Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

A cristalografia síncrotron serial, ou SSX, é uma área relativamente nova e em rápido desenvolvimento do MX.É muito adequada para experimentos de baixa dose e temperatura ambiente, mas talvez o mais importante, é realmente adequado para seguir dinâmicas. Isso permite que filmes de stop-motion de proteínas em ação sejam feitos. No I24, vários modos de SSX estão disponíveis.

Este protocolo se concentra no SSX de alvo fixo, que permite uma ampla gama de experimentos seriais usando quantidades limitadas de amostra. Os chips de silício podem ser danificados ao carregá-los e limpá-los, se você não estiver familiarizado com eles. Além disso, o protocolo de alinhamento do chip é completamente novo para muitos cristalógrafos, e o processamento de dados é ligeiramente diferente dos seus dados de rotação padrão.

Para preparar um suporte de chip, corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em aproximadamente 6 por 6 centímetros quadrados, e coloque os lençóis sobre as duas placas base. Usando anéis de vedação metálica, fixar as folhas no lugar e, em seguida, puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio para remover quaisquer vincos. Em seguida, selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado em relação ao tamanho dos cristais a serem analisados.

Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 milibar, com uma corrente de 15 miliamperes. Use pinças para colocar o chip de silício no estágio de carregamento do chip, com as barras levantadas viradas para baixo. Em seguida, usando uma pipeta, aplique 200 microliters do chorume microcristal na parte plana do chip, espalhando o chorume para cobrir todos os blocos da cidade do chip.

Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster, para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado. Em seguida, aplique um vácuo suave para aspirar todo o excesso de líquido através do chip. Remova o chip da fase de carregamento do chip e limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.

Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas guia, lado plano para baixo. Coloque a pequena metade do suporte do chip sobre o chip para selá-lo. As duas metades do suporte do chip devem encaixar no lugar.

Em seguida, usando parafusos hexax, fixe o chip com segurança no lugar. Para alinhar o chip, segure o suporte do chip em um ângulo de 30 graus enquanto se aproxima da montagem. Em seguida, use as montagens cinemáticas para colocar o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe.

Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao fluxo e clique no lugar. Uma vez colocado o chip, use o sistema de visualização em eixo e a interface gráfica de usuário de alinhamento de chip para localizar o fiducial superior esquerdo do chip. Para centralizar o fiducial 0 em X, Y e Z, mova-se para dentro e para fora do foco para alinhar Z, para cima e para baixo para alinhar Y, e esquerda e direita para alinhar X.Em seguida, clique em Definir Fiducial 0"Depois de alinhar fiducial 1 e 2 com o feixe de raios-X da mesma maneira, clique em Fazer sistema coordenado"para gerar uma matriz coordenada.

Em seguida, clique em Bloquear verificação"para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade. Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Nesta representação gráfica de resultados de localização spot do DIALS pode ser observada uma parcela de taxa de acerto atualizada.

Se um hit for clicado, a imagem de difração correspondente será exibida no visualizador de imagem DIALS. Nesta tabela, as taxas atuais de indexação e integração que se atualizam em tempo real à medida que os dados são coletados durante a visita podem ser visualizadas. A visualização dos parâmetros celulares da unidade pode revelar polimorfos.

Parcelas bidimensionais de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carga ou desidratação. Projeções estereográficas podem revelar a presença ou ausência de orientações preferenciais que podem ser alimentadas de volta ao protocolo de carregamento. Por exemplo, nesta projeção, podem ser observados os efeitos da sobrecarga de um chip com cristais de lisezóz.

Ao carregar o chip, pipeta lentamente e use o dedo para descansar a pipeta acima do chip. Isso evita que você toque no chip e acidentalmente esfaqueia buracos no silício. Ao processar dados, faça uso dos pipelines automatizados disponíveis.

Isso lhe dará uma boa ideia de como seu experimento está progredindo, e se você precisar variar algo. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema proteico que possa ser cristalizado em quantidades significativas. E a reação pode ser desencadeada por raios-X leves ou mistura rápida.

Estudos dinâmicos sobre uma série de estruturas podem fornecer uma visão de como as proteínas funcionam.