Name: Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Aprenda a gerar e expandir cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico de pacientes. Este protocolo reprodutível permite modelar doenças cardiovasculares e testar toxicidade cardíaca de novos fármacos.

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Este estudo foi apoiado pelo American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Adicional Ventures AVIF e SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) concede 1R01HL124245, 1R01HL132520 e R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao também foi apoiado por fundos de startup do Instituto de Pesquisa Abigail Wexner no Nationalwide Children's Hospital.

Os protocolos experimentais e o consentimento informado para os seres humanos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Nacional da Criança.
1. Preparação de meios de cultura celular, soluções e reagentes
<ol><li>Prepare a mídia PBMC<ol>
<li>Misture 20 mL de mídia cultural basal PBMC (1x) e 0,52 mL de suplemento. Adicione 20 μL de SCF e FLT3 cada (concentração de estoque: 100 μg/mL), 4 μL de IL3, IL6 e EPO cada (concentração de estoque: 100 μg/mL) e 200 μL de alternativa L-glutamina (100x). Misture-os bem. Filtrar em uma coifa estéril usando uma unidade de filtro de 0,22 μm. Nomeie isso como Mídia de Sangue Completo.</li>
		<li>Misture 20 mL de mídia de cultura basal PBMC (1x) e 0,52 mL do Suplemento. Adicione 200 μL de alternativa L-glutamina (100x). Misture-os bem. Filtrar usando uma unidade de filtro de 0,22-μm. Nomeie isso como Supplement Blood Media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mídia E8 completa<ol>
<li>Misture 500 mL de mídia basal E8 e 10 mL de suplemento E8 (descongelado durante a noite a 4 °C) para fazer mídia E8 completa. Equilibre-se à temperatura ambiente (RT) antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mídia de passagem iPSC<ol>
<li>Adicione 40 μL de inibidor de rocha Y-27632 (diluição de 1:5.000, concentração de estoque: 10 mM) a 200 mL de mídia E8 completa. Misture bem. Equilibre-se ao RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare mídia de diferenciação de cardiomiocócito<ol>
<li>Mídia I: Misture 500 mL de RPMI1640 com 10 mL de B27 menos suplemento de insulina (50x).</li>
		<li>Mídia II: Adicione um volume apropriado de estoque CHIR99021 (inibidor GSK3) ao Media I (quir99021 concentração final de 6 μM). Homogeneizar.</li>
		<li>Mídia III: Adicione um volume apropriado de estoque IWR-1 (inibidor Wnt) à Media I (Concentração final IWR-1 de 5 μM). Homogeneizar.</li>
		<li>Mídia IV: Mix 500 mL de RPMI1640 com 10 mL de suplemento B27 (50x). Homogeneizar.</li>
		<li>Mídia V: Misture 500 mL de RPMI1640 (sem glicose) com 10 mL de suplemento B27 (50x). Homogeneizar.</li>
		<li>Mídia VI: Adicione um volume apropriado de estoque CHIR99021 à Media IV (quir99021 concentração final de 2 μM). Homogeneizar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mídia de passagem iPSC-CM<ol>
<li>Adicionar 10 mL de Substituição de Soro De Nocaute (KSR) a 90 mL de Media IV (concentração final de KSR: 10%). Misture bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mídia de congelamento iPSC-CM<ol>
<li>Adicione 1 mL de DMSO a 9 mL de KSR (concentrações finais: 10% DMSO/90% KSR) e misture bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare matrículas de matriz de membrana de porão de médio porte<ol>
<li>Descongele a matriz da membrana do porão a 4 °C durante a noite e aliquot em tubos de 1,5 mL. Adicione 1 mL deste meio a 250 mL de mídia DMEM/F12 (diluição de 1:250) e misture-os completamente. Aplique 2 mL da solução diluída por poço em uma placa de 6 poços e incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 30 minutos antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reprogramação iPSC de PBMCs
<ol><li>Separe os PBMCs das amostras de sangue.<ol>
<li>Coletar amostras de sangue do paciente (~5 mL) e transferir-se para tubos de separação de células sanguíneas (ver Tabela de Materiais). Misture invertendo 10x.</li>
		<li>Centrifugar a 1.500 x g por 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire os tubos com cuidado e pulverize com 70% de etanol. Sob um capuz biossegurança, remova as tampas sem perturbar as células mononucleares (camada buffy). Os PBMCs estarão em uma camada esbranquiçada logo abaixo da camada de plasma(Figura 1A). Colete toda a camada buffy usando uma pipeta de 1000 μL e transfira para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Conte o número do celular usando um contador automático de células. Gire o tubo a 300 x g por 25 min no RT.</li>
		<li>Descarte o supernatante. Lave com 10 mL de DPBS (Ca2+/Mg2+ grátis).</li>
		<li>Gire o tubo a 300 x g por 15 min no RT.</li>
		<li>Remova o supernatante. Pelotas de célula resuspend em 1 mL da mídia de congelamento (KSR mais 10% DMSO). Ajuste a densidade celular para fazer 1 x 106 células por frasco.</li>
		<li>Coloque os criovias PBMC em um recipiente de congelamento celular e mantenha -80 °C durante a noite. Transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longa data no dia seguinte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>reprogramação do iPSC.<ol>
<li>Adicione 3 mL de mídia de sangue suplemento em um tubo cônico de 15 mL. Descongele os PBMCs em banho-maria de 37 °C e transfira-os para um tubo cônico. Gire a 300 x g por 7 min no RT.</li>
		<li>Descarte o supernatante. Resuspend PBMCs com mídia de sangue completa. Semeou-os em dois poços de 24 placas de cultura de tecido bem (sem matriz de membrana do porão).</li>
		<li>Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, remova suavemente metade da mídia antiga (0,5 ml) e adicione 0,5 mL de mídia de sangue completa fresca.</li>
		<li>Mude a mídia a cada dois dias, refrescando metade da velha mídia.</li>
		<li>Depois de uma semana, lave agressivamente o poço com 1 mL de Supplement Blood Media e transfira células para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Conte o número do celular. Pegue 2 x 105 células e centrífuga a 300 x g por 7 min.</li>
		<li>Descarte o supernatante. Células resuspend com 300 μL de Mídia sanguínea completa. Realize a transfecção adicionando volume apropriado de vetores de reprogramação do vírus Sendai de acordo com as instruções do fabricante. Transfira-os para um poço de uma placa de 24 poços (sem matriz de membrana do porão). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte gire a 300 x g por 7 min. Remova o supernatante e resuspende em 2 mL de Mídia sanguínea completa. Transfira para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestida com matriz de membrana do porão. Este é o dia 1 (D1).</li>
		<li>Não toque no prato no dia seguinte.</li>
		<li>Na D3, remova 1 mL da mídia antiga. Adicione 1 mL de mídia sanguínea suplementar.</li>
		<li>Repita o passo 2.2.10 em D5.</li>
		<li>Na D7, remova 1 mL da mídia antiga. Adicione 1 mL de mídia E8 completa.</li>
		<li>Em D8, repita a etapa 2.2.12.</li>
		<li>Na D9, remova a mídia antiga. Adicione 2 mL de mídia E8 completa. Espera-se que células completamente reprogramadas se conectem e comecem a formar colônias.</li>
		<li>Atualize com 2 mL de mídia E8 completa todos os dias.</li>
		<li>Cerca de 2 semanas após a transdução do vírus Sendai, grandes colônias iPSC aparecerão e estarão prontas para serem colhia.</li>
		<li>Corte colônias iPSC sob um estereótipo no capô e transfira colônias individuais para uma placa de 24 poços revestida de matriz de porão pré-carregada com 0,5 mL de mídia de passagem iPSC.</li>
		<li>Atualize com 0,5 mL de mídia E8 completa todos os dias até que as colônias iPSC cresçam o suficiente para passar para uma nova placa de 6 poços revestidos de matriz de membrana de porão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Manutenção e passagem do iPSC humano
<ol><li>Quando os iPSCs humanos atingem mais de 90% de confluência, remova a mídia antiga. Enxágüe com 3 mL de DPBS uma vez.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 0,5 mM EDTA na solução DPBS. Incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 5-8 min.</li>
	<li>Remova o EDTA por aspiração. Adicione 1 mL de mídia de passagem iPSC. Desalojar manualmente iPSCs.</li>
	<li>Pegue 600-900 μL de suspensão de célula única e reemplaque-os em uma placa de 6 poços revestida de matriz de porão (diluição: 1:6 a 1:10). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Atualize com 2 mL de mídia E8 completa todos os dias. As culturas iPSC geralmente atingem confluência após 3-4 dias.</li>
</ol>4. Diferenciação de cardiomiócitos quimicamente definida
<ol><li>Cultura iPSCs humanos em mídia E8 completa até 95% confluente (3-4 dias).</li>
	<li>Remova a mídia antiga. Adicione 2 mL de diferenciação CM Media II (6 μM CHIR em RPMI1640 mais suplemento de insulina B27 menos) a cada poço de uma placa de 6 poços. Este é o D0. Não toque na D1.</li>
	<li>Em D2, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media I (RPMI1640 mais B27 menos suplemento de insulina).</li>
	<li>Em D3, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media III (5 μM IWR-1 em RPMI1640 mais suplemento de insulina B27 menos). Não toque na D4.</li>
	<li>Em D5, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media I.</li>
	<li>Em D7, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV (RPMI1640 mais suplemento B27). Depois disso, refresque a mídia dia não.</li>
	<li>Em D11 quando as células de contração são observadas, substitua por 2 mL de diferenciação cm Media V (sem glicose).</li>
	<li>Na D13, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media V.</li>
	<li>Em D15, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV.</li>
	<li>Em D17-D21, substitua por 2 mL de diferenciação CM Media IV a cada dois dias.</li>
</ol>5. Passagem de iPSC-CMs humanos
<ol><li>Remova a mídia antiga e enxágue células com 3 mL de DPBS uma vez.</li>
	<li>Aplique 1 mL de solução de dissociação cm (ver Tabela de Materiais) em cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar em 5% de CO2 a 37 °C por 5-8 min.</li>
	<li>Dissociar mecanicamente iPSC-CMs em células únicas por tubulação vigorosa.</li>
	<li>Transfira células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 2 mL de mídia de passagem cm (10% KSR em RMPI1640 mais suplemento B27) para neutralizar a solução de dissociação cm.</li>
	<li>Gire a 300 x g por 5 min no RT.</li>
	<li>Descarte o supernatante. Células resuspend com um volume desejado de mídia de passagem cm. Semeou-os em uma membrana de porão placa/prato revestido de matriz. IPSC-CMs humanos retomam a batida de 1-3 dias após a passagem.</li>
</ol>6. Expansão de iPSC-CMs humanos
<ol><li>Enxágüe D10-12 batendo iPSC-CMs com 3 mL de DPBS para cada poço de uma placa de 6 poços uma vez. Adicione 1 mL de solução de dissociação cm (Passo 5.2). Incubar em 5% DE CO2 a 37 °C por 7-10 min.</li>
	<li>Dissociar mecanicamente iPSC-CMs em células únicas por tubulação vigorosa.</li>
	<li>Transfira células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 2 mL de mídia de passagem cm para neutralizar a solução de dissociação cm.</li>
	<li>Gire a 300 x g por 5 min no RT.</li>
	<li>Descarte o supernatante. Células resuspend com um volume apropriado de mídia de passagem cm. Pipeta para cima e para baixo para fazer suspensão de célula única. Semente um milhão de iPSC-CMs em um prato de 10 cm revestido de matriz de membrana de porão.</li>
	<li>No dia seguinte, remova a velha mídia. Adicionar 10 mL de mídia de proliferação de cardiomiócitos (Mídia VI: 2 μM CHIR99021). Mude a mídia dia não.</li>
	<li>Quando os iPSC-CMs se tornarem confluentes após 7-9 dias de cultura, repita o passo de aprovação para uma maior expansão dos iPSC-CMs.</li>
</ol>7. Imunofluorescência
<ol><li>Antes da coloração da imunofluorescência, as sementes iPSC-CMs em tampas revestidas de matriz de membrana do porão que são colocadas em uma placa de 24 poços (densidade de semeadura: 0,5-1 x 106 células/mL). Manter iPSC-CMs na cultura por pelo menos 4 dias.</li>
	<li>Lave células usando 1 mL de DPBS uma vez.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de paraformaldeído de 4% (PFA) e incubar por 15 min na RT.</li>
	<li>Lave as células usando 1 mL de DPBS. Repita uma vez.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de 0,1% Triton X-100 e incubar por 20 min na RT.</li>
	<li>Lave com 1 mL de DPBS duas vezes.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de 0,2% BSA em DPBS (solução de bloqueio). Incubar na RT por 1 h.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de anticorpo primário diluído com solução de bloqueio (diluição: 1:400-1:1000). Incubar a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lave as células usando 0,5 mL de solução de bloqueio por 3 minutos com agitação. Repita duas vezes.</li>
	<li>Adicione 200 μL de anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio. Incubar na RT por 1 h.</li>
	<li>Enxágüe células três vezes com 0,5 mL de DPBS, cada uma por 3 minutos com agitação.</li>
	<li>Núcleos de contra-retenção com DAPI (diluição de 1:2000) e incubam por 5 min na RT.</li>
	<li>Enxágüe células três vezes com 0,5 mL de DPBS.</li>
	<li>Monte células nas tampas em um slide de microscópio usando 5 μl de mídia de montagem. Armazene a 4 °C e proteja contra a luz.</li>
</ol>8. Preparação da amostra de citometria de fluxo
<ol><li>Lave iPSC-CMs humanos com 3 mL de DPBS uma vez.</li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de dissociação cm e incuba em 5% de CO2 a 37 °C por 7-10 min.</li>
	<li>Desalojar células usando uma pipeta de 1.000-μL. Transfira a suspensão celular para um tubo FACS redondo através de uma tampa de filtro. O tubo FACS é pré-preenchido com 1 mL de mídia de passagem iPSC-CM (10% KSR) para neutralizar a atividade enzimática.</li>
	<li>Gire a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernatante sem perturbar a pelota celular. Adicione 250 μL de solução de fixação/permeabilização (ver Tabela de Materiais). Incubar por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 1 mL de perm/tampão de lavagem. Vórtice brevemente e gire a 300 x g por 4 min.</li>
	<li>Descarte o supernatante. Adicione 100 μL de anticorpos primários diluídos (1:200-1:500) em 1x Perm/Wash buffer. Vórtice brevemente e incubar durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1 mL de tampão Perm/Wash. Vórtice brevemente e gire a 300 x g por 4 min.</li>
	<li>Descarte o supernatante. Adicione 100 μL de anticorpos secundários diluídos (1:500-1:1.000). Vórtice brevemente e incubar na RT por 1 h. Proteja-se da luz se os anticorpos secundários forem conjugados com fluorescência sensível à luz.</li>
	<li>Lave as células adicionando 1 mL de perm/tampão de lavagem. Vórtice brevemente e girar em 300g por 4 min.</li>
	<li>Descarte o supernatante. Células resuspend com 400 μL de tampão de coloração FACS (PBS/4% FBS). Armazene a 4 °C até carregar em um instrumento FACS.</li>
</ol>9. QPCR em tempo real
<ol><li>Remova a mídia antiga na cultura iPSC-CM humana. Adicione 500-700 μL de tampão de lise às células de lise. Incubar por 3 min no RT. Scape celular lysate e transferir para um tubo de 1,5 ml RNase-free. Proceda à extração total de RNA imediatamente ou armazene a -80 °C.</li>
	<li>Isole o RNA total usando um kit de extração de RNA seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Meça a concentração de RNA e avalie a qualidade do RNA total por um espectotômetro.</li>
	<li>Realize a reação de transcrição reversa usando um kit de síntese cDNA. O volume total de reação de RT é de 20 μL incluindo 4 μL de mix de reação (5x), 1 μL de transcriptase reversa,1 μg de RNA total e água sem RNase.</li>
	<li>Incubar a mistura completa de reação RT em um cicloviário térmico usando o seguinte protocolo: 25 °C por 5 min; 46 °C por 20 min; 95 °C por 1 min; mantenha a 4 °C.</li>
	<li>Diluir o CDNA por 1:10 usando água sem nuclease. Configure a reação qPCR em tempo real misturando 1 μL de modelo cDNA, 1 μL de primers/sonda, 10 μL de mix mestre qPCR e 8 μL de água sem nuclease.</li>
	<li>Execute em um sistema PCR em tempo real. O protocolo de ciclismo é de 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 seg, 60 °C 1 min, repita para 40 ciclos.</li>
	<li>Coletar valores CT para cada gene em cada amostra. A abundância relativa de mRNA é calculada subtraindo o valor CT do gene-alvo do valor CT de um gene de limpeza. A expressão genética relativa é analisada pelo método 2-ΔΔCT.</li>
</ol>10. Gravação de grampo de remendo de célula inteira
<ol><li>Dissociar iPSC-CMs em células únicas usando a solução de dissociação cm como descrito anteriormente.</li>
	<li>Células de sementes em baixa densidade em deslizamentos revestidos de matriz de membrana porão. Cultuá-los por 3-4 dias na Mídia IV.</li>
	<li>Puxe pipetas (resistência 0,9-1,5 MΩ) de capilares de vidro borossilicato usando um puxador de microeletrídro horizontal.</li>
	<li>Incubar células na solução de Tyrode (pH=7,35).</li>
	<li>Enchir pipetas com solução de eletrodo (pH=7.3) compostas dos seguintes produtos químicos: ácido aspático de 120 mM, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfocreatina, 4 mM K-ATP e 2mM creatine phosphokinase.</li>
	<li>Coloque as células no modo de fixação atual usando um pulso de corrente de 1,5-2 diastólico de 5 ms a 1 Hz.</li>
	<li>Registrar potenciais de ação (APs) usando um amplificador de microeletrodo e uma placa de aquisição orientada por software.</li>
</ol>

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<li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li>
<li>Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+notch+signaling+promotes+cardiomyocyte+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+heart+through+Wnt+pathway+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism.</a> Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).</li>
<li>Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+cardiac+growth+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Determinants of cardiac growth and size.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150(2020).</li>
<li>Campa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+activates+cell+cycle+reentry+and+progression+in+quiescent+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).</li>
<li>Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+signaling+stimulates+proliferation+of+immature+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes.</a> Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
</ol>

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Durante a reprogramação do IPSC, é fundamental cultivar PBMCs por 1 semana até que sejam ampliados com núcleos claros e citoplasma. Como os PBMCs não proliferam, um número celular apropriado para transdução viral é importante para a reprogramação bem sucedida do iPSC. O número celular de PBMCs, a multiplicidade de infecção (MOI) e o título do vírus devem ser considerados e ajustados para alcançar os resultados ideais de transdução. Para a diferenciação cardíaca, a densidade inicial de semeadura é fundamental para que os ...

A descoberta de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem revolucionou a medicina cardiovascular moderna1,2. IPSCs humanos são capazes de se auto-renovar e gerar todos os tipos de células no coração, incluindo cardiomiócitos, células endividadas, células musculares lisas e fibroblastos cardíacos. Cardiomiócitos derivados do paciente iPSC (iPSC-CMs) podem servir como recursos indefinidos para modelagem de doenças cardiovasculares geneticamente hereditárias (DCV) e testes de segurança cardíaca para novos medicamentos3. Em particular, os pacientes iPSC-CMs estão bem preparados para investigar etiologias genéticas e moleculares de DCV que são derivadas de defeitos em cardiomiócitos, como síndrome de QT longa4 e cardiomiopatia dilatada (DCM)5. Combinados com a edição de genoma mediada pelo CRISPR/Cas9, os pacientes iPSC-CMs abriram uma avenida sem precedentes para entender a complexa base genética de DCV, incluindo defeitos cardíacos congênitos (CHDs)6,7,8. Os iPSC-CMs humanos também apresentaram potenciais para servir como fontes de células autólogas para repor o miocárdio danificado durante um ataque cardíaco9. Nos últimos anos, tornou-se primordial gerar iPSC-CMs humanos de alta qualidade com subtipos definidos (atrial, ventricular e nodal) para regeneração cardíaca e teste de drogas10.
A diferenciação cardíaca dos iPSCs humanos tem sido muito avançada na última década. Os métodos de diferenciação passaram da diferenciação espontânea baseada no corpo embrionário (EB) para a diferenciação cardíaca quimicamente definida e direcionada11. As principais moléculas de sinalização essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário, como Wnt, BMP, Nodal e FGF são manipuladas para melhorar a diferenciação de cardiomiócitos dos iPSCs humanos10,12. Avanços significativos incluem modulação sequencial de sinalização Wnt (ativação seguida de inibição) para geração robusta de cardiomiócitos a partir de iPSCs humanos13,14. Receitas de diferenciação cardíaca quimicamente definidas têm sido exploradas para facilitar a produção em larga escala de cardiomiócitosbatendo 15,16, que têm potencial para serem atualizados para a produção de nível industrial e clínico. Além disso, a expansão robusta dos IPSC-CMs humanos precoces é alcançada pela exposição à ativação constitutiva do Wnt utilizando um pequeno produto químico (CHIR99021)17. Mais recentemente, cardiomiócitos específicos do subtipo são gerados através da manipulação de vias de sinalização de ácido retinóico (RA) e Wnt em janelas específicas de diferenciação durante o compromisso de linhagem cardiomiocócica dos iPSCs humanos18,19,20,21,22.
Neste protocolo, detalhamos um procedimento de trabalho para geração robusta e proliferação de CMs humanos originários de células mononucleares sanguíneos periféricos do paciente. Apresentamos protocolos para 1) reprogramação de PBMCs humanos para iPSCs, 2) geração robusta de cardiomiócitos pulsantes de iPSCs humanos, 3) expansão rápida de IPSC-CMs precoces, 4) caracterização molecular de iPSC-CMs humanos e 5) medição eletrofisiológica de iPSC-CMs humanos no nível unicelular por remendo. Este protocolo abrange os procedimentos experimentais detalhados na conversão de células sanguíneas do paciente em cardiomiócitos.

<table><tbody><tr><td>ABI 7300 Sistema de PCR em Tempo Real Rápido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B Amplificador de Microeletrodo</td><td>Dispositivos</td><td></td><td>Moleculares Amplificador de Microeletrodo</td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix / Cytoperm Kit de Fixação/Permeabilização</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Solução de Fixação/Permeabilização, Tampão Perm/Wash</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Tubo CPT</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>Tubo de separação de células sanguíneas</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Kit de reprogramação</td><td>de vírus Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td>Sendai</td></tr><tr><td>Digidata 1200B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Placa de aquisição</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td>kit de extração de RNA</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>E8 mídia para cultura iPSC</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Alternativa de L-glutamina</td></tr><tr><td>Fator de crescimento reduzido Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>iScript cDNA Snythesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>síntese de cDNA</td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S7086</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 7.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia</td></tr><tr><td>EPO humano recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC9631</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante FLT3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC9414</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante IL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Humano recombinante IL6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>PHC0065</tr><tr><td>SCF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 médio, sem glicose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>Thermo Meio de cultura Fisher Scientific</td><td>10639011</td><td>PBMC</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444964</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme 10x, sem vermelho de fenol</td> Solução <td>de</td><td>dissociação</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> A1217703 CM</tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>solução de dissociação iPSC</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Produtos Químicos Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e expansão de cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

A geração de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue tem atraído enorme interesse em medicina de precisão em doenças cardiovasculares. A diferenciação cardíaca das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) é modulada por vias de sinalização definidas que são essenciais para o desenvolvimento do coração embrionário. Inúmeros métodos de diferenciação cardíaca em plataformas 2D e 3D foram desenvolvidos com várias eficiências e rendimento de cardiomiócitos. Isso tem intrigado investigadores fora do campo, pois a variedade desses métodos pode ser difícil de seguir. Aqui apresentamos um protocolo abrangente que elabora geração robusta e expansão de cardiomiócitos específicos do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos (PBMCs). Primeiro descrevemos um protocolo de reprogramação iPSC de alta eficiência a partir da amostra de sangue de um paciente usando vetores de vírus Sendai não integração. Em seguida, detalhamos um pequeno método de diferenciação de monocamadas mediada por moléculas que pode produzir robustamente cardiomiócitos de batida da maioria das linhas iPSC humanas. Além disso, um protocolo escalável de expansão do cardiomiócito é introduzido usando uma pequena molécula (CHIR99021) que poderia expandir rapidamente cardiomiócitos derivados do paciente para aplicações de grau industrial e clínico. No final, são retratados protocolos detalhados para identificação molecular e caracterização eletrofisiológica desses iPSC-CMs. Esperamos que este protocolo seja pragmático para iniciantes com conhecimento limitado sobre desenvolvimento cardiovascular e biologia de células-tronco.

Reprogramação do iPSC humano dos PBMCs Após a pré-cultura com mídia sanguínea completa por 7 dias, os PBMCs tornam-se grandes com núcleos visíveis e citoplasma (Figura 1B),indicando que estão prontos para a transfecção do vírus. Após a transfecção com os fatores de reprogramação do vírus Sendai, os PBMCs passarão por um processo de reprogramação epigenética por mais uma semana. Normalmente, temos 30-50 colônias iPSC da transfecção de 1 x 1...

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Esta é uma ampla facilidade de protocolo, aumentos brutos de geração, e uso de culturas específicas do paciente a partir de células mononucleares de sangue periféricos. Essas táticas são reprodutíveis e fáceis de seguir, especialmente para iniciantes. E não exija.especialistas em baladas de células-tronco, ou medicina cardiovascular.Nosso protocolo pode ser usado para gerar cardiomiócitos específicos do paciente a partir de uma única coleta de sangue que pode ser usada para modelar doenças cardiovasculares e testar a toxicidade cardíaca de novas drogas. Este protocolo requer um longo compromisso com a manutenção da reprogramação de células-tronco e diferenciação direcionada. No entanto, você realmente aprecia seus esforços.Quando você vê cardiomiócitos batendo no prato. Quando as colônias humanas de iPSC atingirem mais de 90% de confluência, enxágue cada poço com três mililitros de DPBS antes de tratar as células com um mililitro de 0,5 mililitro EDTA em DPBS por poço a 37 graus Celsius. Após cinco a oito minutos, adicione um mililitro de média de passagem iPSC para cada poço e desaloja manualmente as células.Transfira de 600 a 900 microlitres das células para wells individuais têm uma membrana de porão revestida de seis placas de poço para uma incubação durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, refrescar as culturas com dois mililitros de meio E8 completo todos os dias durante três a quatro dias. Quando a cultura atingir a confluência, substitua o meio por dois mililitros de meio de diferenciação de cardiomiocócito, dois por poço.No segundo dia, substitua os supernacantes por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito. No terceiro dia, substitua os supernantes por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito médio três. No quinto dia.Substitua o supernatante por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito. No sétimo ao dia 10, substitua o supernasciente por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito quatro. Nos dias 11 e 13.Quando as células de contração forem observadas, substitua o supernaente por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito cinco. Nos dias 15, 17, 19 e 21. Substitua o supernatante por dois mililitros de diferenciação de cardiomiocócito médio quatro.Após a pré-cultura com meio sanguíneo completo por sete dias, o PBMC tornou-se grande com núcleos visíveis e citoplasma indicando que eles estão prontos para transfecção com fatores de reprogramação do Vírus Sendai. Após a introdução ao meio E8 completo. As células completamente reprogramadas se ligarão e começarão a formar colônias.Após quatro a cinco passagens, colônias de iPSC altamente puras se formarão a partir das células reprogramadas com pouquíssimas células diferenciadas observadas. Nesta fase, a maioria das células são OCT4 e NANOG indicativo positivo de sua pluripotenia. Cardiomiócitos batendo são geralmente observados após 12 dias de diferenciação.Após a fome de glicose, e replando cardiomiócitos iPSC exibe, espancamento espontâneo, e uma estrutura de sarcomere alinhada com troponina cardíaca intercalada T e expressão de actinina alfa. As colônias mantêm sua pureza como evidenciado por sua expressão Troponin T. Embora os cardiomiócitos iPSC sejam relativamente imaturos comparados aos cardiomiócitos adultos.Eles demonstram potenciais de ação ventriculares e atrial, medidos por patch por atacado, grampo. Cardiomiócitos ventriculares expressam a cadeia de luz da miosina dois, enquanto os cardiomiócitos iPSC atrial são marcados pela expressão NR2F2. A ativação do WNT estimula a divisão celular e promove a expressão dos reguladores do ciclo celular.Curiosamente, a ativação do WNT também induz a proliferação robusta de cardiomiócitos iPSC precoces por duas passagens em comparação com os controles, embora essa capacidade proliferativa diminua com o tempo. Certifique-se de que o PBMS seja ampliado com o nuclear e o citoplasma claros antes que os vetores de reprogramação do iPSC sejam introduzidos, pois a condição dos PBMs é fundamental para a reprogramação do iPSC. Cardiomiócitos específicos do paciente são valiosos para modelar doenças cardiovasculares in vitro e para fornecer uma tonelada de células doadoras para terapia de células-tronco cardíacas.

generation-expansion-human-cardiomyocytes-from-patient-peripheral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Aqui, apresentamos um método para eficientemente aproveitar o potencial de diferenciação cardíaca da jovens fontes de células-tronco mesenquimais humanas a fim de gerar células funcionais, contratantes, casos, como in vitro.

In Vitro Diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas em células casos funcionais

Aqui nós descrevemos um método dimensionável, usando uma simples combinação de Activin A e mediada por lentivirus Id1-superexpressão, para gerar a primeiras progenitores cardíaca como campo de coração e cardiomyocytes ventricular, como de células estaminais pluripotentes humanas.

Geração do primeiro coração campo-como progenitores cardíaca e Cardiomyocytes Ventricular, como de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de uma instalação experimental para uma análise da avaliação da integridade do DNA em células antes do transplante de células-tronco.

Avaliar a integridade do DNA de células-tronco para terapia celular cardíaca

Aqui, descrevemos uma metodologia fácil de usar para gerar matrizes microtissue cardíacas auto-montadas em 3D compostas de cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos pelo homem, cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Esta técnica de necessidade de células fáceis de usar e baixas para gerar microtissues cardíacas pode ser implementada para modelagem de doenças e estágios iniciais do desenvolvimento de medicamentos.

Fabricação de matrizes microtissue cardíacas 3D usando Cardiomiócitos derivados do iPSC humano, fibroblastos cardíacos e células endoteliais

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Aprenda a gerar e expandir cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico de pacientes. Este protocolo reprodutível permite modelar doenças cardiovasculares e testar toxicidade cardíaca de novos fármacos.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

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