ou heterocromatina.

visualizing-quantifying-endonuclease-based-site-specific-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.

Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Apresentado aqui é o endonuclease sgRNA/CAS9 e o protocolo de sequenciamento de próxima geração que pode ser usado para identificar as mutações associadas ao reparo de quebra de fios duplos perto do promotor CD4.

Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda a visualizar e quantificar danos de DNA específicos do local usando imunofluorescência e ChIP em células U2OS. Estas técnicas complementares permitem analisar a dinâmica espacial e temporal das proteínas de reparo.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

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