Produção de nanodroplets de decafluorobutano filtrados por membrana a partir de microbolhas pré-formadas

Este protocolo é um método fácil de reduzir a polidispersidade de gotículas vaporizáveis de baixo ponto de ebulição para uso em aplicações biomédicas. Esta técnica condensa microbolhas de gás pré-formadas e filtra as gotículas líquidas resultantes por tamanho de uma forma controlável, escalável e relativamente econômica. Este método pode ser aplicado a uma variedade de microbolhas lipídicas com diferentes shell e material de gás usando diferentes filtros para controlar o tamanho final da gotícula.

Demonstrando o procedimento estará Darrah Merillat, pesquisadora de graduação do laboratório do Dr. Sirsi. Ligue o interruptor de alimentação para o sonicator e defina a amplitude ao máximo permitido usando o acessório de microtáldea e garanta o tempo de sônica definido para 10 segundos. Coloque a solução lipídica hidratada quente no compartimento de som com a microfina logo abaixo da superfície.

Fixar um comprimento apropriado de tubulação no pescoço do frasco para guiar o gás da saída do tanque DFB na solução lipídica quente mantida no gabinete. Abra a válvula do tanque lentamente até que o gás possa ser visto fluindo sobre a solução lipídica, causando pequenas ondulações na superfície do líquido. Se o fluxo de gás for muito alto, a solução transbordará durante a formação de microbolhas.

Inicie o sonicator e execute-o por 10 segundos continuamente para gerar microbolhas. Após o término da sonicação, feche imediatamente a válvula do tanque DFB. Tampa rapidamente a solução de microbolhas e submergir o frasco em um banho de gelo para esfriar a amostra abaixo de 55 graus Celsius.

Use um filtro cerâmico de 200 nanômetros para montar a extrusora de alta pressão de acordo com o manual do usuário e coloque-a no centro de um recipiente à prova d'água, de modo que o tubo de saída de amostra não seja pressionado contra o lado, ou amassado. Junte a extrusora ao tanque de gás nitrogênio usando o adaptador fornecido pelo fabricante. Coloque a extremidade do tubo de saída em um frasco de cintilação para coletar a amostra extrudada, fixando o tubo no recipiente com fita adesiva para ficar dentro do frasco.

Abra e feche a válvula de liberação para garantir que não haja pressão dentro da extrusora. Remova a tampa da câmara. E adicione cinco mililitros de PBS à câmara extrusora.

Substitua a tampa, certificando-se de que ela clique com segurança de volta ao lugar. Abra o tanque de gás nitrogênio, de modo que o medidor de pressão leia 250 PSI, certificando-se de que a válvula de controle de pressão está na posição fechada. Feche o tanque de gás e abra a válvula de entrada da câmara extrusora, fazendo com que a solução PBS seja empurrada através do sistema, e para fora do tubo de saída de amostra para o frasco de cintilação.

Quando apenas o gás está saindo da tubulação, abra a válvula de liberação e permita que a pressão caia para zero PSI. Em seguida, remova o frasco de cintilação. Abra e feche a válvula de liberação para ter certeza de que não há pressão dentro da extrusora e coloque um novo frasco de cintilação no final do tubo de saída.

Encha um recipiente de aço com 2-metilbutano, e adicione gelo seco para baixar a temperatura para menos 18 graus Celsius. Insira a solução de microbolhas no 2-metilbutano refrigerado, submergindo a amostra por dois minutos. Mova o frasco de cintilação ao longo dos dois minutos para misturar suavemente as bolhas.

Adicione gelo seco conforme necessário para manter a temperatura entre menos 15 e menos 18 graus Celsius. Após dois minutos, remova as microbolhas do 2-metilbutano refrigerado. Gire suavemente o frasco para misturar os microbolhas e transfira bolhas em uma seringa de 10 mililitros refrigerados.

Remova a tampa da câmara extrusora e adicione a solução de microbolhas à câmara empurrando lentamente o êmbolo sobre a seringa. Substitua a tampa da extrusora, certificando-se de que ela clique com segurança no lugar. Verifique se a válvula de controle de pressão e a válvula de liberação da extrusora estão na posição fechada.

Abra o tanque de gás nitrogênio até que o medidor de pressão leia 250 PSI. Feche o tanque de gasolina e gire a válvula de controle de pressão para a posição aberta. Quando a solução encheu o frasco de cintilação na tubulação de saída e apenas o gás está saindo do tubo, lentamente abra a válvula de liberação de pressão e permita que a pressão caia para zero PSI.

Transfira 10 mililitros da solução de gotícula extrudada para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a amostra extrudada a 1.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e as gotículas vaporizadas espontaneamente que aparecem no topo da solução.

Suspenda a pelota que compreende nanodroplets DFP em 10 mililitros de PBS com 20% de glicerol e 20% de propilenoglicol. A distribuição de tamanho de soluções de bolha condensada com e sem extrusão mostra que a amostra condensada só tem uma distribuição muito mais ampla centrada perto de 400 nanômetros, enquanto a amostra extrudada tem uma distribuição mais estreita centrada em 200 nanômetros. A análise de sensoriamento de pulso de resistência táccula usada para analisar gotículas de mudança de fase, pois foram lavadas por centrifugação para remover o excesso de lipossomos, mostra que os tamanhos das gotículas estão perto de 200 nanômetros.

Os dados de microscopia da vaporização de nanodroplet quando aquecidos mostram que alguns microbolhas vaporizadas espontaneamente são aparentes no campo de visão antes do aquecimento, e um maior número de microbolhas de gás são observados após o aquecimento. As imagens de microscopia de nanodroplets inseridas no extrusor diretamente sem pré-resfriamento, condensadas a zero grau Celsius, e a menos 18 graus Celsius são mostradas aqui. Imagens representativas de gotículas de octafluoropropano condensadas antes e depois da vaporização também mostram um maior número de microbolhas de gás após o aquecimento, semelhante às gotículas dfb.

A coisa mais importante a ser lembrada durante este procedimento é que o rendimento da gota é altamente dependente da temperatura e pressão durante a condensação, e pequenas variações impactarão os resultados. Após a geração de gotículas vaporizáveis, elas podem ser usadas para otimizar a imagem in vivo e a entrega de medicamentos usando ultrassom, bem como outras aplicações in vivo e ex vivo. Após o desenvolvimento dessa técnica, os efeitos do tamanho de nanodroplet e do conteúdo do núcleo de gás em limiares de vaporização in vivo foram explorados usando pequenas modificações neste protocolo.