Name: Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Aprenda cristalografia serial de sincrotrão com alvo fixo na linha I24 do Diamond Light. Este protocolo detalha preparação de chips de silício, alinhamento preciso e processamento de dados em tempo real para estudos dinâmicos de proteínas.

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Este trabalho foi apoiado pelo programa iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia.

1. Preparar e carregar um chip
NOTA: O processo ocorre dentro de um ambiente controlado pela umidade (Figura 1),tipicamente entre 80% e 90% ou umidade relativa mais alta, para evitar que cristais proteicos sequem. Uma vez carregados e selados, os cristais podem sobreviver por mais de 24 horas. No entanto, isso pode variar muito entre sistemas de cristal. Dentro da câmara é necessária uma bomba de vácuo de baixa potência presa a um estágio de carga para segurar um chip desilício (Figura 1),um chip de silício, um suporte de chip com papel alumínio(Figura 2),uma pipeta p200, 200 pontas de pipeta de μL, pinças, papel filtro e o chorume de cristal proteico.
<ol><li>Prepare um suporte de chip.<ol>
<li>Corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em quadrados de aproximadamente 6 cm x 6 cm.</li>
		<li>Coloque as folhas de poliéster sobre as duas placas base (grandes e pequenas).</li>
		<li>Fixar as folhas de poliéster no lugar usando os anéis de vedação de metal.</li>
		<li>Puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio de poliéster para remover quaisquer vincos para facilitar a visualização e o centro das amostras mais tarde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado (7-30 μm) em relação ao tamanho dos cristais.</li>
	<li>Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 mBar e usando uma corrente de 15 mA para permitir a fácil disseminação de micro cristais no chip.</li>
	<li>Coloque o chip de silicone no estágio de carregamento do chip usando pinças com as barras levantadas viradas para baixo.</li>
	<li>Aplique 200 μL do chorume microcrista no lado plano do chip usando uma pipeta.</li>
	<li>Espalhe o chorume de cristal para cobrir todos os "blocos da cidade" do chip.</li>
	<li>Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster ou ponta de pipeta de filtro para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado.</li>
	<li>Aplique um vácuo suave até que todo o excesso de líquido tenha sido sugado através do chip.</li>
	<li>Remova o chip do estágio de carregamento do chip com pinças.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.</li>
	<li>Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas do guia lado plano para baixo.</li>
	<li>Sele o chip colocando a pequena metade do suporte do chip por cima.<ol>
<li>As duas metades do suporte do chip entrarão no lugar. Se a segunda metade não estiver alinhada, gire o suporte 180° para alinhar corretamente os ímãs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enrosque o suporte do chip fechado com parafusos hexais para fixar o chip com segurança no lugar. NOTA: Alternativamente, um chip "sem chip" pode ser carregado de forma semelhante, com um volume menor de chorume de cristal (~15 μL) sanduíche entre as duas camadas de papel alumínio de poliéster no suporte do chip 37, ou um volume menor pode ser carregado usando um espaçador de tdah de 50 μm de espessura dupla lateral aplicado diretamente ao papel alumínio de poliéster como descrito anteriormente 38 . O uso de espaçadores adesivos também permite que várias amostras (ou variantes de amostras como molhos de ligantes) sejam carregadas em cada chip sem chip. Uma abordagem complementar de carregamento que explora a ejeção de gota acústica (ADE) para carregar chips de silício também pode ser usada no Diamond39. O ADE permite que os chips sejam carregados usando volumes menores de chorume de cristal do que o carregamento de pipetas. É uma técnica particularmente útil quando as amostras são escassas, embora a composição química e a viscosidade do chorume devem ser levadas em consideração.</li>
</ol>2. GUI e configuração na linha de feixe
<ol><li>Execute todo o alinhamento e configuração do chip para coleta de dados através de uma interface de usuário gráfica (edm) (edm)(Figura 3a) (Figura 3a). Isso fornece uma interface de ponto e clique para instrumentação de feixe e fornece parâmetros de entrada para coleta de dados baseada em Python. Sub janelas fornecem controle adicional para coleta de sub-regiões de um suporte de amostra(Figura 3b) ou experimentos de sonda de bomba laser/LED(Figura 3c).</li>
</ol>3. Alinhando o chip
<ol><li>Coloque o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe (mostrado na Figura 4a) usando as montagens cinemáticas.<ol>
<li>Tome cuidado para evitar puxar os estágios ao longo de sua direção de viagem. Os ímãs nas montagens cinemáticas são bastante fortes, então isso pode ser feito facilmente por acidente.</li>
		<li>Ao se aproximar da montagem, o suporte do chip deve ser mantido em um ângulo leve (±30°). Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao piso (0°) e o suporte do chip clicará no lugar(Figura 4b).</li>
		<li>Ao descarregar um chip siga um caminho inverso. Gire e gire o chip para longe das etapas antes de puxar o suporte do chip para longe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando o sistema de visualização on-axis da linha de feixe e a GUI de alinhamento do chip, localize o fiducial superior esquerdo do chip. Os fiduciais são três quadrados, dois pequenos e um grande, em ângulos retos um ao outro(Figura 5a). O chip está iluminado de volta para que o chip pareça escuro com aberturas como quadrados brancos.</li>
	<li>Centro em fiducial zero em X, Y e Z(Figura 5b). Alinhe X e Y movendo-se para a esquerda/direita e para cima/para baixo, respectivamente. Alinhe Z movendo o chip para dentro e para fora do foco.</li>
	<li>Clique em Definir Zero Fiducial.</li>
	<li>Repita o passo 3.2 para um fiducial (superior direito, Figura 5c) e fiducial dois (inferior esquerdo, Figura 5d) para alinhar todas as fiduciais com o feixe de raios-X.</li>
	<li>Gere uma matriz coordenada pressionando o sistema de coordenaçãode make , isso calcula o deslocamento, o tom, o rolo e a guinada do chip em relação aos estágios permitindo que todos os movimentos subsequentes sejam feitos no quadro coordenado pelo chip.</li>
	<li>Clique em Bloquear Verificar para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade para confirmação visual de que o chip está bem alinhado.</li>
	<li>Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Se não, repita os passos 3.2-3.3. NOTAs: Em caso de dificuldade de alinhamento (fiduciais quebrados), diferentes aberturas no chip podem ser usadas para alinhamento usando o menu de recuo "tipo de alinhamento". Muitos tipos diferentes de chip estão disponíveis para coleta de dados de destino fixo. Diferentes tipos de chip são acomodados através do uso do menu pull-down 'tipo chip'. Os tipos de chip mais comuns usados no I24 são chips 'Oxford' e 'personalizados'. O número e o espaçamento de aberturas e fiduciais no chip são lidos a partir de um dicionário de chip definido através do menu pull-down. O chip personalizado permite que o espaçamento de abertura seja definido em tempo real, o que é particularmente útil para folhas de filme fino na folha ou outros chips do tipo 'sem chip' onde os cristais estão localizados aleatoriamente em todo o suporte37. Uma nova GUI Python, que oferece funcionalidade move-on-click e alinhamento automatizado de chips está atualmente em desenvolvimento, mas ainda não está pronta para uso rotineiro no momento da escrita deste manuscrito.</li>
</ol>4. Configuração da coleta de dados
NOTA: A configuração da coleta de dados dependerá do sistema que está sendo estudado e do experimento a ser realizado. Isso pode variar desde o experimento SSX mais simples, coletando uma estrutura de baixa dose, até um experimento resolvido com o tempo usando lasers ou mistura rápida para iniciar uma reação que exigirá múltiplos conjuntos de dados completos em diferentes atrasos de tempo. Para configurar uma coleta de dados, os seguintes parâmetros precisam ser definidos.
<ol><li>Variáveis experimentais: Preencha a pasta, nome do arquivo, tempo de exposição, transmissão, distância do detector e número de tiros por abertura, conforme apropriado.</li>
	<li>Tipo de chip: Como descrito acima, combine o tipo de chip com o chip em uso.<ol>
<li>Se um filme fino ou chip 'chipless' estiver sendo usado, então defina o tipo de chip para None.</li>
		<li>Defina o número de etapas e o tamanho da etapa tanto em x quanto no y na GUI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina o tipo de mapa: isso permite que subseções de um chip sejam selecionadas para coleta de dados (Figura 3b). 'Nenhum' significa que os dados são coletados de cada abertura em um chip. 'Lite' significa que os dados são coletados de blocos selecionados da cidade no chip(Figura 3b). Isso pode ser útil se, por exemplo, uma região de um chip for conhecida por estar mal carregada ou vazia. 'Full' permite que aberturas individuais sejam selecionadas para coleta de dados. Neste caso, um arquivo de texto corretamente formatado deve ser fornecido. Detalhes e um modelo podem ser obtidos da equipe da linha de trave.</li>
	<li>Teste de bomba: Selecione o tipo de experimento da sonda da bomba e o atraso de tempo desejado. O acionamento da bomba (geralmente um LED ou laser) é muitas vezes específico para um experimento específico, por isso não será descrito em detalhes aqui.<ol>
<li>Atrasos 'curtos' referem-se a experimentos quando há um habitante em cada abertura entre a bomba e a sonda (ou seja, bomba, sonda, 'mover-se para a próxima amostra.) Os atrasos são tipicamente na ordem de 1 segundo ou dezenas de milissegundos.</li>
		<li>Atrasos longos referem-se a uma estratégia de excitação e visitação novamente (EAVA), onde aberturas são visitadas duas vezes, com um tempo definido entre as visitas (ou seja, bomba, movimento, bomba, movimento, sonda, movimento, sonda, etc.). O atraso de tempo é calculado e os tempos de exposição de raios-X(Figura 3c)e é tipicamente ~1 segundo ou mais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Métodos comuns de coleta de dados
NOTA: Os seguintes são os parâmetros-chave que definem o tipo de experimento que está sendo realizado. Esta seção pressupõe que as outras configurações do protocolo 3 "Configuração da Coleta de Dados" foram definidas.
<ol><li>
Cenário 1: Coleta de dados de baixa dose. Coleta de uma única imagem de difração de cada abertura selecionada no suporte da amostra.<ol>
<li>Defina o número de tiros por abertura para 1.</li>
		<li>Defina a sonda da bomba para Nenhum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cenário 2: Uma série de doses, coletando n imagens sequencialmente de cada abertura selecionada no suporte da amostra. O chip está parado em cada abertura enquanto cada conjunto de imagens n é coletado.<ol>
<li>Defina o número de tiros por abertura para'n'. Observe que o processamento é simplificado se n=5, 10, 20 ou outro múltiplo de 10. É difícil estabelecer tendências se n < 5. É útil considerar o tempo total necessário para cobrir um chip e o número de arquivos de imagem produzidos quando n é aumentado.</li>
		<li>Defina a sonda da bomba para Nenhum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cenário 3: Métodos de sonda de bomba<ol>
<li>Selecione um método no menu pull-down da sonda de bomba para abrir o Centro de Controle de Excitação a Laser.</li>
		<li>Para um experimento de sonda de bomba, preencha o Laser Dwell em cada opção de abertura.</li>
		<li>Para EAVA preencha o Laser Dwell em cada abertura e exposição de raios-X e clique em Calcular.</li>
		<li>Selecione a opção Repetir apropriada no menu suspenso da bomba gui edm para o tempo de atraso desejado.</li>
		<li>Se o experimento exigir um passo de pré-iluminação, preencha a seção Laser 2 Dwell. </li>
		<li>Depois de todas as variáveis experimentais são definidos parâmetros de conjunto de prensa e criar lista curta. Isso carrega variáveis experimentais no controlador de geobrick. Depois que isso for feito pressionando o Start moverá o detector para dentro, a luz de fundo para fora e iniciará a coleta de dados. Em todos os pontos na configuração da coleta de dados é útil ter uma janela terminal aberta onde o feedback sobre o status e o resultado de cada uma das etapas é impresso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Processamento de dados
NOTA: O processamento de dados em linhas gerais pode ser dividido em três grupos com base na urgência com que o feedback é necessário. Feedback rápido é necessário para mostrar se os cristais estão presentes e difratos, e se sim, em que números. Isso deve acompanhar a coleta de dados. A realização de indexação e integração de dados que podem ser mais lentas, mas ainda devem ser realizadas em escalas de tempo comparáveis com a coleta de dados. A fusão e o dimensionamento das intensidades de reflexão em um arquivo mtz para solução estrutural e a geração de mapas de densidade de elétrons representa o passo final e pode ser mais lento ainda. Aqui os pipelines de partida no I24 para as duas primeiras etapas serão discutidos apenas, pois eles são necessários para feedback em tempo real para orientar seu experimento, embora note que métricas como taxas de acerto e estatísticas de escala não são um substituto para inspecionar a densidade de elétrons, o que pode fornecer a única confirmação de que um ligante se vinculou, ou uma reação ocorreu, em crystallo.
<ol><li>Feedback rápido<ol>
<li>Para carregar os módulos de processamento de dados digite a carga i24-ssx no terminal em qualquer estação de trabalho de linha de vigas.</li>
		<li>Para executar o tipo de análise de achado de hits i24-ssx /path/to/visit/directory/ no terminal: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ NOTA: Isso abre três janelas de terminal e, uma vez que os dados foram gravados em disco, uma representação gráfica de localização resultante da Integração difração para Fontes avançadas de luz (DIALS) 40,41(Figura 6a).<ol>
<li>As configurações padrão marcam a cada 10imagens e atualizam a cada poucos segundos para minimizar a carga computacional.</li>
			<li>Altere o padrão adicionando um argumento ao final do comando acima. Por exemplo, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx seria executado em qualquer outra imagem. No entanto, isso pode colocar pressão indevida no cluster (um recurso compartilhado!) e diminuir os tempos de processamento. O gráfico é codificado por cores com base na probabilidade de indexação bem sucedida, o vermelho mostra que pelo menos 15 pontos de Bragg foram encontrados (boa chance de indexação), azul mostra pouca ou nenhuma difração útil.</li>
			<li>Exibir imagens de difração de interesse no visualizador de imagens DIALS clicando nos pontos na interface spot finder.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Feedback de indexação e integração NOTA: A indexação e integração dos dados de difração são realizadas com os DIALS utilizando a função dials.still_process 40,41. Como tal, informações específicas relacionadas ao seu cristal (grupo espacial de cristal esperado, célula unitária e uma geometria de experimento) devem ser colocadas em um arquivo de texto .phil.<ol>
<li>Carregue os módulos DIALS digitando os mostradores de carga do módulo em um terminal.</li>
		<li>Para começar a processar um tipo de conjunto de dados dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. O progresso de todos os conjuntos de dados ainda em processamento pode ser monitorado executando o script stills_monitor digitando monitor_stills_process.py (após a execução do módulo de carga i24-ssx e mudando o diretório para a visita atual) ( Figura6b).</li>
		<li>A distribuição celular unitária de dados de difração indexada(Figura 7a) pode ser monitorada usando o comando ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refinado.expt.expt combine_all_input=true Isso é particularmente útil para identificar e resolver polimorfos de células unitárias como discutido anteriormente 42.</li>
		<li>'Visualzie' se, e como, essa distribuição varia entre um alvo fixo produzindo um plot 2D(Figura 7b) usando o comando python pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>Produzir projeções estereográficas de todos os dados de difração indexados(Figura 7c) utilizando o comando DIALS dials.stereographic_projection hkl= 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt. NOTA: É uma patologia comum ao processar dados de alambirecidos de cristais onde a simetria da rede Bravais é maior do que a simetria do grupo espacial que os dados mesclados aparecem como um gêmeo perfeito. Algoritmos de processamento de dados evoluíram para resolver essa patologia 43,44,45,46, mas os usuários devem estar atentos a isso durante o processamento de seus dados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

A coleta de dados síncrotrons em série é uma técnica relativamente nova nas linhas de luz MX, fazendo a ponte entre as coletas de dados ultrarrápidas atualmente sendo realizadas em XFELs e MX tradicional baseada em síncrotron. Este manuscrito tem como objetivo dar uma visão geral de como coletar com sucesso dados de série de destino fixos na linha de luz I24, Diamond Light Source para baixa dose, série de doses e experimentos resolvidos pelo tempo. Assim como na cristalografia padrão, a preparação da amostra é um grande pescoço de garrafa na solução de estrutura. O SSX não é diferente, e a preparação de um chorume de cristal homogêneo em quantidades suficientes ainda não se beneficiou de várias décadas de estudo e refinamento, como o crescimento de cristais de proteínas grandes. No entanto, a preparação desses chorumes está fora do escopo deste artigo e foi resumida em outros lugares36. O passo crítico na abordagem descrita aqui envolve o uso cuidadoso da amostra disponível usando interfaces de GUI fáceis de usar (etapa 3) e pipelines automatizados de processamento de dados (etapa 6) para informar o carregamento do chip (etapa 1) e como um experimento deve proceder.
O pipeline de feedback rápido é uma ferramenta poderosa que permite que os usuários avaliem as taxas iniciais de sucesso durante a coleta de dados para informar protocolos subsequentes de carregamento de chips para coleta bem-sucedida de dados. Quando confrontados com uma baixa taxa de acerto (<5%), os usuários correm o risco de coletar dados incompletos e/ou desperdiçar tempo de vigas com coletas adicionais. Neste caso, a amostra pode ser agrupada, concentrada por centrifugação suave, e/ou volumes maiores poderiam ser carregados na etapa 1.5. Uma taxa de acerto mais alta é geralmente favorável, no entanto, há um ponto de retorno reduzido onde a sobrecarga leva a múltiplos cristais no mesmo poço. O DIALS é capaz de lidar com dados de difração multi-rede50,mas uma preocupação maior do que indexação e integração é o efeito prejudicial que o agrupamento de cristais pode ter na ativação uniforme de cristais por luz laser ou mistura rápida para experimentos precisos resolvidos por tempo. Deve-se, portanto, tomar cuidado especial para evitar a sobrecarga de alvos fixos para experimentos resolvidos com o tempo.
A etapa de processamento de indexação e integração produz um enredo com a cruz central representando a direção do feixe, cada ponto representando a direção do reflexo hkl 001 de lattices individuais, e o anel externo do círculo representando uma rotação de 90° de distância do eixo do feixe. Isso mostrará se seus cristais têm uma orientação preferida, o que pode impactar a completude dos dados e indicar a necessidade de coletar mais dados ou variar o protocolo de carregamento. No painel à esquerda da Figura 7c,é mostrado o efeito da sobrecarga de um chip com cristais HEWL. À medida que as aberturas se enchem de mais cristais, elas grudam nas paredes angulares das aberturas em vez de se casarem na base em uma orientação aleatória. As duas elipses ortogonais são resultado de cristais deitados nas paredes internas do chip que estão a ~35° na direção do feixe. Isso reduz o volume de cristais carregados, reduz a taxa de acerto e reduz drasticamente a fração de cristais deitados nesses planos preferidos.
Deve-se notar que outras abordagens seriais estão disponíveis no I24, como extrusoras LCP e chips microfluídicos. Estes usam GUIs semelhantes e os mesmos pipelines de processamento, tanto que muitos dos acima permanecerão aplicáveis mesmo que uma técnica diferente seja usada. Existem várias abordagens seriais tanto para SSX quanto para SFX além da abordagem de destino fixo descrita aqui, cada uma tem certas vantagens sobre a outra, dependendo do experimento a ser realizado e da linha de feixe usada para o experimento. À medida que as abordagens serial estão evoluindo rapidamente, é aconselhável verificar as páginas da web de linha de feixe (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) para atualizações recentes e conversar com a equipe de linha de trave o mais cedo possível ao planejar o tempo de feixe. O acesso ao I24 para experimentos padrão e serial é gratuito no ponto de uso. Para usuários do Reino Unido e da UE, os custos de viagem e acomodação são parcialmente cobertos pelo iNEXT Discovery.

A cristalografia síncrotron serial (SSX) é um método emergente de coleta de dados que foi inspirado por lasers de elétrons livres de raios-X (XFEL)1,2,3. Em um XFEL, um único padrão de difração é registrado a partir de um cristal de proteína geralmente muito pequeno, antes que o cristal seja destruído pelo pulso de raio-X extremamente brilhante. Isso significa, normalmente, que um novo cristal deve ser introduzido no feixe de raios-X para obter outro padrão de difração4. Essa necessidade de repor continuamente cristais tem impulsionado o desenvolvimento de muitas técnicas de entrega de amostras em série5.
Em síncrotrons, métodos clássicos de cristalografia de rotação (não-serial) são amplamente aplicados, explorando um único cristal grande que é girado em um feixe de raios-X usando um goniômetro para coletar um conjunto de dados completo para a solução de estrutura6. A fim de aumentar a vida útil dos cristais para que um conjunto de dados completo possa ser coletado7,8, e também para facilitar o envio e transferência automatizada de amostras, os cristais são criocoolados para ~100 K para coleta de dados. Em linhas de feixes de microfoco intensos, estratégias multi-cristais são frequentemente empregadas, pois danos causados por radiação podem proibir a coleta de um conjunto de dados completo a partir de um único cristal9,10,11. Apesar dos limites impostos pelos danos causados pela radiação, o número de cristais usados permanece relativamente modesto e a abordagem utilizada é essencialmente idêntica ao único experimento de cristal.
O SSX, por outro lado, usa a entrega de amostras seriais para obter padrões únicos de difração ainda de milhares de cristais orientados aleatoriamente para gerar um conjunto de dados completo. Nota-se que as técnicas seriais que incorporam a rotação de cristais estão em desenvolvimento12,13 embora nos concentremos em abordagens ainda, zero de rotação. Existem uma grande variedade de sistemas de entrega de amostras com diferentes vantagens e desvantagens14, que vão desde a entrega de um fluxo de cristais em um jato focado/viscoso de fluxo15,16,17, chip microfluido18,19, ou cristais em um alvo fixo, como um chip de silício gravado20,21 . Normalmente, os cristais são mantidos à temperatura ambiente, permitindo maior diversidade conformacional e proporcionando um ambiente mais fisiologicamente relevante22. O SSX permite a coleta de conjuntos de dados de dose muito baixa23,já que a dose total do conjunto de dados equivale a uma única exposição de raios-X curtos de um cristal. Outra grande vantagem que o SSX proporciona é o estudo da dinâmica proteica através de métodos resolvidos pelo tempo, com reações desencadeadas pela exposição à luz laser24,25,26,27ou pela mistura de cristais e ligante/substrato28,29. O uso de cristais menores significa que a luz laser pode penetrar a totalidade do cristal, iniciando uniformemente a reação sem absorção multifotilha para fornecer intermediários de reação bem definidos para dados de difração tomados em diferentes pontos de tempo27. O uso de cristais maiores e métodos de coleta de dados baseados em rotação sofre de uma profundidade limitada de penetração a laser, ativação não uniforme ou multifotona, dano de radiação e tempo de sobrecarga mecânica dentro de varreduras de dados, resultando em uma mistura de intermediários de reação que podem ser difíceis ou impossíveis de interpretar a velocidades de reação mais rápidas. Cristais menores fornecem uma vantagem semelhante na mistura de experimentos, pois os ligantes podem se difundir rapidamente e de forma mais uniforme em todo o cristal, permitindo novamente que intermediários de reação definidos sejam registrados em diferentes atrasos de tempo30,31,32.
No microfoco de Diamond, o I24, tanto a rotação convencional quanto os experimentos SSX, podem ser realizados. Aqui são apresentados um protocolo abrangente para preparação de amostras SSX e coleta de dados usando alvos fixos no I24 e protocolos para análise de dados de dados seriais na Diamond. Embora o manuscrito e os vídeos que acompanham devem permitir que os usuários realizem um experimento SSX bem sucedido no I24, deve-se notar que este é um campo em rápido desenvolvimento e as abordagens estão em constante evolução. Deve-se notar também que os métodos seriais estão disponíveis em outras fontes síncrotrons, incluindo, mas não se limitando a Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33,SLS (PXI e PXII)34e NSLS (FMX)35. Embora as especificidades da coleta e processamento de dados em série diferam entre as fontes, os princípios fundamentais permanecerão os mesmos. Os protocolos abaixo devem ser vistos para representar um ponto de partida e um caminho para o acampamento base, em vez do cume do que poderia ser alcançado.
Este protocolo pressupõe que os usuários tenham um sistema de cristal de proteínas ou pequenas moléculas, a partir do qual foi produzido um chorume microcristasta na ordem de 0,5-2,0 mL com uma boa densidade de microcristais por mL. Protocolos para obtenção de pastas de cristais foram descritos anteriormente 36. Muitos tipos diferentes de alvo fixo estão disponíveis, os mais usados no I24 utilizam um chip de silício precisamente definido. A fim de diferenciar-se de outros layouts de chip, abaixo e na interface de linha de feixe, este é chamado de "chip Oxford". Como descrito anteriormente, o layout do chip oxford compreende 8×8 'blocos da cidade', cada um contendo 20×20 aberturas para um total de 25.600 aberturas20,21.

<table><tbody><tr><td>Porta-chips</td><td>personalizados</td><td>N/A</td><td>Porta-chips metálicos personalizados internos que consistem em 2 placas de base magnéticas, 2 anéis de metal e uma montagem cinemática.</td></tr><tr><td>Espaçadores de cavacos sem cavacos</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td><td>Folhas adesivas LCP disponíveis como parte da linha modular LCP</td></tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; controlador/amplificador multi-eixo com uma configuração de hardware de fonte de luz de diamante personalizada</td></tr><tr><td>Montagens cinemáticas</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Bases quadradas com 3 ímãs dispostos em um triângulo afixados aos porta-chips.</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo KNF Laboport</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>Bomba de vácuo de PTFE sólido, velocidade de bombeamento de 10 l/min.</td></tr><tr><td>Folhas de Mylar 6 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>15360562</td><td>rolo de 300 pés de 6 &micro; m de espessura de filme de mylar XRF da SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>rolo de 300 pés de 3 &micro; m de espessura mylar XRF filme por SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge System</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Um sistema compacto de descarga de brilho autônomo usado para produzir superfícies hidrofílicas</td></tr><tr><td>Chips de silício</td><td>Universidade de Southampton</td><td>N/A</td><td>Chips de silício gravados personalizados com 25.6000 aberturas disponíveis em uma variedade de tamanhos.</td></tr><tr><td>Estágios de tradução</td> Os estágios de amostra <td>Smaract</td><td>N/A</td><td>XYZ são um projeto colaborativo da Diamond Light Source e SmarAct, construído sob medida pela SmarAct usando três estágios de deslocamento de translação linear de 50 mm, guias de rolos cruzados precisos e um sensor integrado com resolução de até 1 nm</td></tr><tr><td>1byOne Humidifier (701UK-0003 )</td><td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Umidificador ultrassônico de 1,3 litros disponível comercialmente</td></tr></tbody></table>

coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte diamond light

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

A coleta de dados em série é uma técnica relativamente nova para usuários síncrotrons. Um manual de usuário para coleta de dados de destino fixo em I24, Diamond Light Source é apresentado com instruções detalhadas passo a passo, números e vídeos para coleta suave de dados.

Coleta e Série de Dados de Baixa Dose Dados de baixa dose (Passo 5.1: Cenário 1) e série de doses (Passo 5.2: Cenário 2) foram coletados em micro cristais de nitrito de cobre em I24 e foram publicados anteriormente 42. Todas as amostras foram preparadas conforme descrito na etapa 1, dados coletados conforme as etapas 3, 4 e 5, e processadas utilizando métodos na etapa 6. Neste trabalho foi coletada uma série de doses rápidas com 20 imagens de difração tiradas em cada abertura (ou seja, n=20 na gui de coleta de dados mostrada acima) antes de passar para uma nova amostra. A partir desses dados foi identificada uma distribuição bimodal de células unitárias no grupo espacial P213(a = b = c = 97,25 Å, e a = b = c = 96,38 Å). A identificação e separação desses polimorfos unitários para processamento mostrou uma melhora acentuada nos indicadores de qualidade dos dados e revelou duas estruturas diferentes em um laço flexível entre os resíduos 189-193 em vez do estado misto observado ao processar todos os dados juntos. A identificação desses polimorfos poderia fazer toda a diferença em um estudo estrutural delicado resolvido pelo tempo, onde apenas pequenas mudanças estruturais são esperadas. Além disso, a série de doses coletadas revelou uma dose dependente da mudança celular da unidade no cristal, com aumento da dose deslocando a população em favor da célula unitária maior.
Trabalho semelhante foi realizado por Ebrahim et al (2019)47, onde uma série de dose (Passo 5.2: Cenário 2) foi coletada a partir de uma heme peroxidase tipo corante de Streptomyces lividans (DtpAa) para comparar estruturas de baixa dose do SSX (Passo 5.1: Cenário 1) com as medidas no mesmo sistema de alvo fixo utilizando SFX. Os dados SFX foram coletados no SACLA Beamline BL2 EH3 com um comprimento de pulso de 10 femtosegundos e uma taxa de repetição de 30 Hz. A duração do pulso de 10 femtosegundos garante que os efeitos dependentes da dose não estejam presentes nos dados do SFX. Os dados do SFX foram comparados aos dados SSX coletados na linha de feixe I24, onde 10 exposições sequenciais de 10 milissegundos foram medidas em cada posição amostral (ou seja, n=10). Observou-se a migração dependente de dose de uma molécula de água coordenada por ferro heme para longe do ferro, bem como uma alteração conformacional em um dos grupos de propionato de heme na série de dose SSX. Embora não seja livre de danos como a estrutura SFX, a série de doses permitiu que o comprimento de ligação Fe-O de um conjunto de dados de dose zero (heme férrico) fosse extrapolado, com este concordando dentro de erro experimental com o valor obtido do SFX.
Os métodos de coleta de dados de cristalografia serial descritos aqui também podem ser facilmente adaptados para fornecer novos ambientes amostrais para, por exemplo, estudar estruturas de proteínas anaeróbicas à temperatura ambiente. Conforme descrito em Rabe et al 2020 48, carregar uma amostra "folha na folha", ou "chip sem chip", com diferentes filmes de vedação em uma câmara aneróbica permite a coleta de dados estruturais de temperatura ambiente de amostras sensíveis a dioxígenos.
Sonda de bomba Embora os seguintes resultados representativos não tenham sido coletados no Diamond Beamline I24, esses métodos foram desenvolvidos em estreita colaboração entre as instalações do programa iNEXT para trabalhar em direção aos métodos padrão no desenvolvimento de métodos de cristalografia serial. A Beamline I24 oferece, ou em breve, oferecerá métodos de coleta equivalentes aos descritos abaixo para realizar tais experimentos usando os métodos descritos nos protocolos acima.
Sonda de bomba: Mistura rápida A mistura rápida SSX foi realizada no feixe T-REXX em PETRA III por Mehrabi et al (2019) 28 usando um injetor de gotículas orientada por piezo para iniciar reações em alvos fixos. Este trabalho apresenta uma prova de princípio sobre o experimento de mistura de chips que liga glcNac3a microcristais de lysozyme, com a vinculação ocorrendo dentro de 50 ms de uma gota de 75 pL sendo aplicada à amostra. Este estudo foi acompanhado com uma série de 7 estruturas resolvidas com tempo de atividade de isomerase de xilose, demonstrando a ligação de glicose dentro de 15 ms e a formação de uma conformação de anel aberto na molécula de glicose após um atraso de 60 segundos. Uma configuração equivalente para injeção de gotícula está atualmente em desenvolvimento para uso no I24.
Bomba-sonda: Ativação da luz Um experimento serial ativado por luz é apresentado em Schulz et al (2018) 49. Fluoroacetato desidrogenase foi encharcado com fluoroacetato fotocaged e bombeado com luz laser de 320-360 nm para produzir estruturas em 4 pontos de tempo (t=0, 30, 752 e 2.052 ms). A estrutura do estado de repouso (0 ms) mostra um local ativo vazio, com exceção de algumas moléculas de água, e densidade equivalente entre os domínios da tampa de ambas as subunidades proteicas. 30 ms e 752 ms após a ativação da luz uma redução significativa na densidade eletrônica pode ser observada no domínio da tampa da subunidade B em relação à subunidade A. A redução da densidade eletrônica no domínio da tampa da subunidade B coincide com o aparecimento de fluoroacetato no local ativo da subunidade A a 752 ms. O conjunto de dados final em 2.052 ms mostra mais rearranjo estrutural do ligante, suspeito de facilitar a geometria correta para o ataque SN2, e formação potencial de um estado intermediário na reação. No I24, um sistema de laser Pharos portátil que é incapaz de 210-2500 nm fornecendo pulsos femtosegundos pode ser usado para ativação de luz. Os experimentos iniciais mostraram a ativação bem sucedida de uma fotocagem usando excitação de 308 nm com vinculação do ligante liberado à proteína alvo observada. No momento da integração de escrita no sistema de segurança de pessoal da linha de vigas está em andamento e experimentos rotineiros de usuários são antecipados no início de 2021. Para experimentos quando pulsos menos intensos de luz são necessários, a ativação de luz com LEDs controlados por TTL foi realizada com sucesso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Figura 1: Equipamento de carregamento de amostras no lugar na Fonte de Luz De Diamante. A configuração consiste em uma bomba de vácuo(a),porta-luvas(b)e umidificador(c). Dentro da caixa de luvas a pressão de vácuo é usada para agir em um chip carregado com chorume de cristal mantido em um bloco de amostra(d) preso a um frasco de Büchner(e, arqueiro verde), através de um regulador de pressão(f, seta amarela) ligado a uma torneira(g, seta azul). O ar úmido é bombeado para dentro da tenda através de tubos plásticos ligados ao umidificador(h),e medidos com um higrômetro(i). Os componentes são mantidos no lugar utilizando grampos(j). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Figura 2: Titulares de amostras. Eles utilizam um anel O de metal(a ) para fixar o filme de poliéster em uma parte superior(b) e inferior(c)metade, com a metade inferior ostentando montagens magnéticas(d)que são usadas para anexar o suporte da amostra aos estágios da amostra. O filme de poliéster (6 μm (e) ou 3 μm(f))bem como os anéis O de borracha (setas brancas) impedem que um chip carregado de cristal seque rapidamente em um suporte de amostra que é fechado apertado com parafusos hexaxais(g). Os chips são limpos usando banhos sequenciais de 15 minutos em dH2O, 1 M HCl e dH2O(h). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Figura 3: A GUI de coleta de dados para coleta de dados de destino fixo em I24. (a) Mostra a interface principal usada para alinhar chips e definir parâmetros de coleta de dados, (b) é a interface de mapeamento lite usada para definir sub-regiões de um chip para coleta de dados e (c) é uma interface para definir parâmetros para iluminação a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Figura 4: O processo de montagem de um suporte de chip nas etapas como descrito na Etapa 3, ponto 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Figura 5: Alinhamento do chip. Um chip é alinhado clicando em três marcadores fiduciais no chip mostrado em (a). As visualizações dos fiduciais 0, 1 e 2 através do sistema de visualização do feixe no eixo são mostradas em (b),(c) e(d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Figura 6: Os resultados de processamento automático são lançados conforme descrito na etapa 6.1. Um plot de taxa de acerto atualizado é exibido(a, inset). Se um 'hit' for clicado na imagem de difração correspondente, será exibido no visualizador de imagem dials. A taxa de acerto para a coleta de dados atual é mostrada (29,6% neste exemplo). Painel (b) mostra um exemplo de uma janela mostrando as taxas atuais de indexação e integração para dados coletados até agora durante a visita que atualiza em tempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Figura 7: Análise mais aprofundada dos dados. A visualização dos parâmetros celulares unitários pode revelar polimorfos(a). São calculados parâmetros unitários médios; no entanto, isso ainda não se estende às médias individuais para polimorfos. A visualização de um pequeno subconjunto de dados (dados mostrados são um subconjunto de 793 cristais de nitrito de cobre reductase dos dados descritos em Ebrahim et al 2019) é muitas vezes suficiente para revelar tendências. Parcelas 2D de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carregamento ou desidratação que possam ser abordados para a próxima coleta de dados (b). Projeções estereógráficas podem revelar a presença, ou ausência, orientações preferenciais que remontam ao protocolo de carregamento(c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

A cristalografia síncrotron serial, ou SSX, é uma área relativamente nova e em rápido desenvolvimento do MX.É muito adequada para experimentos de baixa dose e temperatura ambiente, mas talvez o mais importante, é realmente adequado para seguir dinâmicas. Isso permite que filmes de stop-motion de proteínas em ação sejam feitos. No I24, vários modos de SSX estão disponíveis.Este protocolo se concentra no SSX de alvo fixo, que permite uma ampla gama de experimentos seriais usando quantidades limitadas de amostra. Os chips de silício podem ser danificados ao carregá-los e limpá-los, se você não estiver familiarizado com eles. Além disso, o protocolo de alinhamento do chip é completamente novo para muitos cristalógrafos, e o processamento de dados é ligeiramente diferente dos seus dados de rotação padrão.Para preparar um suporte de chip, corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em aproximadamente 6 por 6 centímetros quadrados, e coloque os lençóis sobre as duas placas base. Usando anéis de vedação metálica, fixar as folhas no lugar e, em seguida, puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio para remover quaisquer vincos. Em seguida, selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado em relação ao tamanho dos cristais a serem analisados.Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 milibar, com uma corrente de 15 miliamperes. Use pinças para colocar o chip de silício no estágio de carregamento do chip, com as barras levantadas viradas para baixo. Em seguida, usando uma pipeta, aplique 200 microliters do chorume microcristal na parte plana do chip, espalhando o chorume para cobrir todos os blocos da cidade do chip.Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster, para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado. Em seguida, aplique um vácuo suave para aspirar todo o excesso de líquido através do chip. Remova o chip da fase de carregamento do chip e limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas guia, lado plano para baixo. Coloque a pequena metade do suporte do chip sobre o chip para selá-lo. As duas metades do suporte do chip devem encaixar no lugar.Em seguida, usando parafusos hexax, fixe o chip com segurança no lugar. Para alinhar o chip, segure o suporte do chip em um ângulo de 30 graus enquanto se aproxima da montagem. Em seguida, use as montagens cinemáticas para colocar o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe.Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao fluxo e clique no lugar. Uma vez colocado o chip, use o sistema de visualização em eixo e a interface gráfica de usuário de alinhamento de chip para localizar o fiducial superior esquerdo do chip. Para centralizar o fiducial 0 em X, Y e Z, mova-se para dentro e para fora do foco para alinhar Z, para cima e para baixo para alinhar Y, e esquerda e direita para alinhar X.Em seguida, clique em Definir Fiducial 0"Depois de alinhar fiducial 1 e 2 com o feixe de raios-X da mesma maneira, clique em Fazer sistema coordenado"para gerar uma matriz coordenada.Em seguida, clique em Bloquear verificação"para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade. Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Nesta representação gráfica de resultados de localização spot do DIALS pode ser observada uma parcela de taxa de acerto atualizada.Se um hit for clicado, a imagem de difração correspondente será exibida no visualizador de imagem DIALS. Nesta tabela, as taxas atuais de indexação e integração que se atualizam em tempo real à medida que os dados são coletados durante a visita podem ser visualizadas. A visualização dos parâmetros celulares da unidade pode revelar polimorfos.Parcelas bidimensionais de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carga ou desidratação. Projeções estereográficas podem revelar a presença ou ausência de orientações preferenciais que podem ser alimentadas de volta ao protocolo de carregamento. Por exemplo, nesta projeção, podem ser observados os efeitos da sobrecarga de um chip com cristais de lisezóz.Ao carregar o chip, pipeta lentamente e use o dedo para descansar a pipeta acima do chip. Isso evita que você toque no chip e acidentalmente esfaqueia buracos no silício. Ao processar dados, faça uso dos pipelines automatizados disponíveis.Isso lhe dará uma boa ideia de como seu experimento está progredindo, e se você precisar variar algo. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema proteico que possa ser cristalizado em quantidades significativas. E a reação pode ser desencadeada por raios-X leves ou mistura rápida.Estudos dinâmicos sobre uma série de estruturas podem fornecer uma visão de como as proteínas funcionam.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

As larvas de Drosophila são sensíveis à luz e respondem às mudanças na luz circundante. Este vídeo descreve um ensaio que testa sua capacidade de evitar a luz, chamado de ensaio do ponto de luz. O protocolo apresentado demonstra como configurar o ensaio com um LED de luz azul e mostra como registrar o comportamento do animal em resposta ao encontro com a luz.

Ensaio de ponto de luz: um método para investigar o comportamento fototático da Drosophila

Neste relatório, nós descrevemos os procedimentos detalhados para a realização de experimentos de difração de cristal único de raios-X com uma bigorna de diamante na GSECARS de 13 BM-C beamline na Advanced Photon Source. programas Atrex e RSV são usados ​​para analisar os dados.

Alta Pressão Único Difração de Cristal no PX ^ 2

Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.

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Um protocolo é apresentado para irradiação automatizada de folhas de ouro finas com pulsos laser de alta intensidade. O protocolo inclui uma descrição passo a passo do processo de fabricação de alvos de micromaquinamento e um guia detalhado de como os alvos são trazidos para o foco do laser a uma taxa de 0,2 Hz.

Entrega automatizada de alvos microfabricados para experimentos intensos de irradiação a laser

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

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Cristalização e Coleta de Dados de Temperatura Ambiente In Situ Usando a Instalação de Cristalização em Harwell e Linha de Luz VMXi, Fonte de Luz Diamante

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

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Aprenda cristalografia serial de sincrotrão com alvo fixo na linha I24 do Diamond Light. Este protocolo detalha preparação de chips de silício, alinhamento preciso e processamento de dados em tempo real para estudos dinâmicos de proteínas.

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