Name: Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Aprenda a criar quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o rosto durante o desenvolvimento craniofacial. Esta técnica isola o tecido neural evitando contaminação por células da crista neural.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de prêmio R01DE019648, R01DE018234 e R01DE019638.

Pato Pekin branco (Anas platyrhynchos), galinha Leghorn branco (Gallus gallus) e codorna japonesa (Cortunix coturnix japonica) são incubados a 37 °C em câmara umidificada até estágio combinado em HH7/817.
1. Preparação do tecido doador
NOTA: A preparação de reagentes e ferramentas e a forma de abrir ovos para manipulação experimental foram descritas6.
<ol><li>Prepare meios DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e agulhas de tungstênio afiadas.</li>
	<li>Expor embriões (como mostrado em6).</li>
	<li>Colher enxertos teciduais do lado esquerdo do prosencéfalo basal de embriões estágio 7/8. Use agulhas curvas de tungstênioafiadas 6 para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo medindo ~0,3 mm de comprimento por 0,2 mm de largura, certificando-se de não incluir a endoderme subjacente deslizando a agulha abaixo do prosencéfalo para que a agulha fique paralela ao eixo do tubo neural.</li>
	<li>Usando a pipeta de transferência de vidro, pegue o enxerto do embrião doador.</li>
	<li>Transfira o enxerto para DMEM contendo Vermelho Neutro (0,01% em PBS, 23 °C) por 2 minutos para corá-lo e, em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha Vermelho Neutro até que esteja pronto para o enxerto.</li>
</ol>2. Preparação do anfitrião
<ol><li>Incubar ovos fertilizados de galinha Leghorn branca (Gallus gallus) a 37 °C em câmara umidificada até HH7/8 17.</li>
	<li>Expor embriões (como mostrado em6).</li>
	<li>Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando suavemente e, em seguida, removendo um pedaço de prosencéfalo basal de 0,3 mm por 0,2 mm do lado esquerdo para acomodar o enxerto, como foi feito para isolar o tecido doador.</li>
	<li>Tome cuidado para evitar a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita. Isso exige prática e nem todas as tentativas serão bem-sucedidas.</li>
	<li>Após transferência para o hospedeiro6, posicionar o enxerto para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro.</li>
	<li>Coloque a fita adesiva firmemente sobre o orifício e devolva o embrião à incubadora a 37 °C durante o período de tempo adequado para análise.</li>
</ol>

<ol><li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li>
<li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal%2C+connective%2C+and+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li>
<li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li>
<li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li>
<li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li>
<li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li>
<li>Tucker, A. S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+provide+species-specific+patterning+information+in+the+developing+branchial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton.</a> Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).</li>
<li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).</li>
<li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477(2012).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li>
<li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li>
</ol>

Todos os autores não têm nada a divulgar.

O método descrito permite examinar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o ectoderma adjacente. Essa abordagem difere dos métodos anteriores de transplante de prosencéfalo, pois o tecido doador era restrito ao prosencéfalo ventral. Isso elimina o transplante das células da crista neural, que comprovadamente participam da padronização da morfologiafacial9,10. Assim, a restrição do enxerto ao prosencéfalo basal foi essencial para avaliar os resultado...

Muitas pesquisas contemporâneas em biologia do desenvolvimento se concentram no papel dos genes na formação de embriões. Existem boas ferramentas para examinar os mecanismos de desenvolvimento de uma perspectiva genética. No entanto, os embriões são montados e sofrem morfogênese em resposta às interações teciduais. O sistema aviário é uma ferramenta clássica usada para avaliar a variedade de interações teciduais que regulam o desenvolvimento pelas seguintes razões: a embriologia é bem compreendida, os embriões são facilmente acessíveis, as ferramentas para análise de sistemas aviários são bem desenvolvidas e os embriões são baratos.
O sistema de transplante aviário tem sido amplamente empregado para rastreamento de linhagens e para avaliar interações teciduais durante o desenvolvimentohá quase um século 1,2,3,4. Esse sistema foi utilizado para investigar um centro de sinalização, a Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula a morfogênese da mandíbulasuperior5, e um vídeo foi publicado descrevendo essa técnicaanteriormente6. Além das codornas-pintinhos, outras espécies também têm sido utilizadas na produção de quimeras para análise de interações teciduais. Por exemplo, o camundongo FEZ foi transplantado de camundongos selvagens tipo7 e mutantes8, e outros utilizaram os sistemas pato, codorna e pintinho para avaliar o papel da crista neural na padronização do esqueleto facial 9,10,11,12.
Neste trabalho, o papel do prosencéfalo na regulação do padrão de expressão gênica no FEZ através do transplante do prosencéfalo ventral reciprocamente entre embriões de codorna, pato e pintinho foi avaliado, pois um sinal do prosencéfalo é necessário para induzir a expressão do ouriço sônico no FEZ. Os transplantes de prosencéfalo não são únicos no campo. Esses transplantes foram utilizados para avaliar o desenvolvimento da motilidade em embriões de codornas epatos13, embora nesses experimentos também tenham sido transplantados tecidos que contribuíram para derivados não neurais. Em outros trabalhos, circuitos auditivos em aves foram avaliados por transplante de prosencéfalo14, mas esses transplantes continham células presuntivas da crista neural, que contribuem para a formafacial9,10 e participam da regulação da expressão de SHH noFEZ15. Assim, um sistema para transplantar apenas o prosencéfalo ventral de uma espécie de ave para outra antes do fechamento do tubo neural foi concebido para avaliar o papel do cérebro na forma facial16 (Figura 1A,B). Este método foi isento de contaminação da crista neural do enxerto. Neste artigo, o método é ilustrado e os resultados esperados são descritos, e os desafios enfrentados são discutidos.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Vermelho Neutro</td><td>Sigma</td><td>553-24-2</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td>, <td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets</td><td>Thermofisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>QCPN anticorpo</td> Estudos <td>de Desenvolvimento Banco de hibridoma, Universidade de Iowa, Iowa, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de</td><td>Ciência Fina</td><td>de Tesoura 14058-11</td><td></td>Ferramentas de</tr><tr><td>Ciência Fina</td> de<td>Agulha de Tungstênio</td><td>26000</td><td></td></tr></tbody></table>

criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

O embrião aviário tem sido usado como um sistema modelo por mais de um século e levou à compreensão fundamental do desenvolvimento de vertebrados. Um dos pontos fortes desse sistema modelo é que o efeito e a interação entre os tecidos podem ser avaliados diretamente em embriões quiméricos. Mostramos anteriormente que sinais do prosencéfalo contribuem para a morfogênese facial regulando a forma do domínio de expressão do ouriço sônico (SHH) na Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ). Neste artigo, o método de gerar quimeras do prosencéfalo e fornecer ilustrações dos resultados desses experimentos é descrito.

Avaliação do quimerismo e contaminação por transplantes Para avaliar as quimeras, a extensão do quimerismo e a contaminação do enxerto com outros tipos celulares devem ser abordadas. A criação de quimeras através do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos permite esse tipo de análise. O uso do anticorpo QCPN células de codorna podem ser visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro (Figura 1 C,D). Neste caso, apenas tecidos der...

Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.

Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Este método permite aos investigadores avaliar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e a face. A principal vantagem dessa técnica é que isola o prosencéfalo basal para avaliação e evita a contaminação com células da crista neural, o que confundiria a análise. A parte difícil desta técnica é a remoção do prosencéfalo do hospedeiro e a substituição pelo tecido doador.Quem demonstrará o procedimento será Diane Hu, pesquisadora do laboratório do Dr. Ralph Marcucio. Para começar, prepare mídia DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e tungstênio afiado. Usando uma seringa de 10 mililitros e uma agulha calibre 18, remova 0,5 mililitros de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo.Faça um pequeno furo em cima da concha usando a ponta da tesoura. Em seguida, coloque um pedaço de fita adesiva sobre o orifício e corte uma abertura circular para expor o embrião. Manchar o embrião com vermelho neutro.Colher enxertos de tecido do lado esquerdo do prosencéfalo basal do estágio sete ou oito embriões. Use agulhas curvas de tungstênio afiadas para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo. Para não incluir a endoderme subjacente, deslize a agulha abaixo do prosencéfalo e paralela ao eixo do tubo neural.Retirar o enxerto do embrião doador usando a pipeta de transferência de vidro e transferi-lo para DMEM contendo vermelho neutro por dois minutos para corá-lo. Em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha vermelho neutro até estar pronto para o enxerto. Incubar ovos fertilizados de frango branco Leghorn a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada até o estágio de Hamburger-Hamilton sete a oito.Expor embriões conforme demonstrado anteriormente. Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando e, em seguida, removendo um pedaço de 0,3 por 0,2 milímetro do prosencéfalo basal para acomodar o enxerto. Evite a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita.Após a transferência do enxerto para o hospedeiro, posicione-o para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro. Coloque a fita bem sobre o orifício e devolva os embriões à incubadora de 37 graus Celsius até que estejam prontos para análise. Inicialmente, as quimeras eram criadas a partir do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos.Usando o anticorpo QCPN, as células de codorna foram visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro. O sistema codorniz-pintinho confirmou que todo o enxerto era composto apenas por tecido neural e não estava contaminado com outros tipos celulares. O transplante de tecido de codorna em embriões de pato levou a quimeras severamente deformadas devido a um cérebro de codorna de desenvolvimento mais rápido.Para tanto, foi realizado o transplante de tecidos de pato em embriões de galinha. As quimeras de pato-pintinho resultantes sugerem que o cérebro participa da regulação da morfologia. Hibridização de montanha inteira C2 foi usada para avaliar a expressão de ouriços Sonic em quimeras.Semelhante à morfologia, a expressão do ouriço Sonic no lado do pato da quimera parecia mais parecida com pato. A preparação do site host exige prática. Um grande número de embriões não sobrevive, então criar um grande número de quimeras pode ajudar a garantir amostras adequadas para análise.Este método permitiu avaliar como os sinais do cérebro moldam o domínio de expressão do ouriço Sonic na zona ectodérmica frontonasal.

creating-avian-forebrain-chimeras-to-assess-facial-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Análise de migração da crista neural e Diferenciação por Cross-espécies de Transplantes

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Aqui, descrevemos protocolos para três tipos de culturas de explantes de pele embrionária aviária que podem ser usados para examinar interações teciduais, filme de lapso de tempo de imagem 4D (3D mais tempo), perturbação global ou local da função molecular e caracterização de biologia de sistemas.

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