Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Este protocolo permite a investigação da morfologia fina dos neurônios da retina e pode dar uma visão das alterações morfológicas celulares e subcelulares que ocorrem em estados da doença. Este método melhora significativamente a transparência óptica da retina e permite imagens tridimensionais de alta resolução, fiação de circuito e estruturas subcelulares finas de neurônios retinais na preparação hormonal da retina. Enuclear os olhos do rato com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de Petri com 0,1 M PBS.

Faça um pequeno buraco ao longo da junção da córnea com a agulha sob o microscópio de dissecção, em seguida, transfira o olho para formaldeído de 4% de potência por uma hora. Transfira o olho de volta para um prato com PBS. Sob um microscópio de dissecção, use uma tesoura de dissecção para cortar todo o caminho ao redor da junção corneoscleral.

Remova a córnea e a lente. Em seguida, corte-o na base do nervo óptico e descasque cuidadosamente a esclera com fórceps para isolar a retina. Faça quatro pequenos cortes uniformemente ao redor da retina e use uma fina escova de ponta mergulhada em PBS para colocá-lo lado GCL plano para baixo na forma de trevo em um pequeno corte quadrado de papel filtro nitrocelulose.

Pegue o canto do papel nitrocelulose com fórceps e coloque-o em uma placa de 48 poços com formaldeído de 4% de potência por uma hora, depois transfira o papel filtro e a retina para um poço com PBS e lave três vezes por cinco minutos cada. Descongele a solução A4P0 no gelo. Em seguida, transfira a retina para a solução A4P0 e incubar durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave.

Adicione óleo vegetal no poço para cobrir completamente a solução A4P0. Incubar em um banho de água a 40 graus Celsius por três horas sem tremer. Em seguida, lave três vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.

Incubar a retina em sulfato de dodecilo de sódio a 40 graus Celsius por dois dias com agitação suave, em seguida, transfira o papel filtro e a retina para PBS com Triton X-100 e lave cinco vezes por 90 minutos por lavagem. Após a lavagem final, armazene a retina a quatro graus Celsius em PBS-T com azida de sódio de 0,01% ou mova-se diretamente para a coloração imuno. Remova a retina do papel do filtro descascando-a suavemente com uma escova de ponta fina em PBS-T.

Incubado em anticorpo primário diluído em solução de bloqueio por dois dias a 40 graus Celsius com agitação suave. Após a incubação, lave cinco vezes por 90 minutos em PBS-T. Incubar a retina com anticorpos secundários apropriados diluídos em solução de bloqueio por dois dias a 40 graus Celsius com agitação suave.

Proteja as amostras da luz durante todo o restante do procedimento. Lave a retina cinco vezes por 90 minutos em 0,02 M tampão fosfato. Por fim, incubar a retina em solução de correspondência de índice refrativo à base de sorbitol a 40 graus Celsius durante a noite com agitação suave.

Delineie um deslizamento de tampa de vidro com um marcador permanente de ponta fina para marcar um limite quadrado na parte de trás de um slide de microscópio de vidro. Vire o slide e use uma seringa para traçar o limite com uma fina linha de graxa de silicone na parte frontal do slide. Deixe uma pequena lacuna em um canto para que o excesso de solução de montagem escape.

Transfira a retina para o centro da área delimitada e posicione-a com uma escova de ponta fina para que ela fique plana com o lado fotorreceptor contra o escorregador de vidro. Pipeta aproximadamente 60 microliters de sRIMS de modo que cobre a retina achatada e estende-se a um canto do gabinete. Certifique-se de que a retina permaneça plana e no lugar.

Aplique o deslizamento da tampa, começando pelo canto com o sRIMS e lentamente abaixe-o até tocar a graxa em todos os lados. Coloque uma pilha de três deslizamentos de cobertura em cada lado da retina montada como um espaçador. Use a borda longa de outro slide para pressionar o deslizamento da tampa para que o Monte fique plano e uniforme.

Armazene os slides a quatro graus Celsius até a imagem. Comece colocando o slide no estágio do microscópio e localizando a amostra. Para obter imagens empilhadas de Z de amostras, primeiro concentre-se no sinal em cada canal individualmente e defina o tempo de exposição ou velocidade de varredura para fluorescência ou microscópios confocal, respectivamente.

Defina o intervalo para a pilha Z, definindo manualmente o plano focal na parte superior e inferior da faixa desejada ou definindo o ponto médio e, em seguida, especificando um intervalo ao redor do ponto médio. Ajuste o tamanho da etapa ou o número de fatias conforme desejado. Capture a imagem e salve o arquivo original.

Em seguida, exportado como um arquivo TIF ou outro formato desejado. Use a análise de imagem, software de escolha para ajustar o brilho e o contraste em cada canal até que a clareza ideal seja alcançada tanto nas imagens únicas quanto na renderização tridimensional da pilha Z. Quando processado com o protocolo CLARITY modificado, foi observada total transparência óptica em toda a espessura da retina em comparação com retinas de controle não processadas.

As imagens empilhadas Z para cones rotulados de Arrestin em ONL, TH rotulados DE DAC's em INL, e RGCs marcados RBPMS em GCL são mostrados aqui. A localização relativa dos neurônios em toda a espessura da retina foi observada na imagem de sobreposição. A coloração th e as retinas inteiras do Monte foi comparada com imagens obtidas a partir da preparação padrão.

Dendritos e processos semelhantes a axônios de DACs foram mais claramente revelados em uma retina processada de clareza do que em uma retina padrão. Os processos semelhantes ao Axon de DACs exibiram estruturas completas semelhantes a anéis em uma retina de claridade em comparação com uma retina padrão. As estruturas semelhantes ao anel de retina CLARITY tomadas usando microscopia de fluorescência eram quase idênticas às observadas usando microscopia confocal.

Os processos semelhantes ao axônio também correram em direção à retina externa. A coloração imuno contra GluA2 e PSD-95 mostrou puncta distinta, revelando glua2 individual contendo receptores AMPA e locais pós-sinápticos putativos, respectivamente. Uma imagem de sobreposição mostrou algumas punctas nos processos da DAC.

Os pontos de co-localização putativa foram apresentados em aviões XZ, YZ e XY e TH co-localizados claramente com GluA2 e PSD-95. É importante que a retina permaneça plana durante o processo de polimerização do hidrogel para que a retina limpa possa ficar plana para o processo de montagem e imagem.