Name: Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a preparar exossomos GMP em larga escala a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando bioreator 3D. Este método eficiente amplia aplicações em pesquisa de biologia de exossomos e tratamentos clínicos para artrite.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (No.2018B0303110003); Projecto de Cooperação Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Projetos de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, Não. JCYJ20170817172023838, Não. JCYJ20170306092215436, Não. JCYJ20170413161649437); Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (No.2020M682907); Fundação de Investigação Básica e Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201612079); Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na Província de Guangdong.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana do Segundo Hospital Popular de Shenzhen. Um diagrama esquemático de exossomos isolados do protocolo in vitro de hSF-MSCs é mostrado na Figura 1.
1. Cultura e identificação de SF-MSCs humanas
<ol><li>Colher 20 mL de SF usando seringa e agulha de pacientes clínicos com OA.<ol><li>Desinfetar a articulação do joelho do paciente com OA. Punção do tendão do quadríceps femoral fora da patela para a cavidade articular com uma agulha 7#.</li>
		<li>Extraia 10 mL do fluido articular. Cubra o local da punção com o bastão de transfusão e pressione por 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante SF após centrifugação a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender o pellet celular com 10 mL de solução salina 1x tampão fosfato (PBS), centrifugar a 1.500 x g por 10 min a 4 °C e descartar o PBS.</li>
	<li>Ressuspeite o pellet com 10 mL de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de 5 x 104 células/mL (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, coloque a suspensão em um prato de 100 mm.</li>
	<li>Incubar o prato a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2.</li>
	<li>Após 48 h, retire as células não aderentes trocando o meio e lave com 1x PBS. Substitua o meio a cada 3 dias por 2 semanas.</li>
	<li>Colete os sobrenadantes da cultura celular.</li>
	<li>Identificar SF-MSCs usando citometria de fluxo.<ol><li>Digerir a terceira geração (P3) de SF-MSCs, centrífuga a 1.000 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e colete o pellet celular. NOTA: Uma passagem é reconhecida como a subcultura das células para outro prato de cultura. As células primárias isoladas de SF e semeadas em pratos são rotuladas como passagem zero (P0). Com cerca de 75% de confluência, as células são digeridas e separadas dos pratos, semeadas em outros pratos e rotuladas como P1.</li>
		<li>Adicione 400 μL de tampão de bloqueio (1% BSA em 1x PBS) ao pellet da célula (5 x 104) e deixe-o repousar durante 15 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Adicionar 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticorpo fluorescente monoclonal HLA-DR (razão de diluição 1:100) (ver Tabela de Materiais) por tubo e incubar a RT durante 30 min.</li>
		<li>Lave duas vezes com 1x PBS e descarte o sobrenadante. Recolher o pellet celular e ressuspender em 100 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Detectar em um citômetro de fluxo até 10.000 células usando filtros de 525/50 e 585/40 para detectar os fluoróforos.</li>
	</ol></li>
</ol>2.3D cultura de células de biorreator
<ol><li>Preparação de microtransportadores<ol><li>Inchar 0,75 g secos de microcarreadores (ver Tabela de Materiais) e hidratar em 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 mL/g de microcarreadores) por pelo menos 3 h no RT.</li>
		<li>Decantar o sobrenadante e lavar os microtransportadores por 5 min em DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores). Descarte o PBS e substitua-o por 1x DPBS fresco (50 mL/g de microcarreadores).</li>
		<li>Esterilizar os microcarreadores por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Deixe os microportadores esterilizados se assentarem, decantando o sobrenadante.</li>
		<li>Enxaguar brevemente os microcarreadores no meio de cultura (50 mL/g de microcarreadores) no RT. Deixe os microcarreadores assentarem, descarte o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Biorreator de perfusão<ol><li>Esterilizar o biorreator por autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).</li>
		<li>Conte o número de SF-MSCs e aloque 2,5 x 107 SF-MSCs e microtransportadores ao biorreator perfundido com meio de cultura MSC de grau GMP (250 mL).</li>
		<li>Colocar o biorreator em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C. Gire o biorreator a uma velocidade de 15 rpm. Mude o meio de cultura a cada 6 dias.</li>
		<li>Coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise mais aprofundada após a cultura por 14 dias.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificação de exossomos e detecção de segurança
<ol><li>Ultracentrifugação<ol><li>Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descartar os detritos celulares.</li>
		<li>Centrifugar os sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante; descarte as vesículas maiores (corpos apoptóticos e algumas microvesículas maiores).</li>
		<li>Centrifugar novamente o sobrenadante a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 °C para remover vesículas maiores; coletar os pellets e ressuspender em 40 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugar os pellets ressuspensos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e ressuspender os pellets que contêm exossomas em 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) NOTA: Para cada corrida, 500 μL da amostra foram injetados na câmara a uma taxa de fluxo de 30 μL/min. Efectuar a análise a 24,4 °C-24,5 °C.<ol><li>Diluir as amostras de exossomas recém-isoladas com PBS estéril de 1x a 1 mL contendo 107-10 9 /mL de partículas e injetá-las no sistema de análise de rastreamento de nanopartículas (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.</li>
		<li>Analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software (consulte Tabela de materiais) com base no rastreamento de pelo menos 200 partículas individuais por execução.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia eletrônica de transmissão<ol><li>Fixe os exossomos em paraformaldeído a 4% (em frio 1x DPBS) por 5 min.</li>
		<li>Monte 5 μL dos exossomos em grades de cobre. Neste experimento, a concentração de exossomos é de 1 mg/mL quantificada por um kit de ensaio de proteínas (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Incorpore os exossomos em ácido fosfotúngstico a 3% por 10 min no gelo. Remova o excesso de ácido e seque as amostras no RT.</li>
		<li>Fotografe as amostras de exossomos por um MET a uma tensão de aceleração de 100 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha ocidental<ol><li>Adicione 300 μL de tampão de lise (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) e coquetel de inibidores de protease (ver Tabela de Materiais) aos exossomos.</li>
		<li>Misture os exossomos no tampão de lise pipetando para cima e para baixo e deixe-o repousar sobre o gelo por 20 minutos.</li>
		<li>Centrifugar a mistura a 9,391 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteína (consulte Tabela de materiais).</li>
		<li>Adicionar 100 μL de tampão de carga proteica 4x e aquecer a 100 °C durante 10 min.</li>
		<li>Carga de 15 μL de proteínas na concentração de 10 mg/mL e executado por eletroforese em gel (120 V, 70 min) e eletroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.</li>
		<li>Detecte os marcadores não específicos do exossomo (calexina) e os biomarcadores exossômicos (CD9, CD63 e CD81) por western blotting fluorescente (consulte Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Teste de segurança<ol><li>Para a detecção de bactérias, fungos e Mycobacterium tuberculosis , siga as etapas 3.5.2-3.5.5.</li>
		<li>Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/mL) numa placa de cultura em ágar sangue (ver Tabela de Materiais) e incubar a placa de cultura a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Semear 100 μL da solução exossomótica (1 mg/ml) numa placa média de ágar sabouraud (ver Tabela de Materiais) e incubar a 35 °C durante 48 h.</li>
		<li>Semear 100 μL da solução exossómica (1 mg/ml) numa placa de meio de cultura de Lowenstein-Jensen (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.</li>
		<li>Detectar o aparecimento de bactérias, fungos e colônias de Mycobacterium tuberculosis por observação macroscópica. NOTA: Os critérios para avaliar a segurança dos exossomos são a ausência de microrganismos na placa de cultura.</li>
		<li>Para detecção de Mycoplasma, siga as etapas 3.5.7-3.5.9.</li>
		<li>Ressuspender os exossomos em 50 μL de solução tampão incluída no kit e aquecer a 95 °C durante 3 min.</li>
		<li>Amplificar o Mycoplasma em solução exossômica usando um kit de detecção de Mycoplasma por PCR (consulte Tabela de Materiais).</li>
		<li>Detectar os produtos de PCR em eletroforese em gel de agarose a 1,5% (30 min, 120 V).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Detecção da função exossômica in vitro
<ol><li>Rotulagem de exossomos<ol><li>Rotular 100 μL de exossomos (1 mg/mL) com 1 mM de Dil (1000x) (ver Tabela de Materiais) e incubar em RT por 30 min.</li>
		<li>Recuperar os exossomos por ultracentrifugação a 100.000 x g por 70 min. Ressuscite o pellet em 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregamento de Cy3-miR-140 imita em exossomos<ol><li>Misture 1 μg/μL de proteína exossômica e 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 em um volume final de 400 μL de tampão de eletroporação (1,15 mM de fosfato de potássio (pH 7,2), 25 mM de cloreto de potássio e 21% (v/v) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Transfira a mistura para cuvetes de eletroporação frias de 0,4 cm e eletroporate a uma capacitância de 300 V/100 μF usando um sistema de transfecção gênica (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Imediatamente após a eletroporação, mantenha a mistura em RT por 30 minutos para garantir que a membrana do exossomo seja totalmente restaurada.</li>
		<li>Trate as misturas com uma unidade de RNase A (ver Tabela de Materiais) por 20 minutos para eliminar os miRNA imitados fora dos exossomos.</li>
		<li>Ultracentrifugar a mistura de exossomos a 120.000 x g por 90 min, descartar o sobrenadante e ressuspender os exossomos em 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de absorção de exossomos<ol><li>Semeando os condrócitos (1 x 107) em placas confocais de 35 mm com 1 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS.</li>
		<li>Após 24 h, tratar os condrócitos com exossomos marcados com DiI (100 ng/mL) ou exossomos carregados com cy3-miR-140 (100 ng/mL) por 1 h.</li>
		<li>Lave com 1x PBS três vezes e, em seguida, rotule com DAPI (10 ng/mL) por 10 min no RT.</li>
		<li>Registre o sinal de fluorescência em microscopia de fluorescência a laser confocal (CLSM) usando os filtros apropriados (consulte Tabela de materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Realizar análises estatísticas utilizando software estatístico apropriado. NOTA: Os dados representativos em cada figura foram expressos como a média ± DP. O teste t de Student foi utilizado para a comparação de dois grupos utilizando um software de estatística. Uma ANOVA one-way seguida do múltiplo de Tukey foi realizada no caso de comparações entre múltiplos grupos. Os valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis%3A+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+bone%2C+cartilage+regeneration+remains+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li>
<li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine+and+Arthroscopy+Review%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li>
<li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li>
<li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%3A+a+proof-of-concept+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li>
<li>Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis%3A+state+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li>
<li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li>
<li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Lv, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li>
<li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+%283D%29+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção18. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armazenamento e remessa p...

A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade 1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez lesada 3,4. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA5. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, causando lesões na cartilagem. Além disso, o procedimento exigirá uma segunda operação para implantar os condrócitos expandidos6. Assim, terapias de uma etapa para o tratamento da OA sem lesões cartilaginosas estão sob extensa exploração.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridas como alternativas promissoras para o tratamento da OA 7,8. Originárias de múltiplos tecidos, as CTMs podem se diferenciar em condrócitos com estimulação específica. É importante ressaltar que as CTMs podem modular as respostas imunes por meio da anti-inflamação9. Portanto, as MSCs possuem vantagens significativas no tratamento da OA, reparando defeitos da cartilagem e modulando a resposta imune, especialmente no meio inflamatório. Para o tratamento da OA, as CTMs do líquido sinovial (SF-MSCs) têm atraído recentemente muita atenção devido à sua maior capacidade de diferenciação de condrócitos do que outras fontes deCTMs 10,11. Notavelmente, na clínica ortopédica, a extração de SF inflamatória da cavidade articular é uma terapia de rotina para aliviar o sintoma de dor de pacientes com OA. A SF inflamatória extraída geralmente é descartada como resíduo médico. Tanto os pacientes quanto os médicos estão prontos para considerar as CTMs autólogas isoladas da SF inflamatória como tratamento da OA com muito poucos conflitos éticos. No entanto, a terapia SF-MSC está comprometida devido a riscos tumorigênicos, armazenamento de longo prazo e barreiras de remessa distantes.
Os exossomos, secretados por muitos tipos de células, incluindo MSCs, carregam a maior parte da bioinformação da célula-mãe. Tem sido investigada em profundidade como terapia livre de células12,13. De acordo com os recursos atualizados disponíveis no site do governo de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov), estudos clínicos exossômicos mais extensos são iniciados e realizados nos campos de pesquisa de câncer, hipertensão e doenças neurodegenerativas. O tratamento com exossomos SF-MSC pode ser um estudo empolgante e desafiador para lidar com a OA. A produção de exossomos de boas práticas de fabrico (BPF) e de exossomas em larga escala é essencial para a tradução clínica. O isolamento exossomático em pequena escala tem sido amplamente realizado com base em cultura de células bidimensionais (2D). No entanto, as estratégias de produção de exossomos em larga escala precisam de otimização. Um método de fabricação de exossomos em larga escala foi desenvolvido neste estudo, baseado na cultura maciça de SF-MSC em condições livres de xeno. Após a ultracentrifugação de sobrenadantes de cultura celular, a segurança e a função do exossomo foram validadas.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensaio BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Ensaio de concentração de proteína</td></tr><tr><td>Placa de ágar sangue</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>Cultura de bactérias</td></tr><tr><td>CD105 anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD34 anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD45 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD63 anticorpo</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A5271</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD73 anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD81 anticorpo</td><td>ABclonal</td><td>&nbsp; A5270</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD9 anticorpo</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A1703</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD90 anticorpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>Centrífuga de citometria de fluxo</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Centrífuga 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td> Cultura de <td>células</td><td>térmicas</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia confocal de fluorescência de varredura a laser</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Microcarrier</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>Rótulo de exossomo</td></tr><tr><td>EZ-PCR Kit de detecção de micoplasma</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>Detecção</td></tr> de <tr><td>micoplasma Citometria</td><td>de fluxo Beckman</td><td></td><td>Identificação MSC</td></tr><tr><td>Sistema Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1652660</td><td>Transfecção de genes</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Versão 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo HLA-DR</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>Meio</td></tr> de <tr><td>cultura Lowenstein-Jensen de citometria de fluxo</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>T0573</td><td>Cultura de Mycobacterium tuberculosis</td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>MSC cultura</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Análise de rastreamento de nanopartículas</td></tr><tr><td>Software NTA 2.3</td><td>Malvern</td><td></td><td>Análise de dados</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>Fluorescente western blotting</td></tr><tr><td>OptiPrep tampão de eletroporação</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>Transfecção de genes</td></tr><tr><td>Inibidores de protease coquetel</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Inibidor de proteinase</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>Remoção da placa de</td></tr><tr><td>ágar RNA Sabouraud</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>Cultura de fungos</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>O Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>Cultura 3D</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Centrífuga de exossomo</td></tr></tbody></table>

preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3d

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.

A citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs, de acordo com os critérios mínimos para definição de CTMs humanas recomendados pela International Society for Cellular Therapy14,15. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas neste estudo preencheram os critérios de identificação das CTMs. Foram negativos para CD34, CD45 e HLA-DR (abaixo de 3%) e positivos para CD73, CD90 e CD105 (acima de 95%) (...

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando nosso biorreator 3D. Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da artrite. Demonstrando o procedimento será o Dr. Yujie Liang.Comece a coletar as células mesenquimais humanas, ou MSCs, centrifugando o líquido sinovial a 1, 500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 10 mililitros de PBS. Centrifugar as células ressuspensas a 1, 500 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e descartar o PBS antes de ressuspender o pellet com 10 mililitros de meio de cultura MSC humano a uma densidade celular de cinco vezes 10 para a quarta célula por mililitro e, em seguida, chapear a suspensão em um prato de 100 milímetros.Incubar o prato a 37 graus Celsius numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Após duas semanas, coletar o sobrenadante da cultura celular para identificar células-tronco mesenquimais do líquido sinovial, ou SF-MSCs, usando citometria de fluxo. Para fazer isso, digerir a passagem de terceira geração três de SF-MSCs por centrifugação a 1.000 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, descarte o sobrenadante antes de coletar o pellet celular. Em seguida, adicione 400 microlitros do tampão de bloqueio ao pellet da célula na concentração de cinco vezes 10 ao quarto e deixe o pellet repousar por 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, centrifugar a suspensão celular conforme descrito anteriormente e, em seguida, ressuspender o pellet separado em 100 microlitros de PBS 1X.Adicione um microlitro do anticorpo fluorescente monoclonal a uma razão de diluição de 1:100 por tubo, conforme descrito no manuscrito, e coloque o tubo para incubação à temperatura ambiente por 30 minutos. Após a incubação, lave as células duas vezes com 1X PBS e ressuspenda as células em 100 microlitros de 1X PBS. Em seguida, detecte os fluoróforos em até 10.000 células em um citômetro de fluxo usando canais vermelhos e FITC.Para preparar os microcarreadores, inchar e hidratar seco 0,75 gramas dos microtransportadores em 1X DPBS na concentração de 50 miligramas por grama por pelo menos três horas à temperatura ambiente. Em seguida, decante o sobrenadante para lavar os microtransportadores em DPBS fresco por cinco minutos. Depois de substituir o meio por 1X DPBS fresco a 50 miligramas dos microtransportadores por grama, esterilize os microtransportadores por autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos a 15 libras por polegada quadrada.Em seguida, permita que os microportadores esterilizados se depositem antes de decantar o sobrenadante. Enxaguar os microcarreadores no meio de cultura na concentração de 50 miligramas dos microcarreadores por grama à temperatura ambiente. Quando os microportadores estiverem assentados, descarte o sobrenadante.Para preparar o biorreator de perfusão, esterilize o biorreator por autoclave, conforme descrito anteriormente. Quando terminar, conte o número de SF-MSCs para alocar 2,5 vezes 10 para o sétimo SF-MSCs e microportadores para o biorreator perfundido com 250 mililitros do meio de cultura MSC de grau GMP. Coloque o biorreator em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a uma velocidade de 15 rotações por minuto.Mude o meio de cultura a cada seis dias. Após 14 dias, coletar os sobrenadantes e microportadores da cultura celular para análise posterior. Centrifugar o sobrenadante da cultura celular a 300 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e coletar o sobrenadante enquanto descarta os detritos celulares.A quatro graus Celsius, centrífuga sequencial do sobrenadante a 2.000 vezes G por 10 minutos e depois a 10.000 vezes G por 30 minutos para descartar as vesículas maiores e coletar o pellet. Depois de ressuspender o pellet em 40 mililitros de PBS, centrifugar a suspensão da célula a 120.000 vezes G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuscite o pellet coletado contendo exossomos em 500 microlitros de PBS.Diluir as amostras de exossomos recém-isoladas com PBS estéril até a concentração de 10 a sétima a 10 a nona partículas por mililitro e injetar 500 microlitros da amostra para cada corrida na análise de rastreamento de nanopartículas, ou sistema NTA, a 30 microlitros por minuto e 24,4 a 24,5 graus Celsius. Defina manualmente o sistema de captura e análise de acordo com o protocolo do fabricante. Visualize as partículas por dispersão de luz laser e capture seu movimento browniano em vídeo digital.Em seguida, analise as fitas de vídeo gravadas utilizando software, rastreando pelo menos 200 partículas individuais por corrida. Para Western blotting, adicione 300 microlitros do tampão de lise e coquetel de inibidores de protease aos exossomos com mistura por pipetagem para cima e para baixo. Em seguida, deixe o ficar no gelo por 20 minutos.Após a centrifugação da mistura a 9, 391 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius, meça a concentração de proteína no sobrenadante usando um kit de ensaio de proteína. Após o ensaio, aqueça a amostra com 100 microlitros de tampão de carregamento de proteína 4X a 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, carregue 15 microlitros de proteínas a uma concentração de 10 miligramas por mililitro para funcionar por eletroforese em gel a 120 volts por 70 minutos e eletro-blotting a 100 volts por 60 minutos a quatro graus Celsius.Detecte os marcadores específicos não exossomos, como a calexina, e os biomarcadores exossômicos, como CD9, CD63 e CD81, por Western blotting fluorescente. No estudo, a citometria de fluxo foi utilizada para identificar os marcadores de superfície das SF-MSCs. A análise da citometria de fluxo revelou que as SF-MSCs cultivadas foram negativas para CD34, CD45 e HLA-DR e positivas para CD73, CD90 e CD105, atendendo aos critérios de identificação das CTMs.Sob microscopia invertida, observou-se que as SF-MSCs proliferam em microportadores. O SF-MCC proliferou na cultura 3D mais rapidamente a partir de seis dias em comparação com a cultura 2D. Os exossomos de SF-MSCs de cultura 2D e 3D foram identificados usando Western blotting e os exossomos expressaram CD63, CD9 e CD81 enquanto eram negativos para a calexina.A análise de nanócitos demonstrou que o diâmetro dos exossomos 2D e 3D era de aproximadamente 120 nanômetros. A análise microscópica eletrônica de transmissão revelou a morfologia dos exossomos 2D e 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidais. Usando a análise NTA, a concentração de partículas de 30 a 160 nanômetros foi analisada.Após a cultura 3D, a concentração de partículas foi de 4,0 vezes 10 a seis por mililitro. No entanto, após a cultura 2D, a concentração de partículas do mesmo tamanho foi de 2,5 vezes 10 a seis por mililitro. Além disso, a cultura 3D produziu mais proteína exossomótica do que a cultura 2D.A análise representativa mostra a internalização de exossomos marcados com Dil por condrócitos primários. Exossomos marcados com dil que entraram nos condrócitos primários podem ser vistos com um pico em três horas. O estudo de entrega in vitro demonstrou que os exossomos poderiam fornecer microRNA-140 marcado com sulfo-cianinina3 aos condrócitos.Planear as células, iniciar a reação no biorreator e o do sobrenadante são os passos mais importantes deste protocolo. A cultura 3D é comumente usada para cultura em larga escala de células aderentes. Outros métodos, como o spin flex, também podem ser usados para a produção em larga escala de exossomos.Nosso método melhora o rendimento dos exossomos, permitindo assim a aplicação pré-clínica baseada em exossomos de MSC.

large-scale-preparation-synovial-fluid-mesenchymal-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

Um protocolo que estabelece células-tronco mesenquimais (MSCs) isoladas do líquido sinovial e da medula óssea de miniporcos e coletadas de forma não invasiva por aspiração com seringa é apresentado. A fenotipagem celular foi realizada por citometria de fluxo após isolamento celular e cultivo in vitro de medula óssea e fluidos sinoviais derivados de MSCs.

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

O potencial terapêutico das células-tronco/estromais mesenquimais (MSCs) está bem documentado, no entanto, o melhor método de preparação das células para os pacientes permanece controverso. Aqui, comunicamos protocolos para gerar e administrar com eficiência agregados esféricos terapêuticos ou 'esferoides' de MSCs preparados em condições livres de xeno para aplicações experimentais e clínicas.

Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Este artigo apresenta um protocolo simples e económico para o simples isolamento e purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco Nova Zelândia.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Um exossomo é uma nova geração de portadores de entrega de drogas. Estabelecemos um protocolo de isolamento do exossomo com alto rendimento e pureza para a entrega de siRNA. Nós também encapsulados fluorescente etiquetado siRNA inespecífico em exosomes e investigou a absorção celular de siRNA-carregado exosomes em células cancerosas.

Preparação do Exosomes de siRNA entrega para as células cancerosas

Este protocolo descreve todos os procedimentos, desde a cultura de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo humano (ADSCs) e coleta de sobrenadante até a extração de vesículas extracelulares (EVs) usando ultracentrifugação.

Purificação e Caracterização de Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas de Tecido Adiposo Humano

Este estudo apresenta um protocolo para a fabricação de andaimes bioimpressos em 3D para cicatrização de feridas crônicas. As vesículas extracelulares são isoladas de células-tronco mesenquimais e carregadas no núcleo (alginato) com a bainha feita de carboximetilcelulose e alginato liase. Este projeto permite a degradação controlada do andaime e a liberação eficiente de EVs.

Otimizando a entrega de vesículas extracelulares usando um andaime bioimpresso em 3D com bainha central para tratamento de feridas crônicas

São fornecidas instruções para montar e usar um biorreator de fibras ocas de perfusão 3D para produção de vesículas extracelulares a partir de MSC e outros tipos celulares. Esse protocolo descreve um método para produzir vesículas extracelulares em altas concentrações de forma contínua, enquanto se controla a densidade celular em biorreatores de fibras ocas.

Produção em Larga Escala de Vesículas Extracelulares a partir de Culturas Celulares 3D de Alta Densidade em Biorreatores de Perfusão de Fibras Ocas

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Aprenda a preparar exossomos GMP em larga escala a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando bioreator 3D. Este método eficiente amplia aplicações em pesquisa de biologia de exossomos e tratamentos clínicos para artrite.

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D

Explorar mais vídeos