Name: Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a cultivar esferoides epidérmicos em 3D usando Dispase e queratinócitos humanos normais. Este método de alto rendimento permite modelar doenças cutâneas e estudar a plasticidade das células-tronco epidérmicas.

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A UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) forneceu acesso a equipamentos de triagem de imagens e células e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pela concessão 1R21CA201853. O MCF e o IRF recebem apoio parcial da concessão do NIH P20GM103499, SC INBRE. O MCF também recebe apoio da concessão do NIH P20GM109091. Yvon Woappi foi apoiado em parte por bolsas nih 2R25GM066526-06A1 (PREP) e R25GM076277 (IMSD), e por uma Bolsa pelo Programa de Professores Grace Jordan McFadden da UofSC. Geraldine Ezeka e Justin Vercellino foram apoiados por bolsas NIH 2R25GM06526-10A1 (PREP) na UofSC. Sean M. Bloos foi apoiado pelo Prêmio Magellan Scholar 2016 na UofSC.

O protocolo de coleta e manuseio de amostras de pele e isolamento de queratinócitos humanos foi revisado pela Universidade da Carolina do Sul (UofSC) IRB e classificado como "pesquisa não envolvendo seres humanos", pois os espécimes de prepúcio eram descartes cirúrgicos produzidos durante procedimentos cirúrgicos de rotina (circuncisão de meninos recém-nascidos) e eram completamente desprovidos de identificação de informações. O protocolo também foi revisado e aprovado pelo Comitê de Biossegurança da UofSC regularmente, e todos os funcionários do laboratório foram submetidos a treinamento de biossegurança laboratorial. Todos os procedimentos foram realizados em concordância com as normas de segurança e ética da UofSC.
1. Isolamento e cultura de queratinócitos humanos a partir de tecido neonatal de prepúcio
<ol><li>Prepare o meio de lavagem adicionando 0,1 M de tampão HEPES a 500 mL de meio KSFM e ajuste-o a um pH de 7,2. Esterilize o meio em um filtro de vácuo de 500 mL (tamanho de poros de 0,22 μm). O meio basal MCDB 153-LB também pode ser usado como uma solução alternativa de lavagem no lugar do KSFM.</li>
	<li>Em uma capa de fluxo laminar, lave o prepúcio neonatal com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL. Repita duas vezes.</li>
	<li>Transfira prepúcio lavado para uma placa de Petri estéril. Usando um bisturi e fórceps, raspe os tecidos adiposos e soltos da camada dérmica. Relave o prepúcio com 5 mL de mídia de lavagem em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Coloque o lado da epiderme prepúcio em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de enzima despase diluída em mídia de lavagem (50 U/mL).</li>
	<li>Transfira a placa para uma incubadora por 4 horas (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>Remova o prepúcio da incubadora e, em condições estéreis, transfira-o para uma placa de Petri. Usando fórceps finos, separe a epiderme da camada de derme.</li>
	<li>Coloque a epiderme em um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA. Usando um tubo sorológico de 5 mL, esmague mecanicamente a epiderme flutuante. Incubar por 15 min a 37 °C com vórtice periódico para 5 s a cada 5 min.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 2 mL de inibidor de trippsina de soja e misture por pipetação para neutralizar a trippsina.</li>
	<li>Suspensão celular centrífuga por 2 min a 450 x g, e depois por 8 min a 250 x g.</li>
	<li>Remova detritos flutuantes com fórceps, tomando cuidado para não desalojar a pelota celular. Aspirar cuidadosamente o supernaente da pelota celular.</li>
	<li>Resuspend pelotas em 12 mL de meio KSFM-scm completo e placa em um prato de 10 cm. Incubar prato durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).</li>
	<li>No dia seguinte, remova o meio usando uma pipeta aspirando e substitua por 12 mL completo KSFM-scm. Repita nos dias 4 e 7.</li>
	<li>Para manter o crescimento ideal das culturas normais de queratinócitos humanos (NHKc), as células de passagem 1:5 no dia 10 para evitar que as células atinjam maiores que 80% de confluência.</li>
</ol>2. Gerando culturas de epidermófera da pele in vitro
<ol><li>Prepare uma mistura de 5% de agarose adicionando 2,5 g de agarose a 50 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS), em uma garrafa de vidro de 50 mL. Garrafa de autoclave sob ciclo líquido. Deixe esfriar até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar as placas, coloque a garrafa de vidro resfriada contendo solução agarose em um béquer plástico 1 L recheado com 200 mL de água deionizada (dH2O). Derreter a mistura de agarose em um micro-ondas de nível de pesquisa por até 2 minutos, misturando o ágar a cada 60 s, inclinando suavemente a garrafa de um lado para o outro. ATENÇÃO: O derretimento do ágar no micro-ondas fará com que o recipiente de frasco fique extremamente quente, resultando em acúmulo de pressão. Liberar acúmulo de pressão a cada 30 s. Use equipamentos de proteção adequados para evitar ferimentos.</li>
	<li>Adicione 3 mL de 5% de relados a 12 mL KSFM-scm pré-equipado a 42 °C para uma concentração final de 1% de agarose (wt/vol). Opcional: pré-aqueça as pipetas sorológicas e as pontas da pipeta para evitar a polimerização prematura do ágar macio.</li>
	<li>Pipeta rápida 200 μL da mistura de 1% de ágar em poços individuais de uma placa de fundo redondo de 96 poços usando um pipettor multicanal(Figura 1A). Deixe a placa em ambiente estéril a 25 °C por 4h para permitir que a agarose polimerize completamente. NOTA: A experimentação pode ser interrompida aqui e continuada no dia seguinte. As placas de agarose polimerizadas podem ser mantidas a 37 °C até 24 h ou a 4 °C por até 48 h quando seladas com envoltório de parafilm. Placa quente a 37 °C em uma incubadora umidificada por pelo menos 1 h antes de usar.</li>
	<li>Passagem de NHKc formador de spheroids aspirando mídia e células de lavagem em 2 mL de PBS. Aspire PBS e adicione 2 mL de 0,25% Trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min a 37 °C ou até que todas as células se desprendem completamente. Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e lave as células da placa em um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando coloração azul trypan e um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.</li>
	<li>Aliquot 2 x 104 NHKc em 100 μL de KSFM-scm e semente em poços individuais de placa redonda de 96 poços previamente preparados. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).</li>
	<li>Usando um microscópio de contraste de fase invertida, analise bem semeado para formação da epidermófera. NOTA: As epidermosfófilas humanas dos queratinócitos humanos normais podem permanecer viáveis na cultura de suspensão 3D por até 96 h, embora com uma diminuição considerável na viabilidade celular(Figura 2).</li>
</ol>3. Ensaio de reesplação esferoide epidérmico
<ol><li>24-48 h após a formação da epidermófera 3D, adicione 4 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Alternativamente, amplie uma ponta de pipeta de 1 mL usando uma lâmina de barbear estéril para cortar a ponta.</li>
	<li>Incubar a placa durante a noite (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>Analise o esferoide semeado para fixação na parte inferior da placa e observe para propagar células usando um microscópio de contraste de fase invertida(Figura 3). Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.</li>
	<li>Passagem spheroid-derivado (SD) NHKc uma vez que atingem 70-80% de confluência e continuam com o ensaio de escolha. Monitore o SD-NHKc com frequência para evitar que as células atinjam total confluência na cultura, pois isso resulta em diferenciação prematura e prisão de crescimento celular(Figura 3E-F).</li>
	<li>O ensaio de reseferóide epidérmico modelos de ensaio mediado por queratinócitos, capturando cada uma das fases sequenciais chave da plasticidade regenerativa epidérmica: a) manutenção homeostática, b) mobilidade de linhagem de estresse/mobilidade de linhagem de estresse d (Figura 1B; Tabela 2). Este ensaio também pode ser usado para produzir populações celulares para culturas organotípicas de jangadas ou para modelar neoplasia mediada pelo HPV, como demonstrado em nosso trabalho anterior 11,12.</li>
</ol>Rastreamento celular de fluorescência 4.3D
<ol><li>Em um prato de 6 cm, transfeto spheroid-formando culturas 2D monocamada NHKc com 1 μg de pMSCV-IRES-EGFP vetor plasmid carregando o gene de proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP). Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade) microscópio(Figura 4A). NOTA: É importante que a transfecção seja concluída em condições livres de antibióticos sem soro.</li>
	<li>Sem remover a mistura de transfecção, adicione 2 mL de KSFM-scm pré-armado às células. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).</li>
	<li>Aspire todas as mídias de transfecção de células de placa e alimentação com 3 mL de KSFM-scm pré-armados. Avalie a presença de células expressas por EGFP sob o canal FITC de um microscópio fluorescente.</li>
	<li>Passagem e semente 2 x 104 células transfectadas de EGFP em poços individuais de uma placa de fundo redondo previamente preparada. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade). Visualize e monitore o movimento decélulas eferóides EGFP sob o canal FITC de um microscópio de fluorescência(Figura 4B-C).</li>
	<li>24 h após o revestimento, adicione 3 mL de KSFM-scm pré-armado a um prato de 6 cm. Use uma ponta de pipeta de 1 mL larga para transferir um único esferoide para a placa, garantindo não quebrá-lo. Incubar placa durante a noite (37 °C, 5% CO2, 95% umidade).</li>
	<li>Observe e analise a propagação SD-NHKcEGFP usando um microscópio de fluorescência. Alimentar células a cada 96 h removendo suavemente 2 mL da mídia dentro da placa e adicionando lentamente 2 mL de mídia KSFM-scm fresca à placa.</li>
	<li>Colher SD-NHKCEGFP para isolamento facs ou ensaios de escolha.</li>
</ol>5. Caracterização de subséduas derivadas de esferoides (SD) pela FACS
<ol><li>Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em 2 mL de PBS. Remova o PBS e adicione 2 mL de 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar a 37 °C por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente.</li>
	<li>Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL. Centrifugar a 250 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspend pelotas em 1 mL de PBS. Quantifique a viabilidade celular usando o azul trypan e um contador automatizado de células do hemócitometro.</li>
	<li>Aliquot 100 μL contendo 0,1-4 x 106 células NHKc a tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Coloque o tubo no gelo em um ambiente escuro, criado desligando luzes brilhantes dentro do capô laminar.</li>
	<li>Adicione 2 μL de anti-integrinα6 conjugados fitc e 2 μL de anti-EGFR conjugado pe aos tubos para obter uma diluição de 1:50. Prepare um tubo sem anticorpos adicionados para servir como o controle não manchado. Incubar tubos no gelo no escuro ou a 4 °C por 30 min. O uso de contas ou uma linha SCC da pele pode servir como controle positivo, já que as células SCC da pele expressam níveis elevados de integrinα6 e EGFR.</li>
	<li>Realize a análise de citometria de fluxo usando o citômetro de fluxo de escolha contendo lasers apropriados.</li>
	<li>Use os controles negativos e positivos para estabelecer portões. Classificar a subpopulação de células delo integrinα6/EGFR; estas são a fração de células-tronco epidérmicas. Integrinα6hi/EGFRhi cells são a fração celular progenitora proliferativa. As célulasde oi integrinα6lo/EGFR são a fração celular progenitora comprometida(Figura 4D). A classificação dos tubos FACS deve conter pelo menos 1 mL de KSFM-scm gelado.</li>
	<li>Teste para capacidade proliferativa de subpopulações celulares classificadas transferindo o conteúdo de cada tubo de classificação respectivo para um tubo cônico de 15 mL contendo 10x o volume de células classificadas em PBS. NOTA: É importante remover todas as células presas à borda, encanar a parede do tubo FACS de classificação várias vezes, pois os queratinócitos podem muitas vezes aderir lá.</li>
	<li>Centrifugar tubos de 15 mL a 250 x g por 5 min. Remova a pelota supernascida e resuspendida em 12 mL de KSFM-scm. Transfira as células resuspended em uma placa de 6 cm e incubar durante a noite (37 °C, 5% DE CO2,95% de umidade).</li>
	<li>No dia seguinte, remova a mídia nas placas e adicione 8 mL de KSFM-scm pré-aquecido. Incubar a 37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade. Re-alimentar células com 12 mL de meio a cada 3 dias até 70-80% confluentes(Figura 4E).</li>
</ol>6. Imunofluorescência e coloração de epidermosférteis para marcadores de células-tronco basais
<ol><li>Transfira epidermoses para tampas revestidas com poli-lisina. Permita que o SD-NHKc se propague até 75% de confluente.</li>
	<li>Lave as células duas vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.</li>
	<li>Fixar células com 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Células permeabilizes com 0,5% Triton X-100 em 1% de glicocina. Bloqueie usando 0,5% de BSA e 5% soro de cabra por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar amostras com anticorpos contra P63 (1:200) e citokeratina 14 (1:200) em solução de bloqueio durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave três vezes com PBS (4 °C) contendo Interpol 20 (PBST), seguida de incubação com anticorpos secundários FITC-e Alexa 568 (diluição de 1:1000).</li>
	<li>Núcleos de manchas com 4', 6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI) (diluição 1:5000) antes da montagem das células.</li>
	<li>Observe células usando um microscópio com capacidade fluorescente com linhas laser FITC e PE(Figura 4F).</li>
</ol>7. Análise transcricional das culturas da epidermófera
<ol><li>Configurar placas triplicadas de culturas NHKc de baixa passagem para isolar o RNA pode ser de culturas derivadas de monóbóias, esferoides da mesma linha celular autóloga.</li>
	<li>As epidermómos correspondentes da piscina 3-5 em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL. Colher separadamente culturas autólogas de SD-NHKc e monocamadas 2D.</li>
	<li>Isole o RNA total dos três grupos.</li>
	<li>Realize a transcrição reversa com 1 μg de RNA total.</li>
	<li>Utilizando cDNA, execute PCR em tempo real, utilizando GAPDH como controle interno(Tabela 1).</li>
	<li>Validar o tamanho do produto amplicon por eletroforese de gel agarose (2% v/v). NOTA: Para o perfil transcriômico de culturas epidermóferas usando análise de microarray de genoma inteiro, isole o RNA total das culturas de massa de um único doador NHKc e correspondente SD-NHKc do mesmo doador, em seis réplicas cada.</li>
	<li>Avalie a qualidade do RNA usando um bioanalílise para alcançar os Números de Integridade do RNA (RIN) variando de pelo menos 9,0 a 9,1.</li>
	<li>Realize experimentos de microarray amplificando e biotiningando amostras totais de RNA.</li>
	<li>Transcreva reversa 100 ng de RNA total por amostra em ds-cDNA usando primers aleatórios NNN contendo uma sequência de promotor de polimerase T7 RNA.</li>
	<li>Adicione a polimerase T7 RNA às amostras de cDNA para amplificar o RNA e, em seguida, copie o RNA para ss-cDNA. Degrade o excesso de RNA usando RNase H.</li>
	<li>Fragmentar moléculas de SSCDNA e rotular com biotina.</li>
	<li>Amplie amostras rotuladas por 16 h a 45 °C.</li>
	<li>Hibridize amostras usando um forno de hibridização e um kit de lavagem e mancha.</li>
	<li>Matrizes hibridizadas de lavagem e coloração.</li>
	<li>Digitalize os arrays usando um sistema e uma estação de trabalho do computador.</li>
	<li>Após a conclusão das varreduras de array, importe arquivos de intensidade celular (CEL) em software de console de expressão e processe no nível genético usando arquivo de biblioteca e algoritmo robust Multichip Analysis (RMA) para gerar arquivos CHP.</li>
	<li>Depois de confirmar a qualidade dos dados no Expression Console, importe arquivos CHP contendo sinais de expressão log2 para cada teste em um software de análise de transcriptome para analisar respostas transcricionais específicas do tipo celular usando uma análise unidirecional entre os sujeitos de variância.</li>
</ol>8. Avaliação da eficiência formadora de colônias SD-NHKc
<ol><li>Aspirar a mídia das placas quando as células atingirem 70-80% de confluência. Lave as células três vezes em PBS (4 °C) por 5 min cada.</li>
	<li>Fixar células com 3 mL de 100% de metanol (4 °C) por 15 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada.</li>
	<li>Células de manchas em 3 mL de 10% Giemsa por 30 min. Lave três vezes em PBS por 5 min cada. Deixe as células secarem durante a noite.</li>
	<li>Analisar a formação de colônias no dia seguinte e quantificar o número de colônias obtidas</li>
</ol>9. Determinar duplicações populacionais do SD-NHKc
<ol><li>Passagem SD-NHKc e culturas de monocamadas 2D autólogas correspondentes aspirando mídia antiga e células de lavagem em PBS de 2mL. Remova o PBS e adicione 2 mL 0,25% trypsin-EDTA às células lavadas. Incubar por 5 min ou até que todas as células se desprendem completamente (37 °C, 5% DE CO2, 95% de umidade).</li>
	<li>Adicione 2 mL de Inibidor de Trippsina de Soja à placa e transfira células para um tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 250 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova a pelota supernasce e resuspend em 12 mL de KSFM-scm.</li>
	<li>Células de sementes em baixa densidade 1-2 x 104 NHKc em pratos individuais de 10 cm e incubam durante a noite (37 °C, 5% DE CO2,95% de umidade).</li>
	<li>Placas de alimentação com 8 mL KSMF-scm no dia seguinte. Alimente a cada 4 dias até pelo menos 25% confluentes, depois se alimente a cada 2 dias.</li>
	<li>Células de passagem em série 1:5 em 60 cm pratos até que a capacidade proliferativa celular esteja esgotada. Quantifique a viabilidade celular por manchas azuis de trypan. Determinar duplicações populacionais em cada passagem usando a fórmula: log(N/N0) / log2, onde N representa o número total de células obtidas em cada passagem e N0 representa o número de células banhadas no início do experimento.</li>
</ol>

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<li>Kuo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+targeting+versatile+tissue+bioassays+using+a+PDMS-based+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array.</a> Scientific Reports. , (2017).</li>
<li>Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSE94244+-+Expression+data+from+normal+human+spheroid-forming+keratinocytes+in+monolayer+mass+culture+and+from+corresponding+cornified-like+spheroid+ring+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Omnibus+%28GEO%29%22%5BJournal%5D)">GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures.</a> Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm relações financeiras para divulgar.

O uso de sistemas de cultura esferoide 3D tem tido ampla utilidade na avaliação da haste celular. Esses sistemas têm sido demonstrados para melhorar o enriquecimento das células-tronco teciduais13, mas sua utilidade para o estudo de células-tronco epidérmicas humanas tem sido explorada limitadamente. Aqui, descrevemos uma estratégia para enriquecer células-tronco de queratinócitos humanos usando técnicas de cultura 3D. Neste sistema, o NHKc é cultivado como suspensões eferóides multicelulares auto...

O epitélio estratificado dos mamíferos é a arquitetura epitelial mais complexa em todos os sistemas vivos e está frequentemente sujeito a danos e lesões. Como um tecido protetor, o epitélio estratificado evoluiu para gerar uma resposta complexa e eficaz de danos teciduais. Após a lesão, essas células devem ativar programas de plastifica de linhagem, que permitem migrar para o local lesionado e realizar o reparo1,2,3. Essa resposta multifacetada ocorre em várias etapas sequenciais que permanecem mal compreendidas.
Um grande obstáculo no estudo do intrincado processo de regeneração epitelial está na escassez de sistemas de modelos de alto rendimento que podem capturar atividades celulares dinâmicas em estágios definidos de regeneração celular. Enquanto os modelos de mouse in vivo oferecem uma visão relevante sobre a cicatrização de feridas e mais intimamente recapitulam o processo regenerativo humano, seu desenvolvimento exige esforços trabalhosos e custo significativo, limitando sua capacidade de rendimento. Existe, portanto, uma necessidade crítica de estabelecer sistemas que permitam a investigação funcional da regeneração do tecido epitelial humano em alta escala de rendimento.
Nos últimos anos, várias tentativas foram feitas para enfrentar o desafio de escalabilidade. Isso é visto através de uma grande expansão de modelos inovadores baseados em células in vitro e ex vivo que imitam de perto o contexto regenerativo in vivo. Isso inclui avanços nas culturas organ-on-chip4, esferoide5,organoide6e organotípica7. Esses sistemas baseados em células 3D oferecem vantagens únicas e apresentam limitações experimentais distintas. Até o momento, a cultura esferoide continua sendo o modelo de cultura celular 3D mais econômico e amplamente utilizado. E embora vários relatórios tenham indicado que culturas esferoides podem ser usadas para estudar características de células-tronco da pele, esses estudos têm sido conduzidos em grande parte com tecido animal8,9, ou com fibroblastos dérmicos10,sem praticamente nenhum relato caracterizando completamente as propriedades regenerativas das culturas esferoides epidérmicas humanas. Neste protocolo detalhamos o desenvolvimento funcional, a cultura e a manutenção das culturas eferóides epidérmicas de queratinócitos humanos normais (NHKc). Descrevemos igualmente a utilidade deste sistema para modelar as fases sequenciais da regeneração epidérmica e da plasticidade das células-tronco queratinócitos in vitro.

<table><tbody><tr><td>Plataforma Affymetrix</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Para experimentos de microarray</td></tr><tr><td>Affymetrix ' s HuGene-2_0-st arquivo de biblioteca</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Process</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Para experimentos de microarray</td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Usado para isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Console de Análise Software versão 3.0.0.466</td><td></td><td></td><td>analisa respostas transcricionais específicas do tipo de célula usando análise de variância unidirecional entre sujeitos</td></tr><tr><td>BD FACSAria II citômetro de fluxo</td><td>Beckman</td><td></td><td>Para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Console Software versão 3.0.0.466/Console de expressão Software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para confirmar a qualidade dos dados</td></tr><tr><td>Citoqueratina 14</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-53253</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>Para meios celulares</td></tr><tr><td>anti-integrina&alfa conjugada com FITC; 6</td><td>Abcam</td><td>ab30496</td><td>Para análise FACS</td></tr><tr><td>GeneChip Command Console 4.0 software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para confirmar a qualidade dos dados</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para lavagem e coloração de matrizes hibridizadas</td></tr><tr><td>GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para hibridização e amplificação de RNA total</td></tr><tr><td>Forno de Hibridização GeneChip 640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para hibridização e amplificação de RNA total | Amplificar amostras rotuladas</td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization Wash e Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para lavagem e coloração de matrizes hibridizadas</td></tr><tr><td>Sistema GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Scanning matrizes hibridizadas</td></tr><tr><td>Kit de reagentes GeneChip WT PLUS</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para amplificação de RNA total biotinilante</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos básicos humanos (hFGF basic/FGF2)</td><td>Cell Tecnologia de sinalização</td><td>8910</td><td>para meios celulares</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico humano (hEGF)</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>8916</td><td>para meios celulares</td></tr><tr><td>Insulina humana</td><td>Millipore Sigma</td><td>9011-M</td><td>Para meios celulares</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708880</td><td>usado para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>usado para RT-qPCR</td></tr><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005041</td><td>Suplementado com 1% de penicilina/estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml fator básico de crescimento de fibroblastos, 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) e 4 &micro; g/ml de insulina</td></tr><tr><td>KSFM-scm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005042</td><td>Suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml fator básico de crescimento de fibroblastos, 0,4% de albumina de soro bovino (BSA) e 4 &micro; g / ml de insulina</td></tr><tr><td>MCDB 153-LB meio basal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>MCDB 153-LB meio basal com tampão HEPES</td></tr><tr><td>NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6 / PK, 12 / CS</td><td>Stellar Scientific</td><td>NST230111</td><td>Para imunocoloração</td></tr><tr><td>P63</td><td>Thermo Scientific</td><td>703809</td><td>1:200 diluição</td></tr><tr><td>PE-conjugado anti-EGFR (San Jose, CA; número de catálogo)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555997</td><td>Para análise FACS</td></tr><tr><td>vetor de plasmídeo pMSCV-IRES-EGFP Addgene</td><td></td><td>20672</td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>Promega TransFast kit</td><td>Promega</td><td>E2431</td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Para experimentos de microarray</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Único uso estéril das unidades de filtro do vácuo</td><td>Thermo científico</td><td>09-740-63D</td><td>para o uso estéril de</td></tr><tr><td>Zeiss Axionvert 135 do microscópio da fluorescência</td> de <td>Zeiss</td><td></td><td>com Axiovision Rel. 4,5</td></tr></tbody></table> software

estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

A desregulação epitelial é um nó para uma variedade de condições e doenças humanas, incluindo ferimentos crônicos, inflamação e mais de 80% de todos os cânceres humanos. Como tecido forro, o epitélio da pele é frequentemente sujeito a lesões e tem se adaptado evolutivamente adquirindo a plasticidade celular necessária para reparar tecido danificado. Ao longo dos anos, vários esforços foram feitos para estudar a plasticidade epitelial usando modelos in vitro e ex vivo baseados em células. No entanto, esses esforços têm sido limitados em sua capacidade de recapitular as várias fases da plasticidade celular epitelial. Descrevemos aqui um protocolo para a geração de esferoides epidérmicos 3D e células derivadas de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos neonatais. Este protocolo descreve a capacidade das culturas eferóides epidérmicas de modelar funcionalmente estágios distintos da plasticidade generativa de queratinócitos e demonstra que a re-platide epidérmica pode enriquecer culturas heterogênicas normais de queratinócitos (NHKc) para subpopulações intenα6hi/EGFRlo queraatinóte com características avançadas de tronco. Nosso relatório descreve o desenvolvimento e manutenção de um sistema de alto rendimento para o estudo da plasticidade da queratinócito da pele e da regeneração epidérmica.

Durante o ensaio da epidermófera da pele, as culturas NHKc são semeadas em poços revestidos de agarose de uma placa de 96 poços(Figura 1A). As células formadoras de esferoides devem se auto-agregar dentro de 48h. A formação de esferoides autônomos pode ser avaliada a partir de 24 horas usando um microscópio de contraste de fase invertido padrão. formação da epidermófera da pele e re-plating modelo de ensaio várias fases da regeneração do tecido epidérmico(Figura 1B</stro...

Aqui descrevemos um protocolo para o cultivo sistemático de esferoides epidérmicos na cultura de suspensão 3D. Este protocolo possui amplas aplicações para uso em uma variedade de tipos de tecido epitelial e para a modelagem de várias doenças e condições humanas.

Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Este protocolo apresenta um novo método para o cultivo e manutenção de culturas epidérmicas da esfera, e a estratégia de investigá-las de perto usando o ensaio de replação esferoide. Comece preparando o meio de lavagem como descrito no manuscrito do texto. Em uma capa de fluxo laminar, lave o prepúcio neonatal duas vezes com cinco mililitros de mídia de lavagem em um tubo cônico de cinco mililitros, em seguida, transfira o prepúcio lavado para uma placa de Petri estéril.Usando um bisturi e fórceps, raspe o tecido adiposo e os tecidos conjuntivos soltos da camada dérmica, em seguida, recue o prepúcio com mídia de lavagem. Coloque o lado da epiderme prepúcio em uma placa de seis poços contendo dois mililitros de enzima Dispase diluída em mídia de lavagem. Transfira a placa para uma incubadora por quatro horas.Após a incubação, transfira o prepúcio para uma placa de Petri e use fórceps finos para separar a epiderme da camada de derme. Coloque a epiderme em um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA. Esmague a epiderme flutuante usando uma pipeta serológica de cinco mililitros e incuba-a por 15 minutos a 37 graus Celsius com vórtice periódico por cinco segundos a cada cinco minutos.Após a incubação, adicione dois mililitros de inibidor de trippsina de soja e misture-o por pipetação para neutralizar a trippsina, em seguida, centrífugue a suspensão celular. Resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio KSFM-SCM completo e aplaque as células em uma antena de 10 centímetros para incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio usando uma pipeta aspiradora e substitua-a por 12 mililitros de KSFM-SCM completo.Repita isso nos dias quatro e sete. Prepare a mistura de 5% de agarose adicionando 2,5 gramas de agarose a 50 mililitros de PBS em uma garrafa de vidro de 100 mililitros. Autoclave a garrafa no ciclo líquido e deixe esfriar até a temperatura ambiente.Para preparar as placas, coloque o vidro resfriado contendo solução agarose em um copo de um litro cheio de 200 mililitros de água deionizada. Derreta a mistura de agarose em um micro-ondas de nível de pesquisa por até dois minutos, misturando a agarose a cada 60 segundos, inclinando suavemente a garrafa de um lado para o outro. Adicione três mililitros de 5%de retração derretida a 12 mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 42 graus Celsius para uma concentração final de 1%de agarose.Adicione 200 microliters da mistura de 1% de ágar a cada poço de uma placa de 96 poços usando uma pipetter multicanal. Em seguida, deixe a placa em um ambiente estéril a 25 graus Celsius por quatro horas. Passagem de queratinócitos humanos normais formadores de spheroid por meio de mídia aspirada e células de lavagem em dois mililitros de PBS.Aspire PBS e adicione dois mililitros de 0,25% Trypsin-EDTA às células lavadas. Em seguida, incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione dois mililitros de inibidor de trippsina de soja à placa e lave as células da placa em um tubo de 15 mililitros.Centrifugar a 250 vezes G por cinco minutos. Resuspenque a pelota celular em um mililitro de PBS e quantifique as células usando a coloração Trypan Blue. Aliquot 20.000 queratinócitos humanos normais em 100 microlitres de KSFM-SCM e semeou as células em cada poço da placa de 96 poços previamente preparada.Em seguida, incubar a placa durante a noite. Usando um microscópio de contraste de fase invertida, analise os poços semeados para a formação da esfera de epiderme. 24 a 48 horas após a formação da esfera de epiderme 3D, adicione quatro mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 37 graus Celsius a um prato de seis centímetros.Usando uma ponta de pipeta de um mililitro largo, transfira um único esferoide para a placa e incubar a placa durante a noite. Analise o esferoide semeado para fixar ou propagar células usando um microscópio de contraste de fase invertida. Alimentar células a cada 96 horas removendo a mídia e adicionando dois mililitros de mídia KSFM-SCM frescos à placa.Passagem 70 a 80% de queratinócitos humanos normais derivados de spheroid e culturas monocamadas 2D como demonstrado anteriormente. Em seguida, quantifique a viabilidade celular usando o Trypan Blue e um contador de células automatizado. Aliquot 100 microliters contendo 100.000 a 4 milhões de queratinócitos humanos normais em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro.Coloque os tubos no gelo em um ambiente escuro desligando as luzes brilhantes dentro do capô laminar. Adicione dois microliters de fitc-conjugado anti-integrin alfa seis e dois microliters de pe-conjugado anti-EGFR aos tubos para obter uma diluição de um a 50. Prepare um tubo sem anticorpos adicionados para servir como o controle não manchado.Incubar os tubos no gelo no escuro por 30 minutos. Realize a análise de citometria de fluxo com lasers apropriados. Use os controles negativos e positivos para estabelecer portões.Classifique a subpopulação da fração de células-tronco epidérmicas, a fração celular progenitora proliferativa e a fração celular progenitora comprometida. Teste para capacidade proliferativa de subpopulações celulares classificadas transferindo o conteúdo de cada tubo de triagem respectivo para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 vezes o volume de células classificadas em PBS. Centrifugar os tubos a 250 vezes G por cinco minutos.Remova o supernatante e resuspenda a pelota em quatro mililitros de KSFM-SCM. Transfira as células resuspended para uma placa de seis centímetros e incubar durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% com 95% de umidade. No dia seguinte, remova a mídia das placas e adicione quatro mililitros de KSFM-SCM pré-armados a 37 graus Celsius a cada três dias até que 70 a 80% de confluência seja alcançada.A capacidade autônoma de formação de esferoides epidérmicos de queratinócitos humanos normais na cultura 3D foi avaliada usando o ensaio da esfera da epiderme da pele. A agregação celular não esférica não foi considerada como formação adequada da esfera de epiderme. A agregação densa em forma de esfera foi considerada uma marca registrada da formação espontânea de esferoides.Foi necessário usar mais de duas vezes 10 para as quatro células para garantir a agregação espontânea adequada. O plantio de esferas de epiderme na cultura 2D resultou na proliferação de um pequeno e viável queratinócitos humanos normais. É importante manter essas culturas abaixo de 100% de confluência, pois isso pode prejudicar consideravelmente seu crescimento e estado de células-tronco na cultura.O processo de formação epidérmica de esferoides foi rastreado funcionalmente ao nível de célula única por células transfeinadas com um repórter fluorescente. Os queratinócitos humanos normais derivados de spheroid são integrin alfa seis de altura e EGF são células baixas. As células geralmente compõem cerca de 25% das culturas.A caracterização dessa subpopulação de queratinócitos semelhante ao caule foi alcançada pela análise imunostaining da citokeratina basal 14 e da proteína tumoral 63. O ensaio de replação esferoide é uma estratégia eficaz para o enriquecimento de células-tronco epidérmicas da pele humana neonatal. Este sistema pode ser empregado como um modelo baseado em células de alto rendimento para investigar doenças cutâneas, como cicatrização de feridas e câncer.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo abrangente e detalhado sobre como gerar pele organotípica humana geneticamente modificada a partir de queratinócitos epidérmicos e derme humana desvitalizada.

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Aqui nós apresentamos um protocolo para isolar eficientemente queratinócitos humanos primários de tecidos de pele de adultos. Este método simplifica o procedimento convencional usando o Y-27632 de inibidor ROCK no meio de inoculação espontaneamente separar células epidérmicas de células dérmicas.

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

O objetivo deste protocolo é isolar os queratinócitos epidérmicos da pele dorsal de camundongos adultos para uma variedade de aplicações a jusante, como biologia molecular, bioquímica, triagem de células ativadas por fluorescência e usos primários in vitro (por exemplo, clonogênicos queratinócitos).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Este protocolo descreve a cultura de queratinócitos recém-obtidos (passagem 0) para uso em imagens de células vivas.

Geração de culturas primárias para imagens de células vivas de queratinócitos

Aqui, fornecemos um método para análise de imagem de células vivas que pode ser usado para rastrear manualmente as linhagens de queratinócitos de passagem 0 e que permite a coleta de métricas de proliferação, incluindo o destino da divisão celular e a duração do ciclo celular.

Imagens de células vivas com fotografia de lapso de tempo para estudar a cinética de proliferação de queratinócitos epidérmicos

Este protocolo descreve um método para produzir organoides da pele contendo folículos pilosos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido planar e fisiologicamente relevante para replicar a arquitetura e a função da pele.

Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

Aprenda a cultivar esferoides epidérmicos em 3D usando Dispase e queratinócitos humanos normais. Este método de alto rendimento permite modelar doenças cutâneas e estudar a plasticidade das células-tronco epidérmicas.

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Estabelecendo um sistema de cultura esferoide epidérmico de alta produtividade para modelar a plasticidade das células-tronco de ceratinócito

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