Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light
26 de fevereiro de 2021
Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.
A cristalografia síncrotron serial, ou SSX, é uma área relativamente nova e em rápido desenvolvimento do MX.É muito adequada para experimentos de baixa dose e temperatura ambiente, mas talvez o mais importante, é realmente adequado para seguir dinâmicas. Isso permite que filmes de stop-motion de proteínas em ação sejam feitos. No I24, vários modos de SSX estão disponíveis.
Este protocolo se concentra no SSX de alvo fixo, que permite uma ampla gama de experimentos seriais usando quantidades limitadas de amostra. Os chips de silício podem ser danificados ao carregá-los e limpá-los, se você não estiver familiarizado com eles. Além disso, o protocolo de alinhamento do chip é completamente novo para muitos cristalógrafos, e o processamento de dados é ligeiramente diferente dos seus dados de rotação padrão.
Para preparar um suporte de chip, corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em aproximadamente 6 por 6 centímetros quadrados, e coloque os lençóis sobre as duas placas base. Usando anéis de vedação metálica, fixar as folhas no lugar e, em seguida, puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio para remover quaisquer vincos. Em seguida, selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado em relação ao tamanho dos cristais a serem analisados.
Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 milibar, com uma corrente de 15 miliamperes. Use pinças para colocar o chip de silício no estágio de carregamento do chip, com as barras levantadas viradas para baixo. Em seguida, usando uma pipeta, aplique 200 microliters do chorume microcristal na parte plana do chip, espalhando o chorume para cobrir todos os blocos da cidade do chip.
Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster, para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado. Em seguida, aplique um vácuo suave para aspirar todo o excesso de líquido através do chip. Remova o chip da fase de carregamento do chip e limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.
Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas guia, lado plano para baixo. Coloque a pequena metade do suporte do chip sobre o chip para selá-lo. As duas metades do suporte do chip devem encaixar no lugar.
Em seguida, usando parafusos hexax, fixe o chip com segurança no lugar. Para alinhar o chip, segure o suporte do chip em um ângulo de 30 graus enquanto se aproxima da montagem. Em seguida, use as montagens cinemáticas para colocar o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe.
Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao fluxo e clique no lugar. Uma vez colocado o chip, use o sistema de visualização em eixo e a interface gráfica de usuário de alinhamento de chip para localizar o fiducial superior esquerdo do chip. Para centralizar o fiducial 0 em X, Y e Z, mova-se para dentro e para fora do foco para alinhar Z, para cima e para baixo para alinhar Y, e esquerda e direita para alinhar X.Em seguida, clique em Definir Fiducial 0"Depois de alinhar fiducial 1 e 2 com o feixe de raios-X da mesma maneira, clique em Fazer sistema coordenado"para gerar uma matriz coordenada.
Em seguida, clique em Bloquear verificação"para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade. Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Nesta representação gráfica de resultados de localização spot do DIALS pode ser observada uma parcela de taxa de acerto atualizada.
Se um hit for clicado, a imagem de difração correspondente será exibida no visualizador de imagem DIALS. Nesta tabela, as taxas atuais de indexação e integração que se atualizam em tempo real à medida que os dados são coletados durante a visita podem ser visualizadas. A visualização dos parâmetros celulares da unidade pode revelar polimorfos.
Parcelas bidimensionais de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carga ou desidratação. Projeções estereográficas podem revelar a presença ou ausência de orientações preferenciais que podem ser alimentadas de volta ao protocolo de carregamento. Por exemplo, nesta projeção, podem ser observados os efeitos da sobrecarga de um chip com cristais de lisezóz.
Ao carregar o chip, pipeta lentamente e use o dedo para descansar a pipeta acima do chip. Isso evita que você toque no chip e acidentalmente esfaqueia buracos no silício. Ao processar dados, faça uso dos pipelines automatizados disponíveis.
Isso lhe dará uma boa ideia de como seu experimento está progredindo, e se você precisar variar algo. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema proteico que possa ser cristalizado em quantidades significativas. E a reação pode ser desencadeada por raios-X leves ou mistura rápida.
Estudos dinâmicos sobre uma série de estruturas podem fornecer uma visão de como as proteínas funcionam.
Visão Geral
Este artigo fornece um guia abrangente para a preparação de amostras em alvos fixos, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia serial em luz síncrotron na linha de feixe I24 do Diamond. Destaca a metodologia para realização de experimentos com quantidades limitadas de amostra, garantindo ao mesmo tempo a integridade do chip.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Crystalografia
- Dinâmica Proteica
Contexto
- A cristalografia serial em sincrotrão (SSX) é uma área em desenvolvimento na cristalografia de macromoléculas.
- É adequada para experimentos com baixa dose e em temperatura ambiente.
- A SSX permite estudos dinâmicos de proteínas, possibilitando a visualização de suas ações.
- A SSX com alvo fixo pode utilizar efetivamente quantidades limitadas de amostra.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para SSX com alvo fixo na linha de luz I24 do Diamond.
- Garantir a preparação e o alinhamento adequados do chip para coleta de dados ideal.
- Destacar as diferenças no processamento de dados em comparação com dados de rotação padrão.
Métodos Utilizados
- Preparação de pastilhas de silício utilizando folha de poliéster e técnicas de vedação.
- Aplicação de suspensão microcristalina nas pastilhas e aspiração a vácuo.
- Alinhamento das pastilhas usando uma interface gráfica de usuário na linha de feixe.
- Visualização e processamento de dados em tempo real utilizando pipelines automatizados.
Resultados Principais
- O alinhamento bem-sucedido de chips leva à coleta precisa de dados.
- O monitoramento em tempo real das taxas de indexação e integração durante os experimentos.
- A visualização dos parâmetros da célula unitária revela polimorfos e efeitos de carga.
- Estudos dinâmicos fornecem insights sobre a funcionalidade de proteínas.
Conclusões
- O protocolo aumenta a eficiência de experimentos de SSX com alvo fixo.
- O manuseio e alinhamento adequados do chip são fundamentais para a coleta bem-sucedida de dados.
- Estudos dinâmicos utilizando SSX podem avançar significativamente nosso entendimento do comportamento proteico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A cristalografia serial por sincrotrão com alvo fixo permite que os pesquisadores em biologia estrutural realizem estudos dinâmicos de proteínas utilizando quantidades limitadas de amostra, apoiando a validação de alvos por meio de informações estruturais de alta resolução. Este método reduz o consumo de amostra mantendo a qualidade dos dados, o que é crítico na fase inicial de descoberta, onde a expressão e purificação de proteínas representam gargalos. Ao viabilizar experimentos em temperatura ambiente e com resolução temporal, ele aprimora a compreensão mecanicista da função proteica, contribuindo para a otimização de compostos iniciais e para a redução de riscos no desenvolvimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao capturar conformações proteicas em ação, apoiando a validação funcional de alvos.
- Valor Operacional: Reduz a dependência de grandes volumes de cristal, permitindo a triagem de alvos desafiadores com baixos rendimentos de expressão.
- Confiabilidade Preditiva: Fornece dados estruturais que orientam a caracterização do sítio de ligação e o mecanismo de ação, melhorando as decisões de seleção de alvos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera mapas quantitativos de densidade eletrônica a partir de microcristais, permitindo avaliações precisas da ligação de ligantes.
- Valor Operacional: Padroniza a montagem e o alinhamento de amostras por meio de sistemas baseados em chips, melhorando a reprodutibilidade entre campanhas de triagem.
- Prontidão do Ensaio: Produz métricas em tempo real de taxa de acertos e indexação que apoiam decisões de continuidade ou interrupção durante triagens de fragmentos ou compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Revela formas polimórficas e mudanças conformacionais que podem impactar a ligação do fármaco ou a estabilidade, orientando estratégias de formulação.
- Valor Operacional: Obtém dados estruturais resolvidos no tempo que podem ser correlacionados com ensaios funcionais, fortalecendo o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Mitigação de Riscos: Identifica precocemente artefatos induzidos pelo carregamento ou efeitos de desidratação, reduzindo o risco de interpretação equivocada na otimização subsequente.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O SSX com alvo fixo integra-se ao fluxo de trabalho de descoberta após a identificação do alvo e o desenvolvimento do ensaio, fornecendo informações estruturais que orientam a identificação de compostos iniciais e a validação pré-clínica. Ele apoia ciclos iterativos de projetar-fabricar-testar-analisar ao fornecer retorno estrutural rápido sobre a ligação do composto e a dinâmica proteica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização de mudanças conformacionais induzidas por ligantes e da dinâmica proteica relacionadas ao mecanismo de ação.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio da padronização na preparação e alinhamento de chips, garantindo qualidade consistente dos dados em triagens de compostos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos, incluindo parâmetros de célula unitária, taxas de acerto e métricas de integração, que permitem a comparação objetiva de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações estruturais a resultados funcionais ao revelar dinâmicas que podem influenciar a biodisponibilidade ou o engajamento com o alvo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem estrutural em múltiplos alvos, reduzindo esforços de revalidação em ambientes com múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer dados estruturais com alta resolução e resolução temporal em condições próximas às fisiológicas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio de procedimentos padronizados de manipulação e alinhamento de chips, além de pipelines automatizados de processamento de dados.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao minimizar o consumo de amostras e permitir iterações rápidas em campanhas de otimização estrutural.
- Impacto sobre o Portfólio: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações entre alvo e ligante.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cristalografia de macromoléculas e familiaridade com técnicas de manipulação de amostras baseadas em sincrotrons.
- Depende do acesso à infraestrutura de linha de feixe com montagem cinemática, visualização em eixo e pipelines automatizados de coleta de dados, como o DIALS.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de preparação do chip, aspiração a vácuo e alinhamento para garantir consistência dos dados.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tamanhos de cristal e grupos espaciais, exigindo ajuste na seleção de aberturas e nas técnicas de espalhamento.
- Inclui limitações práticas, como a fragilidade do chip durante o carregamento e a limpeza, e sensibilidade aos efeitos de desidratação que podem alterar a qualidade do cristal ao longo do tempo.
