Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9
26 de fevereiro de 2021
Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.
A transição endotelial para mesenquimal é um processo celular no qual as células endoteliais mudam sua morfologia de paralelepípedos em um fenótipo semelhante a um fibroblasto. E a citocina TGF-beta, transformando o fator de crescimento beta, é o principal motor dessa transição. A análise das mudanças na morfologia celular e dos níveis de expressão dos marcadores endoteliais e mesenquimais nos permite avaliar a ocorrência de transição endotelial à mesenquimal.
Dados emergentes ligam o processo de transição endotelial ao mesenquimal a várias doenças, incluindo câncer, doenças cardiovasculares e fibrose. E os dados sugerem que a intervenção pode ser de benefício terapêutico. Estimulando o processo de transição endotelial ao mesenquimal, que ocorre durante a embriogênese e o desenvolvimento de órgãos, podemos possivelmente ser capazes de regenerar tecidos derivados de mesenquimais, como cartilagem, osso e músculo.
Para detectar a proteína intracelular por coloração de imunoflourescência, a permeabilização celular utilizando 0,1% Triton X-100 é necessária para permitir que os anticorpos passem pelas membranas celulares. Com esta demonstração de vídeo, os pesquisadores terão uma boa compreensão de como investigar o papel de citocinas como tgf-beta na transição endotelial para mesenquimal. Primeiro, sementes 1 x 10^5 espelhando células endoteliais de ilhotamo MS1 em DMEM complementadas com 10%FBS e 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina em uma placa de cultura revestida de gelatina de 0,1%.
Após a incubação durante a noite na incubadora de cultura celular, lave as células com PBS antes de tratar com dois mililitros de 0,25% de trippsina, solução 0,02% EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius. Quando as células começarem a se desprender, sacie a reação com cinco mililitros de meio de cultura completa e transfira a suspensão celular resultante para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Resuspende a pelota em quatro mililitros de meio completo fresco para contar.
E sementes 1 X 10^3 células por centímetro cúbico em um novo recipiente de cultura celular. Após a cultura da noite para o dia, trate dois poços com cinco micromolar tgf-beta receptor kinase inibidor SB-431542 e dois poços com controle de solvente DMSO. E coloque as células na incubadora de cultura celular por 30 minutos.
No final da incubação, trate dois poços com controle de veículos e dois poços com TGF-beta 2. Após três dias, use um microscópio invertido para examinar a morfologia celular de cada grupo de tratamento celular sob imagens de campo brilhante. Para avaliar as alterações de marcadores relacionadas ao TMT por coloração imunofluorescente, retire as células de uma cultura celular MS1 apropriada, como demonstrado.
E semente as células em uma concentração de 1,9 X 10^3 células em 0,1% gelatina revestido 12 milímetros óculos de cobertura redonda colocados dentro de poços individuais de uma placa de 24 poços. Após a cultura da noite para o dia, trate as células com um mililitro de nanograma de TGF-beta 2 por três dias. Ao final da incubação, lave as células com PBS e fixe as culturas tratadas com 300 microlitrais de 4% de formaldeído por poço por 10 minutos à temperatura ambiente.
No final da fixação, lave as células três vezes com PBS antes de permeabilizar as células com 300 microliters de 0,1%Triton X-100 e PBS por poço por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em PBS e bloqueie as células com 3%de BSA na PBS. Após 45 minutos em temperatura ambiente, rotule as células com anticorpos PECAM-1 e SM22 alfa primários por 45 minutos em temperatura ambiente, seguidas por três lavagens em PBS.
Após a última lavagem, incubar as células com os anticorpos secundários apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente, e lavar as células três vezes com PBS antes de montar as células com um meio de montagem suplementado pelo DAPI e um deslizamento de cobertura. Em seguida, sele as bordas da tampa escorregar com esmalte de unha transparente e imagem a expressão do marcador celular por microscopia confocal fluorescence usando os filtros apropriados de acordo com protocolos de imagem padrão. Após três dias de tratamento com TGF-beta 2, as células Endoteliais MS1 perdem sua estrutura semelhante a paralelepípedos e se diferenciam em células mesenquimais em forma de fuso.
Esta diferenciação induzida pelo TGF-beta 2 é suprimida quando as células são expostas ao inibidor de quinase do receptor TGF-beta SB-431542. A expressão da proteína endotelial PECAM-1 é robustamente diminuída após a estimulação TGF-beta 2, enquanto o fator mesenquimal SM-22 alfa é profundamente regulado. Além disso, o Caracol é marcadamente regulado pela exposição TGF-beta 2, enquanto a expressão de lesma não é afetada.
Como observado, a edição de genes CRISPR-Cas9 pode ser usada para facilitar a introdução de dois RNAs de guia único caracol independente em células MS1 expressas cas9 para interromper a expressão de caracol. O nocaute de Caracol é suficiente para inibir a morfologia celular semelhante ao fibroblasto impulsionada pelo TGF-beta 2 em células MS1 e para bloquear o declínio PECAM-1 mediado tgf-beta 2 e o aprimoramento alfa SM-22. A avaliação das alterações na morfologia celular e na expressão de marcadores endoteliais e mesenquimais por imunofluorescência pode ser validada medindo ainda mais a expressão desses marcadores sobre PCR quantitativo na análise de manchas ocidentais.
Essa técnica de detecção da transição endotelial à mesenquimal permitiu que os pesquisadores investigassem essa significância emergente como um processo fisiológico que ocorre em múltiplas doenças.
Visão Geral
Este estudo investiga a transição endotelial para mesenquimal (EndMT) induzida por TGF-β2 em células endoteliais, com foco nas alterações morfológicas e na expressão de marcadores. O papel do gene Snail é examinado mediante edição gênica com CRISPR/Cas9 para avaliar sua contribuição nesses processos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Transição endotelial para mesenquimal
- Impactos em doenças como câncer e fibrose
- Potencial terapêutico da modulação da EndMT
Antecedentes
- O EndMT envolve a transformação de células endoteliais em um estado semelhante ao mesenquimal.
- O TGF-β2 é uma citocina-chave que induz essa transição.
- Destaca-se a importância do EndMT em diversas doenças e na medicina regenerativa.
Métodos Utilizados
- Coloração por imunofluorescência para avaliar a morfologia celular e a expressão de marcadores
- Modelo de células endoteliais MS1
- Edição gênica com CRISPR/Cas9 para interromper a expressão de Snail
Resultados Principais
- A análise mostra alterações morfológicas em células endoteliais MS1 após o tratamento com TGF-β2.
- A expressão de PECAM-1 diminuiu enquanto a de SM-22 alfa aumentou, indicando a ocorrência de EndMT.
- O knockout de Snail inibe as alterações morfológicas, validando seu papel na EndMT induzida por TGF-β2.
Conclusões
- Este estudo esclarece os mecanismos do EndMT induzido por TGF-β2 e o papel da Snail.
- Os resultados sugerem estratégias terapêuticas potenciais que visam o EndMT em diversas doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a transição endotelial para mesenquimal (EndMT) induzida pelo TGF-β2 fornece uma perspectiva mecanicista sobre vias de doenças relevantes para fibrose, câncer e distúrbios cardiovasculares. A investigação genética de efetores da EndMT utilizando CRISPR/Cas9 permite a validação de alvos e a redução de riscos em hipóteses terapêuticas no estágio inicial de descoberta. Essa abordagem reforça a confiança preditiva na identificação de novos reguladores da plasticidade endotelial para aplicações translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar o papel de fatores de transcrição específicos, como Snail, na conversão fenotípica induzida por TGF-β2.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de moduladores putativos da EndMT por meio de interrupção genética em um modelo endotelial relevante.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos do alvo ao estabelecer relações causais entre a expressão gênica e os fenótipos de transição mesenquimal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Estabelece uma leitura quantitativa baseada em imunofluorescência para EndMT utilizando marcadores endoteliais (PECAM-1) e mesenquimais (SM-22-alfa).
- Valor Operacional: Fornece um formato padronizado e reprodutível de ensaio para monitorar alterações fenotípicas induzidas por TGF-β2 em células MS1.
- Valor de Escalabilidade: Compatível com formatos de triagem genética e farmacológica para identificar novos reguladores de EndMT.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Relaciona a modulação da EndMT com estratégias terapêuticas potenciais em fibrose e câncer, onde a plasticidade endotelial contribui para a patogênese.
- Relevância Pré-clínica: Utiliza um modelo de células endoteliais microvasculares pancreáticas murinas para estudar mecanismos conservados de sinalização do TGF-β2.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Valida a proteína Snail como efetor necessário da EndMT induzida pelo TGF-β2, reforçando a confiança no alvo em estratégias de inibição da via.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, permitindo a redução de riscos mecanicistas antes da triagem de compostos ou da validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre programas transcripcionais induzidos por citocinas em células endoteliais utilizando perturbação genética.
- Triagem: Fornece leituras morfológicas e de biomarcadores quantitativas prontas para ensaios, adequadas para adaptação em triagem de alto conteúdo.
- Análises: Gera dados multiplexados de expressão e localização proteica por imunofluorescência para avaliar a modulação de vias.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações no fenótipo endotelial a processos relevantes para doenças, como fibrose e formação do estroma tumoral.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudar a plasticidade endotelial em diversos contextos de doenças e campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece clareza mecanicista sobre a regulação da EndMT, reduzindo a ambiguidade na seleção de alvos para estratégias anti-fibróticas ou anti-câncer.
- Valor Operacional: Oferece um sistema padronizado e reprodutível para avaliar transições de fenótipo endotelial com controles embutidos (por exemplo, inibição do receptor de TGF-β).
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar ou não ao validar a necessidade do alvo em um contexto celular relevante para a doença antes do investimento.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos que modulam a EndMT com base em evidências de validação genética.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de células endoteliais, edição genética com CRISPR/Cas9 e microscopia de imunofluorescência.
- Depende do acesso à microscopia confocal com fluorescência e protocolos padronizados de imageamento para quantificação de marcadores.
- Necessita otimização da eficiência do RNA guia e validação da eficiência de eliminação em populações clonais.
- Requer padronização da dosagem e do tempo de exposição ao TGF-β2 para garantir indução reprodutível de EndMT entre experimentos.
- Limita-se a modelos in vitro; os achados exigem validação em sistemas fisiologicamente relevantes, como culturas em co-cultivo ou modelos animais de doença.
