Name: Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a técnica de imunostaining em retinas de monte inteiro usando o método CLARITY para visualização tridimensional de neurônios retinianos em camundongos. Este protocolo permite análise detalhada da morfologia celular e subcelular em estados de doença.

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Gostaríamos de agradecer a Bing Ye, Nathan Spix e Hao Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) e pelo Oakland University Provost Graduate Student Research Award (E.J.A.).

O cuidado com o rato e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para animais de laboratório e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oakland (protocolo nº 18071).
NOTA: Os nomes das soluções e suas composições estão listados na Tabela 1.
1. Preparação tecidual
<ol><li>Eutanize o rato com uma overdose de CO2,seguido de luxação cervical.</li>
	<li>Enuclear os olhos com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de petri com 0,1 M PBS(Tabela 1). Sob um microscópio de dissecção, faça um pequeno buraco ao longo da junção córnea-esclera com uma agulha. Transfira para 4% de paraformaldeído (PFA) por 1 hora.</li>
	<li>Transfira o olho de volta para um prato com PBS. Sob um microscópio de dissecção, use uma tesoura de dissecção para cortar todo o caminho ao redor da junção córnea-esclera. Remova a córnea e a lente. Corte na base do nervo óptico e retire cuidadosamente a esclera com fórceps para isolar a retina.</li>
	<li>Faça quatro pequenos cortes uniformemente ao redor da retina e use uma fina escova de ponta mergulhada em PBS para colocá-lo plano (lado GCL para baixo) em uma forma de trevo em um pequeno corte quadrado de papel filtro de nitrocelulose para estabilizar a retina.</li>
	<li>Transfira a retina usando fórceps para segurar o canto do papel nitrocelulose (sem tocar na retina montada) e coloque-a em uma placa de 48 poços com 4% de PFA por 1 hora.</li>
	<li>Transfira o papel filtro e a retina para um poço com PBS e lave (3x por 5 min cada).</li>
	<li>Transfira para A4P0 (Tabela 1) e incuba durante a noite a 4 °C com agitação suave.</li>
	<li>Óleo vegetal pipeta no poço para cobrir completamente a solução A4P0. Incubar em um banho de água a 40 °C por 3 horas sem tremer.</li>
	<li>Lave (3x por 5 min cada) em PBS, certificando-se de que todo o óleo foi lavado. Se necessário, use uma tubulação para remover cuidadosamente o óleo restante da parte superior do poço antes da última lavagem.</li>
	<li>Incubar em 10% SDS a 40 °C por dois dias com agitação suave. Substitua o SDS por uma solução nova no segundo dia.</li>
	<li>Transfira o papel filtro e a retina para PBS com Triton-X-100 (PBST, Tabela 1) e lave (5x por 1,5 h cada).</li>
	<li>Armazene a 4 °C em PBST com azida de sódio de 0,01% (NaN3) ou mova-se diretamente para a imunostainagem.</li>
</ol>2. Imunostaining e correspondência de índices refratários
<ol><li>Remova a retina do papel do filtro descascando-a suavemente com uma escova de ponta fina no PBST.</li>
	<li>Incubar a retina em anticorpo primário(Tabela 2) diluído na solução de bloqueio(Tabela 1) por 2 dias a 40 °C com agitação suave.</li>
	<li>Lave (5x, 1,5 h cada) em PBST.</li>
	<li>Incubar com os anticorpos secundários apropriados(Tabela 3) diluídos em solução de bloqueio por 2 dias a 40 °C com agitação suave e proteger da luz durante o restante do procedimento.</li>
	<li>Lave (5x, 1,5 h cada) em tampão fosfato de 0,02 M (ver Tabela 1).</li>
	<li>Incubar em solução de correspondência de índice refrativo baseada em sorbitol (sRIMS, ver Tabela 1) a 40 °C durante a noite com agitação suave.</li>
</ol>3. Montagem
<ol><li>Delineie uma tampa de vidro de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm com um marcador permanente de ponta fina para marcar um limite quadrado na parte de trás de um deslizamento de microscópio de vidro.</li>
	<li>Vire o slide e use uma seringa para traçar o limite com uma fina linha de graxa de silicone na parte frontal do slide, deixando uma pequena lacuna em um canto para a solução de montagem em excesso escapar.</li>
	<li>Transfira a retina para o centro da área delimitada e organize com uma escova de ponta fina para que ela fique plana com o lado fotorreceptor contra o escorregador de vidro.</li>
	<li>Pipeta aproximadamente 60 μL de sRIMS de modo que cubra a retina achatada e se estenda a um canto do gabinete, tomando cuidado para que a retina permaneça plana e no lugar.</li>
	<li>Aplique a mancha de cobertura a partir do canto com o sRIMS e abaixe-a lentamente até tocar a graxa em todos os lados, evitando a formação de bolhas de ar.</li>
	<li>Coloque uma pilha de 3 tampas em cada lado da retina montada como um espaçador. Use a borda longa de outro slide para pressionar o deslizamento para que a montagem fique plana e uniforme.</li>
	<li>Armazene os slides a 4 °C até a imagem.</li>
</ol>4. Imagem
<ol><li>Amostras de imagem em um microscópio de fluorescência convencional ou um microscópio confocal(Tabela de Materiais). Comece colocando o slide no estágio do microscópio e localizando a amostra. NOTA: Se um microscópio objetivo invertido estiver sendo usado, coloque o slide de cabeça para baixo no palco, primeiro garantindo que as áreas expostas do slide estejam livres de toda a graxa de silicone e solução de montagem.</li>
	<li>Para obter imagens empilhadas em z de amostras co-rotuladas, primeiro concentre-se no sinal em cada canal individualmente e defina o tempo de exposição ou velocidade de varredura, para fluorescência ou microscópios confocal, respectivamente.</li>
	<li>Defina o intervalo para a pilha z, definindo manualmente o plano focal na parte superior e inferior da faixa desejada, ou definindo o ponto médio e, em seguida, especificando um intervalo ao redor do ponto médio.</li>
	<li>Ajuste o tamanho da etapa ou o número de fatias conforme desejado.</li>
	<li>Capture a imagem e salve o arquivo original, bem como exporte-a como um arquivo TIFF ou outro formato desejado.</li>
</ol>5. Análise de imagem
<ol><li>Use o software de análise de imagem de escolha(Tabela de Materiais) para ajustar o brilho e o contraste em cada canal até que a clareza ideal seja alcançada tanto nas imagens únicas quanto na renderização tridimensional da pilha z. NOTA: Se o tamanho da etapa selecionada for suficientemente pequeno, a desconvolução 3D também poderá ser realizada para melhorar o sinal.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Modificação do protocolo CLARITY para retinas de montagem inteira. Simplificamos o protocolo CLARITY para alcançar a polimerização adequada sem a necessidade de uma câmara de evacuação ou dessecação a vácuo, como é usado na maioria dos estudos anteriores7,9,11. O processo de polimerização é inibido pelo oxigênio, exigindo que a amostra seja isolada do ar durante a etapa de polimerização do protocolo. No entan...

A retina vertebrada é talvez a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), e serve como um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro. Cinco classes de neurônios na retina são distribuídos em três camadas nucleares separadas por duas camadas plexiformes. A camada nuclear externa (ONL) consiste em fotorreceptores clássicos (hastes e cones) que convertem luz em sinais elétricos. Os sinais elétricos são processados por neurônios na camada nuclear interna (INL), incluindo células bipolares, horizontais e amacrinas, e depois transmitidos para células gânglios da retina (RGCs) na camada celular de gânglio (GCL). Os RGCs são os neurônios de saída da retina, com os axônios projetando para o cérebro contribuir para a formação de imagens e função visual não-formadora de imagens. Além disso, três tipos de células gliais (células Muller, astroglia e microglia) fornecem nutrientes aos neurônios e protegem os neurônios de alterações nocivas em seu ambiente extracelular.
Uma subpopulação especializada de células amacrinas produz e libera dopamina, um importante neuromodulador no CNS, reconfigurando circuitos neurais da retina durante a adaptação da luz1,2. As células amacrinas dopaminérgicas (DACs) têm uma característica única de perfis morfológicos. Sua somata está localizada no INL proximal com dendritos ramificantes na parte mais distal da camada plexiforme interna (IPL). Os processos semelhantes ao Axon de DACs são nãoomiados, finos e longos, pouco ramificados e têm varizes (os locais de liberação de dopamina). Eles formam um plexo denso com dendritos no IPL, incluindo estruturas semelhantes a anel ao redor da somata de células amacrinas AII. Os axônios também atravessam o INL em direção ao OPL, formando uma via centrífuga através da retina3. Demonstramos que o DAC processa receptores expressos em resposta à liberação de glutamato de neurônios pré-sinápticos, incluindo células bipolares e células de gânglios intrinsecamente fotosensíveis da retina (ipRGCs)4,5,6. No entanto, não está claro se os receptores de glutamato expressam nos axônios, dendritos ou ambos, uma vez que são cortados em seções verticais de retina e não podem ser distinguidos uns dos outros5,6. A imunostaining precisa ser realizada em retinas de montagem inteira para revelar ramificações tridimensionais de DACs e a presença de receptores de glutamato em compartimentos subcelulares. Embora a retina seja relativamente transparente, a espessura de uma retina de montagem inteira de um rato é de aproximadamente 200 μm, o que limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução devido à dispersão da luz tecidual. Para superar essas limitações, adaptamos o método de delipidação de hidrogel de tecido compatível com imunosstaining (CLARITY) desenvolvido recentemente para seções cerebrais grossas para retinas de camundongos de montagem inteira7.
O método CLARITY foi originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas7. Ele usa um detergente forte, sulfato de dodecila de sódio (SDS) e eletroforese para remover os componentes lipídicos (que causam dispersão de luz tecidual), deixando as proteínas e ácidos nucleicos no lugar. Os lipídios removidos são substituídos por um andaime transparente composto por monômeros de hidrogel, como acrilamida, para suportar a estrutura proteica restante. O tecido limpo pode ser rotulado através de imunohistoquímica e imageado com profundidade de penetração de luz substancialmente aumentada através do tecido (até vários milímetros abaixo da superfície do tecido). Desde então, o método CLARITY tem sido otimizado e simplificado por diversos grupos de pesquisa8,9,10. Um protocolo clarity modificado usa uma técnica de compensação passiva para evitar os possíveis danos teciduais produzidos pela eletroforese para limpar todo o cérebro e outros órgãos intactos11. No entanto, este método ainda não foi aplicado a retinas de montagem inteira. Aqui, adaptamos a técnica de CLARIDADE passiva para retinas de montagem integral para torná-las mais transparentes para a imunohistoquímica e a imagem. Descobrimos que a maioria das proteínas da retina testadas foram preservadas durante esse processo para imunohistoquímica. Usando a solução de correspondência de índices refrativos, fomos capazes de imaginar neurônios de retina através da espessura de aproximadamente 200 μm do ONL para o GCL em retinas de montagem inteira.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td>Fixador</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>Monômero de hidrogel</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscópio de fluorescência</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600 Eclipse Scientific BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos de Eclipse Ti</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Varredura confocal microscópio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Conservante bacteriostático</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>Agente bloqueador</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software de análise de imagem</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Agente de delipidação</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>Componente tampão</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>Iniciador térmico</td></tr></tbody></table>

imunostaining de retinas de monte inteiro com o método de limpeza tecidual clarity

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

O método de delipidação de hidrogel de tecido (CLARITY), originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth, foi modificado e amplamente utilizado para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas. No entanto, esta tecnologia avançada ainda não foi usada para retinas de montagem inteira. Embora a retina seja parcialmente transparente, sua espessura de aproximadamente 200 μm (em camundongos) ainda limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução. Aqui, adaptamos o método CLARITY para retinas de camundongos de montagem inteira polimerizando-as com um monômero de acrilamida para formar um hidrogel nanoporoso e, em seguida, limpá-los em sulfato de dodecilo de sódio para minimizar a perda de proteína e evitar danos teciduais. As retinas processadas pela CLARIDADE foram imunossuídas com anticorpos para neurônios da retina, células gliais e proteínas sinápticas, montadas em uma solução de correspondência de índices refrativos e imagens. Nossos dados demonstram que a CLARITY pode melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens para neurônios da retina e células gliais em preparação de todo o suporte. Por exemplo, a resolução 3D de estruturas axônicas finas e dendríticas de células amacrinas dopaminérgicas foram muito melhoradas pela CLARITY. Em comparação com retinas de montagem integral não processadas, a CLARITY pode revelar imunossuagem para proteínas sinápticas, como a proteína de densidade pós-sináptica 95. Nossos resultados mostram que a CLARITY torna a retina mais opticamente transparente após a remoção de lipídios e preserva estruturas finas de neurônios da retina e suas proteínas, que podem ser rotineiramente usadas para obter imagens de alta resolução de neurônios da retina e suas estruturas subcelulares em preparação de todo o suporte.

Retinas modificadas processadas por CLARITY são tecido opticamente transparente. Para formular um método de limpeza tecidual compatível com aplicações imunohistoquímicas na retina, ao mesmo tempo em que fornecemos delipidação adequada e retendo a integridade estrutural das proteínas celulares, adaptamos o método de limpeza tecidual CLARITY para retinas de camundongos de montagem total. Conseguimos simplificar o protocolo e modificá-lo para retinas de montagem inteira (ver Protocolo). Após a conclusão ...

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Este protocolo permite a investigação da morfologia fina dos neurônios da retina e pode dar uma visão das alterações morfológicas celulares e subcelulares que ocorrem em estados da doença. Este método melhora significativamente a transparência óptica da retina e permite imagens tridimensionais de alta resolução, fiação de circuito e estruturas subcelulares finas de neurônios retinais na preparação hormonal da retina. Enuclear os olhos do rato com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de Petri com 0,1 M PBS.Faça um pequeno buraco ao longo da junção da córnea com a agulha sob o microscópio de dissecção, em seguida, transfira o olho para formaldeído de 4% de potência por uma hora. Transfira o olho de volta para um prato com PBS. Sob um microscópio de dissecção, use uma tesoura de dissecção para cortar todo o caminho ao redor da junção corneoscleral.Remova a córnea e a lente. Em seguida, corte-o na base do nervo óptico e descasque cuidadosamente a esclera com fórceps para isolar a retina. Faça quatro pequenos cortes uniformemente ao redor da retina e use uma fina escova de ponta mergulhada em PBS para colocá-lo lado GCL plano para baixo na forma de trevo em um pequeno corte quadrado de papel filtro nitrocelulose.Pegue o canto do papel nitrocelulose com fórceps e coloque-o em uma placa de 48 poços com formaldeído de 4% de potência por uma hora, depois transfira o papel filtro e a retina para um poço com PBS e lave três vezes por cinco minutos cada. Descongele a solução A4P0 no gelo. Em seguida, transfira a retina para a solução A4P0 e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.Adicione óleo vegetal no poço para cobrir completamente a solução A4P0. Incubar em um banho de água a 40 graus Celsius por três horas sem tremer. Em seguida, lave três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.Incubar a retina em sulfato de dodecilo de sódio a 40 graus Celsius por dois dias com agitação suave, em seguida, transfira o papel filtro e a retina para PBS com Triton X-100 e lave cinco vezes por 90 minutos por lavagem. Após a lavagem final, armazene a retina a quatro graus Celsius em PBS-T com azida de sódio de 0,01% ou mova-se diretamente para a coloração imuno. Remova a retina do papel do filtro descascando-a suavemente com uma escova de ponta fina em PBS-T.Incubado em anticorpo primário diluído em solução de bloqueio por dois dias a 40 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, lave cinco vezes por 90 minutos em PBS-T. Incubar a retina com anticorpos secundários apropriados diluídos em solução de bloqueio por dois dias a 40 graus Celsius com agitação suave.Proteja as amostras da luz durante todo o restante do procedimento. Lave a retina cinco vezes por 90 minutos em 0,02 M tampão fosfato. Por fim, incubar a retina em solução de correspondência de índice refrativo à base de sorbitol a 40 graus Celsius durante a noite com agitação suave.Delineie um deslizamento de tampa de vidro com um marcador permanente de ponta fina para marcar um limite quadrado na parte de trás de um slide de microscópio de vidro. Vire o slide e use uma seringa para traçar o limite com uma fina linha de graxa de silicone na parte frontal do slide. Deixe uma pequena lacuna em um canto para que o excesso de solução de montagem escape.Transfira a retina para o centro da área delimitada e posicione-a com uma escova de ponta fina para que ela fique plana com o lado fotorreceptor contra o escorregador de vidro. Pipeta aproximadamente 60 microliters de sRIMS de modo que cobre a retina achatada e estende-se a um canto do gabinete. Certifique-se de que a retina permaneça plana e no lugar.Aplique o deslizamento da tampa, começando pelo canto com o sRIMS e lentamente abaixe-o até tocar a graxa em todos os lados. Coloque uma pilha de três deslizamentos de cobertura em cada lado da retina montada como um espaçador. Use a borda longa de outro slide para pressionar o deslizamento da tampa para que o Monte fique plano e uniforme.Armazene os slides a quatro graus Celsius até a imagem. Comece colocando o slide no estágio do microscópio e localizando a amostra. Para obter imagens empilhadas de Z de amostras, primeiro concentre-se no sinal em cada canal individualmente e defina o tempo de exposição ou velocidade de varredura para fluorescência ou microscópios confocal, respectivamente.Defina o intervalo para a pilha Z, definindo manualmente o plano focal na parte superior e inferior da faixa desejada ou definindo o ponto médio e, em seguida, especificando um intervalo ao redor do ponto médio. Ajuste o tamanho da etapa ou o número de fatias conforme desejado. Capture a imagem e salve o arquivo original.Em seguida, exportado como um arquivo TIF ou outro formato desejado. Use a análise de imagem, software de escolha para ajustar o brilho e o contraste em cada canal até que a clareza ideal seja alcançada tanto nas imagens únicas quanto na renderização tridimensional da pilha Z. Quando processado com o protocolo CLARITY modificado, foi observada total transparência óptica em toda a espessura da retina em comparação com retinas de controle não processadas.As imagens empilhadas Z para cones rotulados de Arrestin em ONL, TH rotulados DE DAC's em INL, e RGCs marcados RBPMS em GCL são mostrados aqui. A localização relativa dos neurônios em toda a espessura da retina foi observada na imagem de sobreposição. A coloração th e as retinas inteiras do Monte foi comparada com imagens obtidas a partir da preparação padrão.Dendritos e processos semelhantes a axônios de DACs foram mais claramente revelados em uma retina processada de clareza do que em uma retina padrão. Os processos semelhantes ao Axon de DACs exibiram estruturas completas semelhantes a anéis em uma retina de claridade em comparação com uma retina padrão. As estruturas semelhantes ao anel de retina CLARITY tomadas usando microscopia de fluorescência eram quase idênticas às observadas usando microscopia confocal.Os processos semelhantes ao axônio também correram em direção à retina externa. A coloração imuno contra GluA2 e PSD-95 mostrou puncta distinta, revelando glua2 individual contendo receptores AMPA e locais pós-sinápticos putativos, respectivamente. Uma imagem de sobreposição mostrou algumas punctas nos processos da DAC.Os pontos de co-localização putativa foram apresentados em aviões XZ, YZ e XY e TH co-localizados claramente com GluA2 e PSD-95. É importante que a retina permaneça plana durante o processo de polimerização do hidrogel para que a retina limpa possa ficar plana para o processo de montagem e imagem.

immunostaining-whole-mount-retinas-with-clarity-tissue-clearing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese...

Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

ACT-PRESTO (clareza técnica de pressão ativo relacionado transferência eficiente e estável de macromoléculas em órgãos) permite o rápido e eficiente, mas barato compensação tecido e penetração anticorpo rápida nos tecidos foi afastada pelo difusão passiva ou parto assistido à pressão. Usando este método, uma vasta gama de tecidos pode ser apagada, por immunolabeled anticorpos múltiplos, e o volume-fotografada.

ACT-PRESTO: Clearing tecido biológico e Métodos imunomarcação for Imaging Volume

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

Nós descrevemos o procedimento para preparar...

Visualização do Sistema Nervoso embrionárias no Whole-mount Drosophila Os embriões

Identificação imunocitoquímica de periféricos subtipos de fibras nervosas sensoriais (e detecção da expressão da proteína nele) são fundamentais para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a sensação periférica. Aqui descrevemos métodos para a preparação de amostras de tecido periférico / visceral, tais como ossos, pele e nos membros, para a imunocoloração específico de fibras nervosas sensoriais periféricas.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Aprenda a técnica de imunostaining em retinas de monte inteiro usando o método CLARITY para visualização tridimensional de neurônios retinianos em camundongos. Este protocolo permite análise detalhada da morfologia celular e subcelular em estados de doença.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

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