Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light
February 26th, 2021
Apresentamos um guia abrangente para preparação fixa de amostras de alvo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia síncrotron serial na linha de feixe Diamond I24.
A cristalografia síncrotron serial, ou SSX, é uma área relativamente nova e em rápido desenvolvimento do MX.É muito adequada para experimentos de baixa dose e temperatura ambiente, mas talvez o mais importante, é realmente adequado para seguir dinâmicas. Isso permite que filmes de stop-motion de proteínas em ação sejam feitos. No I24, vários modos de SSX estão disponíveis.
Este protocolo se concentra no SSX de alvo fixo, que permite uma ampla gama de experimentos seriais usando quantidades limitadas de amostra. Os chips de silício podem ser danificados ao carregá-los e limpá-los, se você não estiver familiarizado com eles. Além disso, o protocolo de alinhamento do chip é completamente novo para muitos cristalógrafos, e o processamento de dados é ligeiramente diferente dos seus dados de rotação padrão.
Para preparar um suporte de chip, corte duas folhas de papel alumínio de poliéster em aproximadamente 6 por 6 centímetros quadrados, e coloque os lençóis sobre as duas placas base. Usando anéis de vedação metálica, fixar as folhas no lugar e, em seguida, puxe cuidadosamente o excesso de papel alumínio para remover quaisquer vincos. Em seguida, selecione um chip de silício com aberturas de tamanho adequado em relação ao tamanho dos cristais a serem analisados.
Glow descarreza o chip por 25 segundos a 0,39 milibar, com uma corrente de 15 miliamperes. Use pinças para colocar o chip de silício no estágio de carregamento do chip, com as barras levantadas viradas para baixo. Em seguida, usando uma pipeta, aplique 200 microliters do chorume microcristal na parte plana do chip, espalhando o chorume para cobrir todos os blocos da cidade do chip.
Se o chip estiver danificado, cubra qualquer orifício com um pequeno pedaço de papel alumínio de poliéster, para garantir que um vácuo uniforme possa ser aplicado. Em seguida, aplique um vácuo suave para aspirar todo o excesso de líquido através do chip. Remova o chip da fase de carregamento do chip e limpe cuidadosamente a parte inferior do chip com papel filtro para remover o excesso de líquido.
Coloque o chip carregado na metade maior do suporte do chip entre as marcas guia, lado plano para baixo. Coloque a pequena metade do suporte do chip sobre o chip para selá-lo. As duas metades do suporte do chip devem encaixar no lugar.
Em seguida, usando parafusos hexax, fixe o chip com segurança no lugar. Para alinhar o chip, segure o suporte do chip em um ângulo de 30 graus enquanto se aproxima da montagem. Em seguida, use as montagens cinemáticas para colocar o chip carregado no estágio XYZ na linha de feixe.
Quando os ímãs fizerem contato, permita que o suporte do chip gire paralelamente ao fluxo e clique no lugar. Uma vez colocado o chip, use o sistema de visualização em eixo e a interface gráfica de usuário de alinhamento de chip para localizar o fiducial superior esquerdo do chip. Para centralizar o fiducial 0 em X, Y e Z, mova-se para dentro e para fora do foco para alinhar Z, para cima e para baixo para alinhar Y, e esquerda e direita para alinhar X.Em seguida, clique em Definir Fiducial 0"Depois de alinhar fiducial 1 e 2 com o feixe de raios-X da mesma maneira, clique em Fazer sistema coordenado"para gerar uma matriz coordenada.
Em seguida, clique em Bloquear verificação"para mover o estágio XYZ para o primeiro poço de cada bloco da cidade. Se a mira de raios-X se alinhar com as aberturas, o chip está alinhado. Nesta representação gráfica de resultados de localização spot do DIALS pode ser observada uma parcela de taxa de acerto atualizada.
Se um hit for clicado, a imagem de difração correspondente será exibida no visualizador de imagem DIALS. Nesta tabela, as taxas atuais de indexação e integração que se atualizam em tempo real à medida que os dados são coletados durante a visita podem ser visualizadas. A visualização dos parâmetros celulares da unidade pode revelar polimorfos.
Parcelas bidimensionais de parâmetros úteis também podem ser produzidas para revelar variações que surgem devido aos efeitos de carga ou desidratação. Projeções estereográficas podem revelar a presença ou ausência de orientações preferenciais que podem ser alimentadas de volta ao protocolo de carregamento. Por exemplo, nesta projeção, podem ser observados os efeitos da sobrecarga de um chip com cristais de lisezóz.
Ao carregar o chip, pipeta lentamente e use o dedo para descansar a pipeta acima do chip. Isso evita que você toque no chip e acidentalmente esfaqueia buracos no silício. Ao processar dados, faça uso dos pipelines automatizados disponíveis.
Isso lhe dará uma boa ideia de como seu experimento está progredindo, e se você precisar variar algo. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema proteico que possa ser cristalizado em quantidades significativas. E a reação pode ser desencadeada por raios-X leves ou mistura rápida.
Estudos dinâmicos sobre uma série de estruturas podem fornecer uma visão de como as proteínas funcionam.
Visão Geral
Este artigo fornece um guia abrangente para preparação de amostra de alvo fixo, coleta de dados e processamento de dados para cristalografia de síncrotron serial na linha de feixe I24 do Diamond. Ele enfatiza a metodologia para conduzir experimentos com quantidades limitadas de amostra, garantindo a integridade do chip.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Cristalografia
- Dinâmica de Proteínas
Fundamentos
- Cristalografia de síncrotron serial (SSX) é uma área em desenvolvimento na cristalografia de macromoléculas.
- É adequada para experimentos de baixa dose e temperatura ambiente.
- SSX permite estudos dinâmicos de proteínas, permitindo a visualização de suas ações.
- SSX de alvo fixo pode utilizar quantidades limitadas de amostra de forma eficaz.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para SSX de alvo fixo na linha de feixe I24 do Diamond.
- Garantir a preparação e alinhamento adequados dos chips para coleta de dados ideal.
- Destacar as diferenças no processamento de dados em comparação com dados de rotação padrão.
Métodos Utilizados
- Preparação de chips de silício usando folha de poliéster e técnicas de selagem.
- Aplicação de pasta de microcristais nos chips e aspiração a vácuo.
- Alinhamento do chip usando uma interface gráfica de usuário na linha de feixe.
- Visualização e processamento de dados em tempo real usando pipelines automatizados.
Principais Resultados
- Alinhamento bem-sucedido dos chips leva à coleta precisa de dados.
- Monitoramento em tempo real das taxas de indexação e integração durante os experimentos.
- Visualização dos parâmetros da célula unitária revela polímeros e efeitos de carregamento.
- Estudos dinâmicos fornecem insights sobre a funcionalidade das proteínas.
Conclusões
- O protocolo aumenta a eficiência dos experimentos SSX de alvo fixo.
- O manuseio e alinhamento adequados dos chips são críticos para a coleta bem-sucedida de dados.
- Estudos dinâmicos usando SSX podem avançar significativamente nossa compreensão do comportamento das proteínas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
