Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial
18 de fevereiro de 2021
Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.
Este método permite aos investigadores avaliar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e a face. A principal vantagem dessa técnica é que isola o prosencéfalo basal para avaliação e evita a contaminação com células da crista neural, o que confundiria a análise. A parte difícil desta técnica é a remoção do prosencéfalo do hospedeiro e a substituição pelo tecido doador.
Quem demonstrará o procedimento será Diane Hu, pesquisadora do laboratório do Dr. Ralph Marcucio. Para começar, prepare mídia DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e tungstênio afiado. Usando uma seringa de 10 mililitros e uma agulha calibre 18, remova 0,5 mililitros de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo.
Faça um pequeno furo em cima da concha usando a ponta da tesoura. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva sobre o orifício e corte uma abertura circular para expor o embrião. Manchar o embrião com vermelho neutro.
Colher enxertos de tecido do lado esquerdo do prosencéfalo basal do estágio sete ou oito embriões. Use agulhas curvas de tungstênio afiadas para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo. Para não incluir a endoderme subjacente, deslize a agulha abaixo do prosencéfalo e paralela ao eixo do tubo neural.
Retirar o enxerto do embrião doador usando a pipeta de transferência de vidro e transferi-lo para DMEM contendo vermelho neutro por dois minutos para corá-lo. Em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha vermelho neutro até estar pronto para o enxerto. Incubar ovos fertilizados de frango branco Leghorn a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada até o estágio de Hamburger-Hamilton sete a oito.
Expor embriões conforme demonstrado anteriormente. Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando e, em seguida, removendo um pedaço de 0,3 por 0,2 milímetro do prosencéfalo basal para acomodar o enxerto. Evite a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita.
Após a transferência do enxerto para o hospedeiro, posicione-o para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro. Coloque a fita bem sobre o orifício e devolva os embriões à incubadora de 37 graus Celsius até que estejam prontos para análise. Inicialmente, as quimeras eram criadas a partir do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos.
Usando o anticorpo QCPN, as células de codorna foram visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro. O sistema codorniz-pintinho confirmou que todo o enxerto era composto apenas por tecido neural e não estava contaminado com outros tipos celulares. O transplante de tecido de codorna em embriões de pato levou a quimeras severamente deformadas devido a um cérebro de codorna de desenvolvimento mais rápido.
Para tanto, foi realizado o transplante de tecidos de pato em embriões de galinha. As quimeras de pato-pintinho resultantes sugerem que o cérebro participa da regulação da morfologia. Hibridização de montanha inteira C2 foi usada para avaliar a expressão de ouriços Sonic em quimeras.
Semelhante à morfologia, a expressão do ouriço Sonic no lado do pato da quimera parecia mais parecida com pato. A preparação do site host exige prática. Um grande número de embriões não sobrevive, então criar um grande número de quimeras pode ajudar a garantir amostras adequadas para análise.
Este método permitiu avaliar como os sinais do cérebro moldam o domínio de expressão do ouriço Sonic na zona ectodérmica frontonasal.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que permite aos pesquisadores avaliar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o rosto durante o desenvolvimento craniofacial. O método isolaa o prosencéfalo basal para avaliação, impedindo a contaminação por células da crista neural.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Desenvolvimento Craniofacial
- Técnicas de Transplante de Tecidos
Antecedentes
- O prosencéfalo basal desempenha um papel fundamental no desenvolvimento craniofacial.
- Compreender as interações teciduais é essencial para a biologia do desenvolvimento.
- A contaminação por células da crista neural pode confundir a análise.
- O isolamento do prosencéfalo basal permite uma avaliação mais clara de suas propriedades de sinalização.
Objetivo do Estudo
- Testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal.
- Desenvolver um método confiável para transplante de tecido.
- Ampliar a compreensão dos mecanismos do desenvolvimento craniofacial.
Métodos Utilizados
- Preparação do meio DMEM com vermelho neutro.
- Uso de pipeta de transferência de vidro e tungstênio afiado.
- Remoção da albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo utilizando uma seringa.
- Substituição do prosencéfalo do hospedeiro por tecido doador.
Resultados Principais
- A técnica isola efetivamente o prosencéfalo basal para análise.
- Demonstração do procedimento por um cientista pesquisador.
- Avaliação bem-sucedida das interações teciduais sem contaminação.
- Informações sobre o papel do prosencéfalo basal no desenvolvimento craniofacial.
Conclusões
- A técnica de transplante é uma ferramenta valiosa para o estudo do desenvolvimento craniofacial.
- O isolamento do prosencéfalo basal aumenta a precisão das avaliações do desenvolvimento.
- Este método pode ser aplicado em pesquisas futuras em neurociência do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite uma avaliação precisa da sinalização tecidual no desenvolvimento craniofacial ao isolar a porção basal do prosencéfalo das contribuições confundidoras das cristas neurais. Ele auxilia na redução de riscos mecanicistas na validação de alvos ao esclarecer como os sinais derivados do cérebro regulam vias morfogenéticas como a do Sonic hedgehog na zona ectodérmica frontonasal. A abordagem fornece um sistema relevante para doenças, útil para avaliar vias de desenvolvimento com confiança preditiva nos estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas sobre as interações entre tecido cerebral e facial no desenvolvimento de vertebrados.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos ao isolar as propriedades de sinalização do prosencéfalo basal.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva ao associar a manipulação do prosencéfalo basal a alterações nos domínios de expressão de SHH.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas quiméricos validados para avaliação quantitativa da expressão de morfógenos.
- Valor Operacional: Padroniza o transplante de tecidos para obter leituras de ensaio reprodutíveis em diferentes condições experimentais.
- Escalabilidade: Facilita a geração de múltiplas quimeras para superar baixas taxas de sobrevivência e garantir robustez analítica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas mecanicistas na fase de pesquisa a modelos pré-clínicos de padrões craniofaciais.
- Redução de Riscos Mecanisticos: Esclarece os reguladores upstream do SHH, uma via-chave na modelagem de distúrbios congênitos.
- Sistema Relevante para Doenças: Utiliza quimeras aviárias para estudar mecanismos conservados no desenvolvimento facial de vertebrados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais ensaios de interação com tecidos informam a confiança no alvo antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses sobre centros de sinalização na morfogênese craniofacial.
- Prontidão do Ensaio: Gera sistemas biológicos padronizados para análise quantitativa da expressão de SHH.
- Análises: Permite a hibridização in situ em preparações inteiras para medir alterações na expressão gênica espacial como leitura principal.
- Pesquisa Translacional: Fornece continuidade mecanicista desde o enxerto de tecido neural até os resultados do fenótipo facial.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliar as contribuições tecido-específicas em vias de desenvolvimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar sinais do prosencéfalo basal no desenvolvimento facial.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de técnicas padronizadas de enxertia e preparação do hospedeiro.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao esclarecer reguladores upstream de vias passíveis de intervenção farmacológica, como a via SHH.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados validados de interação tecidual.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação microcirúrgica de tecidos e em embriões de aves.
- Depende de ferramentas especializadas, incluindo agulhas de tungstênio afiadas e pipetas de vidro para transferência.
- Necessita de protocolos padronizados de incubação e estadiamento para embriões doadores e receptores.
- Envolve a otimização do preparo do local do enxerto para prevenir vazamento de gema e garantir a viabilidade do hospedeiro.
- Limitado por baixas taxas de sobrevivência embrionária, exigindo um grande número de amostras para análises confiáveis.
