Name: Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a medir a transferência de fosfatidilserina e fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas artificiais usando proteínas de transferência de lípidos e sensores fluorescentes. Este método permite quantificar a cinética de transporte de lípidos em tempo real.

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Somos gratos ao Dr. A. Cuttriss por sua cuidadosa revisão do manuscrito. Este trabalho é financiado pela Agência Nacional de Pesquisa francesa exCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e pelo CNRS.

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

Os resultados desses ensaios dependem diretamente dos sinais dos sensores lipídes fluorescentes. Assim, a purificação dessas sondas rotuladas em uma proporção de 1:1 com NBD e sem contaminação livre de fluoróforos NBD é um passo crítico neste protocolo. Também é obrigatório verificar se a LTP em análise está devidamente dobrada e não agregada. A quantidade de LTP testada nos ensaios de extração deve ser igual ou superior à das moléculas acessíveis de PS ou PI(4)P para medir adequadamente se este LTP extrai eficientemente...

A distribuição precisa de lipídios entre diferentes membranas e dentro das membranas das células eucarióticas1,2 tem profundas implicações biológicas. Descriptografar como as LTPs funcionam é uma questão importante na biologia celular3,4,5,6, e abordagens in vitro são de grande valor para abordar esta questão7,8,9,10,11. Aqui, é apresentada uma estratégia in vitro,baseada em fluorescência, que tem sido fundamental para estabelecer que várias proteínas ORP/Osh afetam a troca de PS/PI(4)P entre as membranas celulares12 e, assim, constituem uma nova classe de LTPs. PS é um glicerofosfolipídio aniônico que representa 2-10% do total de lipídios de membrana em células eucarióticas13,14,16. É distribuído ao longo de um gradiente entre o PS e o PM, onde representa 5-7% e até 30% dos glicerofosfolipídios,respectivamente 17,18,19. Além disso, ps está essencialmente concentrado no folheto citosolico do PM. Esse acúmulo e a partição desigual do PS no PM são fundamentais para os processos de sinalização celular19. Devido à carga negativa das moléculas de PS, o folheto citosolico da PM é muito mais aniônico do que o folheto citosolico de outras organelas1,2,19,20. Isso permite o recrutamento, através de forças eletrostáticas, de proteínas de sinalização como o substrato C-kinase rico em mirina-de-mirina (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, o sarcoma viral de ratos kirsten (K-Ras)23, e o substrato de toxina botulínica C3 1 (Rac1)24 que contêm um trecho de aminoágenos carregados positivamente e uma cauda lipidica.
PS também é reconhecido pela proteína convencional quinase C de forma estereoselétrica através de um domínio C225. No entanto, o PS é sintetizado no ER26,indicando que deve ser exportado para a PM antes de poder desempenhar seu papel. Não se sabia como isso foi realizado19 até a constatação de que, em leveduras, Osh6p e Osh7p transferem PS do PS do PS para a PM27. Estes LTPs pertencem a uma família evolutivamente conservada em eucariotes cujo membro fundador é OSBP e que contém proteínas (ORPs em humanos, proteínas Osh na levedura) integrando um domínio relacionado à OSBP (ORD) com um bolso para hospedar uma molécula lipídica. Osh6p e Osh7p consistem apenas em um ORD cujas características estruturais são adaptadas para ligar especificamente PS e transferi-lo entre membranas. No entanto, não ficou claro como essas proteínas transferiam o PS do PS para o PS. Osh6p e Osh7p podem prender PI(4)P como um ligante lipídemo alternativo12. Na levedura, PI(4)P é sintetizado a partir de fosfaticdylinositol (PI) no Golgi e pm por PI 4-kinases, Pik1p e Stt4p, respectivamente. Em contraste, não há PI(4)P na membrana ER, pois este lipídio é hidrolisado para PI pela fosfattase Sac1p. Assim, existe um gradiente PI(4)P nas interfaces ER/Golgi e ER/PM. Osh6p e Osh7p transferem PS do PS para o PM via ciclos de troca PS/PI(4)P utilizando o gradiente PI(4)P que existe entre essas duas membranas12.
Dentro de um ciclo, Osh6p extrai PS do ER, troca PS por PI(4)P na PM e transfere PI(4)P de volta para o PS para extrair outra molécula de PS. Osh6p/Osh7p interagem com Ist2p28, uma das poucas proteínas que conectam e trazem a membrana ER e o PM em proximidade entre si para criar locais de contato ER-PM na levedura29,30,31. Além disso, a associação de Osh6p com membranas negativamente carregadas torna-se fraca assim que a proteína extrai um de seus ligantes lipídicos devido a uma mudança conformacional que modifica suas características eletrostáticas32. Isso ajuda a Osh6p encurtando seu tempo de vida na membrana, mantendo assim a eficiência de sua atividade de transferência lipídica. Combinado com a vinculação ao Ist2p, este mecanismo poderia permitir que os Osh6p/7p executasse de forma rápida e precisa a troca lipídica na interface ER/PM. Nas células humanas, as proteínas ORP5 e ORP8 executam a troca de PS/PI(4)P nos locais de contato do ER-PM através de mecanismos distintos33. Eles possuem um ORD central, semelhante a Osh6p, mas são diretamente ancorados ao P através de um terminal C transmembrano segmento33 e atracam na PM através de um domínio de Pleckstrinia N-terminal (PH) que reconhece PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. Orp5/8 use pi(4)P para transferir PS, e foi demonstrado que orp5/8 regula adicionalmente os níveis PM PI(4,5)P2 e, presumivelmente, modulando vias de sinalização. Por sua vez, a diminuição dos níveis PI(4)P e PI(4,5)P2 reduz a atividade ORP5/ORP8, uma vez que essas proteínas associam-se ao PM de forma dependente de PIP. Síntese de PS anormalmente alta, que leva à síndrome de Lenz-Majewski, impacta os níveis de PI(4)P através de ORP5/836. Quando a atividade de ambas as proteínas é bloqueada, o PS torna-se menos abundante na PM, diminuindo a capacidade oncogênica de sinalização de proteínas37.
Por outro lado, a superexpressão orp5 parece promover a invasão de células cancerosas e processos metastáticos38. Assim, alterações na atividade ORP5/8 podem modificar severamente o comportamento celular através de alterações na homeostase lipídica. Além disso, ORP5 e ORP8 ocupam locais de contato ER-mitocôndrias e preservam algumas funções mitocondriais, possivelmente fornecendo PS39. Além disso, o ORP5 localiza os locais de contato com gotículas ER-lipídidas para fornecer PS a gotículas lipídicas por PS/PI(4)P troca40. A estratégia aqui descrita para medir (i) PS e PI(4)P extração de lipossomos e (ii) PS e PI(4)P transporte entre lipossomos foi concebida para estabelecer e analisar o PS/PI(4)P atividade de troca de Osh6p/Osh7p12,32 e usado por outros grupos para analisar a atividade de ORP5/ORP835 e outras LTPs10, 41. Baseia-se no uso de um leitor de placas de fluorescência, um espectrofluorômetro padrão em formato L e dois sensores fluorescentes, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,que podem detectar PS e PI(4)P, respectivamente.
O NBD-C2Lact corresponde ao domínio C2 da glicoproteína, lactadherina, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a solventes única perto do suposto local de ligação PS; um NBD sensível à polaridade (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluoróforo está covalentemente ligado a este resíduo(Figura 1A)12. Para ser mais preciso, o domínio C2 de lactadherina (Bos taurus, UniProt: Q95114,resíduos 270-427) foi clonado em um vetor pGEX-4T3 para ser expresso em fusão com glutathione S-transferase (GST) em Escherichia coli. coli . A sequência de C2Lact foi então mutada para substituir dois resíduos de cisteína acessíveis a solventes (C270, C427) com resíduos de alanina e para introduzir um resíduo de cisteína em uma região próxima ao local putativo de ligação PS (mutação H352C) que pode ser posteriormente rotulado com N,N'-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) diamina de etileno (IANBD) 12. Um local de decote para trombina está presente entre a proteína GST e o N-terminus do domínio C2. Uma grande vantagem é que este domínio reconhece seletivamente o PS de forma independente de Ca2+contrária a outros domínios C2 conhecidos ou anexo a A542. OFAPP NBD-PH é derivado do domínio PH da proteína 1 (FAPP1) humana de quatro fosfatos, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a um único solvente que pode ser rotulada com um grupo NBD próximo ao local de ligação PI(4)P(Figura 1A)43. A sequência nucleotídea do domínio PH da proteína FAPP humana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) foi clonada em um vetor pGEX-4T3 para ser expressa em conjunto com uma tag GST. A sequênciaPH FAPP foi modificada para inserir um resíduo único de cisteína dentro da interface de ligação de membrana da proteína43. Além disso, um linker de nove resíduos foi introduzido entre o local de decote trombina e o n-terminus do domínio PH para garantir a acessibilidade à protease.
Para medir a extração de PS de lipossomos, NBD-C2Lact é misturado com lipossomos feitos de fosfattidylcholina (PC) contendo traços de PS. Devido à sua afinidade com ps, esta construção se liga aos lipossomos, e o fluorophore NBD experimenta uma mudança na polaridade à medida que entra em contato com o ambiente hidrofóbico da membrana, que provoca uma mudança azul e um aumento da fluorescência. Se o PS for extraído quase completamente por uma quantidade estequiométrica de LTP, a sonda não se associa a lipossomos, e o sinal NBD é menor(Figura 1B)32. Essa diferença de sinal é usada para determinar se um LTP(por exemplo, Osh6p) extrai PS. Uma estratégia semelhante é usada com oFAPP NBD-PH para medir a extração PI(4)P (Figura 1B),conforme descrito anteriormente12,32. Dois ensaios baseados em FRET foram projetados para (i) medir o transporte de PS de lipossomos LA a LB, que imitam a membrana ER e a PM, respectivamente, e (ii) pi(4)P transporte na direção inversa. Estes ensaios são realizados sob as mesmas condições (ou seja, mesmo buffer, temperatura e concentração lipídica) para medir a troca de PS/PI(4)P. Para medir o transporte de PS, o NBD-C2Lact é misturado com lipossomos LA compostos por PC e dopados com 5 PS mol% e 2% de uma fosfatidetanolamina fluorescente rotulada por rhodamina (Rhod-PE)-e lipossomos LB incorporando 5 mol% PI(4)P.
No tempo zero, FRET com Rhod-PE sacia a fluorescência NBD. Se o PS for transportado de lipossomos LA para LB (por exemplo, ao injetar Osh6p), um descosmamento rápido ocorre devido à translocação de moléculas deLact NBD-C2 de lipossomos LA para LB (Figura 1C). Dada a quantidade de PS acessível, o NBD-C2Lact permanece essencialmente em um estado ligado à membrana ao longo do experimento12. Assim, a intensidade do sinal NBD se correlaciona diretamente com a distribuição de NBD-C2Lact entre lipossomos LA e LB e pode ser facilmente normalizada para determinar quanto PS é transferido. Para medir a transferência de PI(4)P na direção oposta, oFAPP NBD-PH é misturado com lipossomos LA e LB; dado que ele se liga apenas a lipossomos LB que contêm PI(4)P, mas não Rhod-PE, sua fluorescência é alta. Se pi(4)P for transferido para lipossomos LA, ele se transloca para esses lipossomos, e o sinal diminui devido ao FRET com Rhod-PE(Figura 1C). O sinal é normalizado para determinar quanto PI(4)P é transferido43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-cisteína &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Prepare uma solução estoque de L-cisteína 10 mM em água. As alíquotas são armazenadas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2 mL Frasco Âmbar, PTFE/Rub Lnr, para armazenamento de lipídios em CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro de 4 mm de diâmetro</td> Tubo de centrífuga cônico <td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificador</td><td>KTA GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Folha</td><td></td><td></td><td></td>de alumínio</tr><tr><td>Amicon Ultra-15 com um MWCO de 3 e 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 com um MWCO de 3 e 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td></td><td>Prepare uma solução estoque de 50 mg/mL com água filtrada e esterilizada e armazene-a a -20 & graus; C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Gold Células Competentes</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) em CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Dissolver 1 mg de pó C16:0/C16:0-PI(4)P em pó em 250 &micro; L de MeOH e 250 &micro; L de CHCl3. Em seguida, complete com CHCl3 a 1 mL. A solução deve ficar clara.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) em CHCl3 (10 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) em CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Prepare 10 mM CaCl2 solução estoque em água.</td></tr><tr><td>Disruptor Celular</td><td>Dinâmica</td><td></td><td></td>Constante</tr><tr><td>Clorofórmio (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel completo de inibidores de protease sem EDTA</td><td>Água</td><td></td> desionizada (Milli-Q) Roche 5056489001 <td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF), anidra, >99% pura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Recombinante, livre de RNAse, em pó</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Prepare a solução estoque de 1 M DTT em água Milli-Q.&nbsp; Prepare alíquotas de 1 mL e armazene-as a -20 °C.</td></tr><tr><td>Colunas de cromatografia Econo-Pac (1,5 e 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo Tubos Ti45 e Ti45</td><td>Beckman</td><td>Girando os lisados</td><td></td>de batcerial</tr><tr><td>Seringas de vidro (10, 25 e 50 &micro; L) para o experimento de fluorescência</td> Seringas de vidro <td>de Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(25, 100, 250, 500 e 1000 &micro; L) para lidar com soluções de estoque lipídicas</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN tipo 3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione Sepharose 4B grânulos</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (99% puro)</td> <td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de hemólise com tampa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, >99% puro</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Coluna de dessalinização NAP 10</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Prepare a solução de estoque 1 M IPTG em Milli-Qwater. Prepare alíquotas de 1 mL e armazene-as a -20 °C.</td></tr><tr><td>K-Acetato</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Caldo médio sem glicose</td><td></td><td></td><td>Preparado com água milli-Q e autoclavado.</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH) &ge; 99,8%</td><td>VWR</td><td>20847,24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Prepare uma solução 2 M MgCl2. Filtrar a solução com um 0,45 &micro; Filtro M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplaca 96 Poços PS F-Botom Preto Não Vinculante</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extrusora com duas seringas Hamilton à prova de gás de 1 mL</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas de fluorescência baseado em monocromador</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimetil-N-(Iodoacetil)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Etilenodiamina) (IANBD Amida)</td><td>Sondas Moleculares</td><td></td><td>Dissolver 25 mg de IANBD em 2,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) e preparar 25 alíquotas de 100 &micro; L em tubos com tampa de rosca de 1,5 mL. Não aperte completamente a tampa. Em seguida, remova o DMSO em um liofilizador para obter 1 mg de IANBD seco por tubo. Os tubos são fechados e armazenados a -20 &graus; C no escuro.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoclavado e armazenado a 4 °C.</td></tr><tr><td>Frascos de vidro em forma de pêra (25 mL, 14/23, vidro Duran)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plasmídeo</td><td></td><td></td><td>Disponível a pedido do nosso laboratório</td></tr><tr><td>plasmídeo pGEX-PHFAPP</td><td>Disponível a pedido do nosso laboratório</td>Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)<td></td><td></td></tr><tr><td> &ge; 98,5% (GC)</td> <td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Preparar uma solução estoque de PMSF 200 mM em filtros de policarbonato isopropanol</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>(19 mm de diâmetro) com tamanho de poro de 0,2 &micro; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>coluna de cromatografia Poly-Prep (com um volume de leito de 0-2 mL e um reservatório de 10 mL)</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Pré-filtros (10 mm de diâmetro).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Construção dos modelos 3D das proteínas (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Cubeta de quartzo para fluorescência UV/visível (volume mínimo de 600 &micro; L)</td> Cubetas de quartzo <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Centrífuga refrigerada <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcentrigéticos com tampa de rosca (1,5 mL)</td><td>Barra</td> de agitação PFTE magnética pequena Sarsted <td></td><td></td></tr><tr><td>(5 e vezes)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tubos microcentrífugos com tampa de pressão (0,5, 1 e 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO laranja</td><td></td><td></td><td>coloração fluorescente para detectar proteína em gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TROMBINA, DE PLASMA HUMANO</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Dissolva 20 unidades em 1 mL de água mili-Q e prepare 25 &micro; L alíquotas em tubos Eppendorf de 0,5 mL. Em seguida, congele e armazene a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Tris,</td><td>ultra puro MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de absorbância UV/visível</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorômetro UV/visível com suporte de célula com temperatura controlada e dispositivo de agitação</td><td>Jasco ou Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 ou Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> <td>de vácuo</td></tr><tr>Coluna <td>Julabo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>XK 16/70 em banho-maria embalada com Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Vários membros da família de proteínas relacionadas ao oxisterol (OSBP) (ORP)/OSBP (Osh) foram recentemente encontrados para representar um novo grupo de proteínas de transferência de lipídios (LTP) em leveduras e células humanas. Eles transferem fosfaticidalserina (PS) do ânticulo endoplasmático (ER) para a membrana plasmática (PM) via ciclos de troca PS/fosfartidylinositol 4-fosfato (PI(4)P). Esse achado permite uma melhor compreensão de como o PS, que é fundamental para os processos de sinalização, é distribuído por toda a célula e a investigação da ligação entre esse processo e o metabolismo de fosforinostito (PIP). O desenvolvimento de novos protocolos baseados em fluorescência tem sido fundamental na descoberta e caracterização deste novo mecanismo celular in vitro a nível molecular. Este artigo descreve a produção e o uso de dois sensores lipídicos fluorescentes rotulados, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,para medir a capacidade de uma proteína de extrair PS ou PI(4)P e transferir esses lipídios entre membranas artificiais. Primeiro, o protocolo descreve como produzir, rotular e obter amostras de alta pureza desses dois construtos. Em segundo lugar, este artigo explica como usar esses sensores com um leitor de microplaca de fluorescência para determinar se uma proteína pode extrair PS ou PI(4)P de lipossomos, usando Osh6p como estudo de caso. Finalmente, este protocolo mostra como medir com precisão a cinética do PS/PI(4)P troca entre lipossomos de composição lipídica definida e determinar taxas de transferência lipídica por transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) usando um fluorômetro padrão.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figura 1: Descrição dos sensores lipídicos fluorescentes e ensaios in vitro. (A) Modelos tridimensionais de NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP baseados na estrutura cristalina do domínio C2 da lactadherina bovina (PDB ID: 3BN648) e a estrutura NMR do domínio PH da proteína FAPP1 humana (PDB ID: 2KC...

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Este método usa fluorescência para determinar se uma transferência de proteína para liqids biologicamente importantes entre membrana sintética e, assim, contribuir para a distribuição desses lipídios dentro de células eucarióticas. Esta técnica torna possível a extração e o transporte de um lipídio natural por uma proteína, requer e células de fluorescência e lipossomos que são fáceis de fazer. Este método pode ser usado e modificado para obter uma visão da biologia celular por proteínas por trás da distribuição de alguns lipídios essenciais entre órgãos e membranas.A demonstração visual é fundamental para explicar como realizar medições em tempo real da transferência de lipídios por fluorescência. Então, demonstrando o procedimento também será Maud Magdeleine, uma engenheira do meu laboratório. Comece preparando um tampão de acetato de potássio HEPES filtrado fresco e desafosado, complementado com um cloreto de magnésio milimila para formar o tampão HKM.Em seguida, prepare lipossomos feitos apenas de PC ou adicionalmente dopados com dois porcentres molares PS ou PI(4)P. Agora, coloque o frasco em um evaporador rotativo para secar o lipídio sob vácuo. Em um poço, misture lipossomos contendo dois PS molar por cento com sensor lipídeto, NBD-C2 Lact, a uma concentração final de 250 nanomolares e um volume de 100 microliters.Encha um segundo poço com a mesma quantidade de liposema e lact NBD-C2 misturado com três proteínas de transferência lipídica micromolar ou LTP. Encha um terceiro poço com 250 lact NBD-C2 nanomolar misturado com lipossomas de PC micromolar puros e um quarto poço com lipossomos puros de PC de 80 micromolar. Repita estas etapas para preparar três séries adicionais de quatro poços.Em seguida, coloque a placa multi-bem no leitor de fluorescência. Para cada poço registe um espectro NBD de 505 a 650 nanômetros com uma largura de banda de cinco nanômetros após excitação a 490 nanômetros a 25 graus Celsius. Para cada série subtrair o espectro registrado apenas com lipossomos dos outros espectros.Para o ensaio de extração PI(4)P prepare lipossomos dopados com dois molar por cento fosphatidylinositol-4-fosfato e realize medições com a sonda FAPP NBD-PH. Realize experimentos de controle e determine a porcentagem de extração. Depois de terminar de extrudar lipossomos encher um tubo com esses lipossomos extrudados.Prepare o tampão HKM recém-desa gaseado e filtrado e mantenha os tubos contendo lipossomos extrudados à temperatura ambiente. Enrole tubos contendo lipossomos com fosfamina rotulada fosfattidylethanolamina em papel alumínio e armazene-os em uma caixa opaca para evitar qualquer branqueamento fotográfico. Ajuste a temperatura entre 25 e 37 graus Celsius e ajuste os monocromômetros de excitação para 460 nanômetros com uma largura de banda curta de um a três nanômetros e emissão para 530 nanômetros com uma grande largura de banda superior a 10 nanômetros.Ajuste o tempo de aquisição para 25 minutos com a resolução de tempo de no máximo um segundo. No cuvette de quartzo dilui 30 microlitadores da suspensão liposasomea la e solução de estoque de lact NBD-C2 e tampão HKM pré-warm para preparar uma amostra de 570 microliteres que contém 200 lipídios totais micromolar e 250 lact nanomolar ou NBD-C2. Adicione uma pequena barra de agitação magnética e posicione a cuvette no suporte do fluorômetro.Uma vez que a amostra esteja termicamente equilibrada, acione a medição. Após um minuto, adicione 30 microliters da suspensão liposasome LB à amostra. Após três minutos injete LTP na amostra para que a concentração final do LTP seja de 200 nanomolares e, em seguida, adquira o sinal durante os 21 minutos restantes.Realize um experimento paralelo para normalizar o sinal NBD. Misture 30 microliters de suspensão lipossomo de equilíbrio la com 250 lact NBD-C2 nanomolar em tampão HKM em um volume final de 570 microliters. Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposesome de equilíbrio LB.Converta as curvas cinéticas medidas com um LTP de interesse para determinar a quantidade de PS transferida de la para lipossomos LB ao longo do tempo. Em seguida, normalize cada ponto de dados da curva. Realize o experimento PI(4)P usando as mesmas configurações e condições do emissor do piso quanto ao ensaio de transferência PS.No cuvette, misture 30 microliters de suspensão liposesome lb e sonda FAPP NBD-PH com tampão HKM pré-aquecido para obter um volume final de 570 microliters. Uma vez alcançado o equilíbrio térmico da amostra, inicie a medição. Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposama de LA.Após três minutos, injete o LTP de interesse e regissou o sinal. Realize um segundo experimento para normalizar o sinal NBD. Misture 30 microliters de lb equilibrium lipossome suspensão com 250 nanomolar NBD-PH FAPP e 570 microliters de tampão HKM.Após um minuto, injete 30 microliters de suspensão liposoma do equilíbrio la. Converta as curvas cinéticas para determinar a quantidade de PI(4)P transferido de lipossomos LB para LA ao longo do tempo e, em seguida, normalize cada ponto de dados. Para quantificar a extensão da qual um LTP é eficiente.Realize uma regressão linear dos primeiros pontos de dados da cinética de transferência para obter uma inclinação. Divida o valor da inclinação pela concentração de LTP na mistura de reação para determinar o número de moléculas lipídicas transferidas por proteína por unidade de tempo. A recuperação eficiente do lact C2 das contas foi verificada com a análise de páginas da SDS.O espectro absorvente visível ultravioleta de C2 lact rotulado com NBD confirmou que todas as moléculas de lact C2 foram rotuladas com um grupo NBD. A pureza do lact NBD-C2 e sua fluorescência foram determinadas pela análise de páginas da SDS. A fluorescência de NBD-C2 lact ou NBD-PH FAPP foi máxima quando apenas lipossomos contendo PS ou PI(4)P foram usados para incubação, indicando que o sensor estava ligado à membrana.Uma baixa fluorescência foi observada quando Osh6p também estava presente indicando que essa proteína extraía PS ou PI(4)P eficientemente de lipossomos. Os resultados de um ensaio de transferência PS usando Osh6p como LTP são mostrados. As curvas cinéticas médias da transferência de PS de lipossomos de LA para lipossomos LB, dopadas ou não dopadas com fosfaticisitol-4-fosfato foram calculadas.A taxa média inicial de transporte de PS foi determinada a partir de três experimentos distintos. Da mesma forma, os resultados de um ensaio de transferência PI(4)P usando Osh6p como LTP são mostrados aqui. Junto com as curvas cinéticas médias obtidas após a normalização do sinal.As taxas médias de transferência foram medidas com lipossomos de LA que foram dopados ou não dopados com PS. Ao executar este protocolo use buffer fresco e prepare os mesmos dias. Minimize a exposição leve de lipossomos e proteínas florescentes, use proteína bem purificada rotulada de NBD e mantenha-as no gelo. pode ser confirmado medindo a transferência de PS e PI(4)P entre organela dentro da célula procariótica usando sensores lipídicos fluorescentes geneticamente codificados.Essa técnica abre caminho para uma melhor compreensão da PS e pi(4) são distribuídas dentro da célula, e sua atividade sofre especificação de vários LTPS.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.

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A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

Apresentamos uma nova técnica para medir a difusão lateral de uma espécie tensoativa na interface fluido-fluido, mesclando uma monocamada de gotículas em uma monocamada plana.

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Fosfoinositídeos estão sinalizando lipídios, cuja abundância relativa muda rapidamente em resposta a vários estímulos. Este artigo descreve um método para medir a abundância de fosfoinositídeos por meio de rotulagem metabolicamente células com 3 H- mio-inositol, seguido por extracção e desacilação. Extraídos glicero-inositides são então separados por cromatografia líquida de alto desempenho e quantificadas por cintilação fluxo.

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PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .

Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas

Descrevemos um ensaio baseado em fluorescência para medir o embaralhamento de fosfolipídios em grandes lipossomas unilamelares reconstituídos com opsina.

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

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Medindo o Turnover Lipídico da Membrana com o Análogo Lipídico Fluorescente Sensível ao pH ND6

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

Descrevemos um método para o uso de ciclodextrina para mediar a troca entre lipídios da membrana plasmática com lipídios exógenos. Essa técnica pode ser combinada com experimentos que estudam proteínas transmembranares, que se comportam de maneira diferente em ambientes semelhantes a jangadas lipídicas do que em ambientes não semelhantes a jangadas.

Ensaio de Troca Lipídica em Células Vivas

Aprenda a medir a transferência de fosfatidilserina e fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas artificiais usando proteínas de transferência de lípidos e sensores fluorescentes. Este método permite quantificar a cinética de transporte de lípidos em tempo real.

Medidas baseadas em fluorescência de fosfatidaserina/fosfattidylinositol 4-fosfato troca entre membranas

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