Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

Este protocolo é significativo porque usa material do paciente. Se o paciente tem a doença, o uso de suas células deve refletir com mais precisão a resposta biológica do paciente. Esta técnica é simples de executar, simples e não requer equipamentos sofisticados.

Esses métodos podem ser usados para o diagnóstico, por exemplo, para provar que uma mutação RYR1 altera funcionalmente a homeostase do cálcio, bem como para testar a função terapêutica potencial de um composto. Dependendo do conhecimento e habilidades técnicas do pesquisador individual, os experimentos de teste devem ser realizados antes do uso de amostras reais do paciente. Para monitorar as mudanças na concentração intracelular de cálcio de linfócitos B transformados em EBV, resuspenha as células B imortalizadas em uma única vez 10 a sétima células por concentração de mililitro na solução de Krebs Ringer e Fura-2 AM para uma concentração final de cinco micromolar para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.

No final da incubação, colete as células por centrifugação, e resuspense a pelota na solução fresca de Krebs Ringer em duas vezes 10 a sexta células por concentração mililitro. Pouco antes de iniciar o experimento, centrifugar as células novamente, e rapidamente resuspendi as células em 1,5 mililitros da solução de Krebs Ringer suplementada com EGTA 0,5 milimililar, mas sem adição de cálcio. Transfira as células para um copo, cuvette espectrofluorômetro de três mililitros e registe a relação fluorescência em um espectrofluorômetro equipado com um agitador magnético definido em velocidade máxima e 37 graus Celsius por cerca de 30 segundos.

Para avaliar a resposta de liberação de cálcio em células únicas, a placa uma vez 106 Células carregadas fura-2 AM em um mililitro da solução de Krebs Ringer complementada com cloreto de cálcio de um milimil em deslizamentos individuais de tampa de vidro revestido poli-L-lysine, e incubar os deslizamentos de cobertura a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura celular umnicida por 30 minutos. Quando as células se prenderem, coloque um deslizamento de cobertura em uma câmara de perfusão, e comece a perfundar as células a dois mililitros da solução de Krebs Ringer complementadas com uma taxa de fluxo de cálcio de um mililitro por minuto. Usando um microscópio fluorescente invertido equipado com um objetivo de imersão de óleo de 40 vezes e os filtros apropriados, registre medições on-line com um acessório de câmera de dispositivo acoplado por software em intervalos de um segundo, em um tempo de exposição fixo.

Para alcançar a estimulação celular, use um estimulador de perfusão celular com 12 válvulas para adicionar as diferentes concentrações de agonista. Para isolar os miotubes das biópsias musculares humanas, primeiro enxágue a biópsia com PBS estéril para remover qualquer excesso de sangue antes de picar o tecido em pequenos fragmentos de 0,5 a um milímetro. Coloque de dois a três fragmentos em inserções individuais em cada poço de uma placa de cultura tecidual de seis poços contendo 1,5 mililitros de meio de crescimento muscular humano por poço e 500 microliters de médio por inserção, e coloque a placa na incubadora de cultura celular.

Para medir mudanças na expressão de cálcio nos miótubos humanos, quando micótulos multinucleados podem ser observados, substitua os supernacantes da cultura do miotube por meio de diferenciação fresco complementado com 10 microlitrais de fura-2 AM de um mililitro para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, transfira uma cultura de deslizamento de tampa de vidro para a câmara de perfusão, e enxágue as células com a solução de Krebs Ringer suplementada com cloreto de cálcio de dois mililitros. Em seguida, realize medições on-line de cálcio, como demonstrado usando um objetivo de imersão 20 vezes na água.

Nesta análise representativa, observou-se um rápido aumento do cálcio nos linfócitos B imortalizados pelo EBV após a adição de agonista que lentamente diminuiu para níveis de repouso ao longo do tempo. Em um experimento semelhante, a adição de 400-nanomolar thapsigargin causou um grande transitório de cálcio que atingiu um valor de fluorescência pico de 2,4 unidades arbitrárias. Este valor de fluorescência foi considerado 100% quando a curva de resposta da dose correspondente foi construída.

Nesta análise, as células B imortalizadas foram estimuladas com cafeína de cinco milimólares por 20 segundos, resultando em um aumento imediato na razão de fluorescência de 340 e 380 nanômetros. Para cada concentração de cafeína testada, o pico induzido pela cafeína na proporção de 340 por 380 nanômetros de fluorescência foi calculado e usado para construir uma curva de resposta de dose. A liberação de cálcio de miotubes diferenciados também pode ser avaliada em resposta ao rubor com cloreto de potássio, diferentes concentrações de agonista e/ou cafeína, e curvas normais de resposta a dose podem ser geradas.

É importante ter certeza de que as células estão carregadas adequadamente com Fura-2 e que os comprimentos de onda de 340 e 380 nanômetros respondam à adição do agonista. Medições intracelulares de cálcio com indicadores fluorescentes de cálcio podem ser investigadas na maioria das células mamíferas e podem ser aplicadas ao estudo de alterações intracelulares de cálcio em resposta a diferentes estímulos.