Name: In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo no olivo inferior de camundongos adultos usando lentes GRIN. Este protocolo cirúrgico minimamente invasivo permite monitorar atividade neuronal em tempo real sem danificar estruturas vitais do tronco encefálico.

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Agradecemos a Andrew Scott, do Centro de Mídia da OIST, por sua ajuda na gravação e edição de vídeo. Além disso, agradecemos a Hugo Hoedemaker por sua ajuda no desenvolvimento da cirurgia para expor o tronco cerebral e o Dr. Kevin Dorgans por sua ajuda com o desenho de diagramas para figuras. Além disso, muito obrigado a Salvatore Lacava por sua narração, bem como todos os membros do NRIM e animais de estimação para apoio contínuo ao bem-estar nos tempos difíceis do COVID-19.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como o procedimento cirúrgico envolve operações realizadas na região da garganta com inúmeras estruturas vitalmente críticas (artérias, nervos), é essencial que seja conduzido por um pesquisador com habilidades cirúrgicas de alto nível. Na sequência, destacamos e comentamos vários pontos-chave do procedimento; no entanto, deve-se lembrar que nenhuma quantidade de conselhos escritos pode suplantar a experiência, habilidade e intuição do pesquisador.
O passo mais crítico na cirurgia é a traqueotomia. Envolve cortar a traqueia, trocar isoflurano do cone do nariz para o tubo de intubação, fixar a traqueia na pele do peito e amarrando a traqueia e o tubo de intubação juntos. Todas essas operações devem ser concluídas de forma suave e rápida para evitar acidentes, como anestesia inadequada, entrada de fluido na traqueia ou deslizamento do tubo de intubação. Deve-se manter o protocolo claro em mente antes de cortar a traqueia.
A hemorragia é uma das principais causas de morte animal nesta cirurgia. Como a área do pescoço é densa com vasos sanguíneos, o corte só deve ser executado quando a linha de visão estiver clara para evitar o corte de veias e artérias invisíveis. Portanto, músculos e tecidos conjuntivos obscurando a visão devem ser removidos, e o sangue de capilares quebrados deve ser limpo antes de avançar.
O animal pode ser mantido vivo por um longo tempo (mais de 8 horas) desde o início da cirurgia. No entanto, é importante terminar o procedimento cirúrgico rapidamente para que haja mais tempo para examinar os neurônios do tronco cerebral quando a condição fisiológica animal é boa. Um pesquisador qualificado pode terminar todo o procedimento em 70 minutos.
Embora o método forneça uma visão limpa das superfícies cerebrais ventrais, infelizmente é impossível fazê-lo sem realizar uma traqueotomia, bem como remover quantidade significativa de tecido na região da garganta. Portanto, o animal não pode ser autorizado a acordar da anestesia. Além disso, embora seja possível manter o animal vivo por muitas horas com um ajuste cuidadoso do parto anestésico, mantendo a temperatura corporal e a hidratação, é inevitável que a experimentação prolongada eventualmente leve ao enfraquecimento da condição animal. Cabe à expertise do pesquisador considerar a duração máxima das gravações estáveis.
Outra limitação potencial do método descrito aqui é que, como a lente GRIN não está inserida no parenchyma cerebral, apenas neurônios relativamente superficiais (~150-200 μm) podem ser examinados. Embora a implantação cirúrgica da lente GRIN seja tecnicamente possível, o método de cirurgia aguda não permite tempo suficiente para os neurônios se recuperarem do estresse oxidativo e a presença de sangue após a implantação provavelmente degradará a qualidade da imagem além do aceitável.
Apesar das preocupações acima, acreditamos que esta é a primeira vez que um método de imagem in vivo de neurônios IO é apresentado. Permite o exame da atividade espesso nos neurônios IO no contexto in vivo na presença de insumos intactos diferentes de sistemas sensoriais, bem como os sinais dos núcleos cerebelares e da junção mesodiencefálica22, feito que até então não foi possível. Com este método, a função do IO pode agora ser investigada em maior profundidade com combinação de estimulação sensorial e optogenética. Notavelmente, com a evolução da imagem de tensão (como nosso método recente de imagem de tensão no IO 23), esperamos que o método cirúrgico apresentado inspire inúmeros pesquisadores a assumir o desafio de investigar como o IO contribui para a geração de picos complexos cerebelares.

O principal objetivo da neurociência de sistemas é entender como padrões de atividade espacial das redes neuronais contribuem para a geração do comportamento animal. Assim, a metodologia de imagem fluorescente utilizando sondas sensíveis ao cálcio tornou-se na última década uma ferramenta principal para examinar a atividade da rede neuronal em animais vivos1,2, pois permite a visualização de tais dinâmicas em escalas espaciais que vão desde células únicas até circuitos de mesoescala. Nos últimos anos, a abordagem comum onde circuitos neurais em estruturas cerebrais superficiais (como cortices cerebrais ou cerebelares) são imagens através de uma janela craniana transparente3 foi complementada com o uso de lentes de índice gradiente-refrativo (GRIN)4 permitindo o exame da dinâmica da rede em estruturas cerebrais profundas. As lentes GRIN disponíveis atualmente permitem alcançar estruturas de vários milímetros de profundidade, como a amígdala do rato, o hipocampo e o gânglio basal5. No entanto, muitas regiões de interesse, como vários núcleos na medula ventral, são significativamente mais profundas, colocando-as no extremo do alcance das lentes GRIN.
Aqui, descrevemos como superar essa dificuldade aproveitando a acessibilidade relativamente fácil da medula através do aspecto ventral do cérebro. Usando camundongos adultos onde a azeitona inferior (IO), um núcleo na medula ventral, foi viralmente transfeinada com um sensor de cálcio GCaMP6s, descrevemos os passos cirúrgicos (modificados do método descrito originalmente em Khosrovani et al. 20076) para colocar uma lente GRIN na superfície ventral do cérebro de um rato anestesiado. Usando um microscópio em miniatura, demonstramos a viabilidade de registrar atividade neuronal em regiões cerebrais extremamente ventrais. Embora o procedimento seja necessariamente uma cirurgia de não sobrevivência e nenhuma experimentação possa ser realizada em animais acordados, o método permite o exame da dinâmica da rede intacta no contexto da estimulação sensorial ou de outras vias diferentes, proporcionando claras vantagens sobre ex-abordagens viva, como o uso de preparações agudas de fatias.

<table><tbody><tr><td>AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, EUA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>Sutura absorvível com agulha de meio círculo de 6 mm</td><td>Natume, Japão</td><td>L6-60N2</td><td>agulha de gancho com rosca</td></tr><tr><td>Triângulos de absorção</td><td>FST, Alemanha</td><td>18105-03</td><td>Esponjas cirúrgicas Microscópios</td></tr><tr><td>estéreo</td><td>Leica, Alemanha</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha de ponta curva Castroviejo com trava</td><td>FST, Alemanha</td><td>12061-01</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>cotonetes</td><td>Sanyo, Japão</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de amarração de sutura delicada</td><td>FST, Alemanha</td><td>11063-07</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>Pinça de amarração de sutura delicada</td><td>FST, Alemanha</td><td>11063-07</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>Dumont # 5/45 pinça</td><td>FST, Alemanha</td><td>11251-35</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>Tesoura de íris fina</td><td>FST, Alemanha</td><td>14060-09</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur ponta curva</td><td>FST, Alemanha</td><td>16221-14</td><td>Ferramenta cirúrgica</td></tr><tr><td>Esponja de gelatina absorvível Gelfoam</td><td>Pfizer, EUA</td><td>0315-08</td><td>Esponja de gelatina hemostática</td></tr><tr><td>Nanoinjeção capilar de vidro</td><td>Neurostar, Alemanha</td><td>n/a</td><td>Para injeção de vetor de vírus</td></tr><tr><td>Graefe Fórceps com ponta serrilhada</td><td>FST, Alemanha</td><td>11052-10</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>Haste de implantação</td><td>Inscopix, EUA</td><td>n/a</td><td>Faz parte do sistema nVoke2. Ele foi projetado para microscpe miniatura nVoke2 e a lente GRIN pode ser montada nele</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, Reino Unido</td><td>n / a</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>KETALAR PARA INJEÇÃO INTRAMUSCULAR</td><td>Daiichi Sankyo, Japão</td><td>n / a</td><td>Cetamina</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, EUA</td><td></td><td>Tecido de limpeza</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta baseado em laser</td><td>Instrumento Sutter, EUA</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Beveler</td><td>Sutter Instrument, EUA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Estereotáxico Motorizado baseado em Kopf, Modelo 900</td><td>Neurostar, Alemanha</td><td>n/a</td><td>Quadro estereotáxico</td></tr><tr><td>mouseOxPlus com sensor de temperatura retal e oxímetro de pulso de braçadeira de coxa</td><td>Starr Life Sciences, PA, EUA</td><td>MouseOxPlus</td><td>Mede a frequência cardíaca animal, a saturação arterial de oxigênio (SpO2), a frequência respiratória e a temperatura</td></tr><tr><td>nVoke2 integrarted Sistema de micro câmera de imagem de cálcio</td><td>Inscopix, EUA</td><td>1000-003026</td><td>Microscópio miniatura</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, EUA</td><td>CS 200</td><td>Escala usada para pesar animais</td></tr><tr><td>Otsuka Normal Salino</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Japão</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de controlador de temperatura fisiológico-biológico</td><td>SuperTech Instruments, Hungria</td><td>TMP-5b</td><td>Almofada térmica para mouse</td></tr><tr><td>ProView Lens Probe 1.0 mm de diâmetro, 9.0 mm de comprimento</td><td>Inscopix, USA</td><td>1050-002214</td><td>Lente de índice de refração gradiente (GRIN)</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP capilares de vidro</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>112017</td><td>Personalizado&nbsp; capilares de vidro de quartzo</td></tr><tr><td>Cateter IV de Segurança 20G</td><td>B. Braun, Alemanha</td><td>4251652-03</td><td>cateter de 20 gauage usado para preparar tubo</td></tr> <tr>de intubação<td>Lixa</td><td>ESCO, Japão</td><td>EA366MC</td><td>Usado para polir a ponta da agulha 25G para preparar agulha curva e romba</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi</td><td>Muromachi Kikai, Japão</td><td>10010-00</td><td>Usado para cortar a ponta da pipeta de vidro de quartzo</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia por inalação de baixo fluxo SomnoSuite</td><td>Kent Scientific, EUA</td><td>SOMNO</td><td>Fornece controle preciso do fluxo de isoflurano</td></tr><tr><td>Broca Surgic XT Plus NSK</td><td></td><td>Y1002774</td><td>Para injeção de vetor de vírus</td></tr><tr><td>Seringa 1 ml</td><td>Terumo, Japão</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Seringa agulha 25G</td><td>Top, Japão</td><td>00819</td><td>Usada para fazer agulha romba e dobrada</td></tr><tr><td>Seringa agulha 26G</td><td>Terumo, Japão</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Aparador Profissional</td><td>Thrive, Japão</td><td>n/a</td><td>Barbeador</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; tesoura de mola bingen</td><td>FST, Alemanha</td><td>15004-08</td><td>Ferramenta de cirurgia</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Hayashi Pure Chemical, Japão</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet pele sensível</td><td>Veet, Canadá</td><td>n/a</td><td>Creme de depilação</td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td><td>Aspen Japan,&nbsp; Japão</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

A azeitona inferior (IO), um núcleo na medula ventral, é a única fonte de fibras de escalada que formam uma das duas vias de entrada que entram no cerebelo. A IO tem sido proposta há muito tempo como crucial para o controle motor e sua atividade é atualmente considerada o centro de muitas hipóteses das funções motoras e cognitivas do cerebelo. Embora sua fisiologia e função tenham sido relativamente bem estudadas em nível unicelular in vitro,atualmente não há relatos sobre a organização da atividade da rede IO em animais vivos. Isso se deve, em grande parte, à localização anatômica extremamente desafiadora do IO, dificultando o subjetivo de métodos convencionais de imagem fluorescente, onde um caminho óptico deve ser criado através de todo o cérebro localizado dorsalmente para a região de interesse.
Aqui descrevemos um método alternativo para obter dados de imagem de cálcio de nível de última geração da rede IO. O método aproveita a localização ventral extrema do IO e envolve um procedimento cirúrgico para inserir uma lente de índice gradiente-refrativo (GRIN) através das vísceras do pescoço para entrar em contato com a superfície ventral do sensor de cálcio GCaMP6s-expressando IO em camundongos anestesiados. Um registro representativo de imagem de cálcio é mostrado para demonstrar a viabilidade de registrar a atividade do neurônio IO após a cirurgia. Embora esta seja uma cirurgia de não sobrevivência e as gravações devem ser conduzidas sob anestesia, evita danos aos núcleos do tronco cerebral críticos da vida e permite a realização de grande variedade de experimentos investigando padrões de atividade espacial e integração de entradas no IO. Este procedimento com modificações poderia ser usado para gravações em outras regiões adjacentes do tronco cerebral ventral.

Aqui apresentamos uma gravação representativa obtida com o método descrito. A Figura 6a mostra a localização de células IO brilhantemente rotuladas visualizadas durante o experimento. As listras diagonais escuras são vasos sanguíneos. Observe o brilho variável das células individuais, resultante da eficácia variável da transfecção. No painel Figura 6b mostramos os traços de intensidade de fluorescência normalizada (deltaF/F) obtidos a partir da somata indicada com cores e números no painel a. As deflexões ascendentes representam aumentos transitórios no cálcio intracelular. Observe como diferentes níveis de expressão GCaMP6s (refletido no brilho celular no painel a) levam a proporções variáveis de sinal para ruído (SNR).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Figura 6: Registro de exemplo de atividade de neurônios IO em camundongos anestesiados. (a) Quadro de exemplo representativo de uma gravação após filtragem espacial. Pontos brilhantes são somata neuronal IO, vários dos quais foram indicados como regiões de interesses (ROIs, números coloridos). Listras escuras são vasos sanguíneos. (b) Exemplo de traços deltaF/F obtidos a partir dos ROIs indicados no painel a. Deflexões para cima refletem aumentos no sinal de cálcio. Barra de escala em a=10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para expor o tronco cerebral do rato adulto do lado ventral. Usando uma lente de índice gradiente-refrativo com um microscópio em miniatura, a imagem de cálcio pode ser usada para examinar a atividade de somata neural inferior de oliva in vivo.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

A azeitona inferior é a parte mais ventral da medula, e assim é extremamente difícil de alcançar em um animal vivo. Aqui, introduzimos um protocolo para expor o cérebro de camundongo adulto do lado ventral, e usamos lentes GRIN para registrar atividade neuronal nos neurônios inferiores de oliva expressando sensores de cálcio. Este método evita danos ao tronco cerebral crítico da vida, e permite investigações sobre padrões de atividade espaço-temporal e integração de entrada na azeitona inferior.Uma vez que a operação é realizada na complexa região da garganta com muitas estruturas vitais, é essencial que seja conduzida por um pesquisador com habilidades cirúrgicas de alto nível. Prepare um tubo de intubação cortando uma fenda de 5 a 6 milímetros de comprimento e 0,8 milímetros de largura da ponta de um cateter de 20 bitolas. Prepare uma agulha cega e curva cortando a ponta, lixe a superfície da fratura e dobre-a com o plier.Isso será usado para apoiar uma traqueia durante a traqueotomia. Diluir 15 miligramas por cetamina mililitro com soro fisiológico a 15% Montar ferramentas cirúrgicas e consumíveis. Coloque a almofada de aquecimento a 38 graus Celsius.Gire o nariz 180 graus horizontalmente em quadro estereotaxic. Pesar o rato cuja azeitona inferior foi previamente transfeminada por GCaMP6s portadores de vírus, e calcular a quantidade de cetamina diluída para injeção. Caixa de indução de pré-preenchimento com isoflurane de 5%, e anestesiar o mouse.Monte o mouse na estrutura estereotaxic, lado ventral para cima. Raspe a garganta do rato e a área da coxa. Remova o cabelo residual com creme de depilação.Aplique geleia de xilocaine na pele da garganta. Monitore a temperatura do mouse com um sensor térmico retal. Injete um mililitro pré-aquecido intraperitonel.Avalie a profundidade da anestesia com forte aperto nos dedos do pé traseiro. Nenhuma resposta detectável deve ser evocada. Faça uma incisão vertical na pele da garganta ao longo da linha média.Separe a pele do pescoço das vísceras sob ela usando o método de dissecção sem corte e corte a pele. Glândulas salivares livres do tecido conjuntivo, e invertê-las lateralmente para expor a traqueia coberta de músculo estetoide. Injete intraperitoneal a primeira dose de cetamina diluída a cinco mililitros por quilograma de peso animal.Divida cuidadosamente o músculo estetireóide ao longo da linha média com a ponta de um fórceps fino para expor a traqueia. Desprender traqueia de vasos sanguíneos e esôfago com fórceps usando método de dissecção contundente. Injete uma segunda dose de cetamina diluída a 2,5 mililitros por quilograma de peso animal.Insira uma agulha sem cortes sob traqueia. Levante a traqueia com a agulha cega. Faça o fio de sutura dar a volta no terceiro anel de traqueia, caudal a glândula tireoide, com uma agulha de meio círculo.Faça quatro laços de instrumentos neste anel. Fure a pele do peito com a mesma agulha de meio círculo e conduza a linha através da pele. Levante suavemente a traqueia com o fio, e corte a traquea caudal na glândula tireoide.Puxe a traqueia em direção à pele do peito. Levante a abertura da traqueia adicionando um pequeno pedaço de esponja cirúrgica sob ela. Remova qualquer líquido restante dentro da ponta de abertura da traqueia com uma fina tira de tecido de limpeza.Troque o fluxo isoflurane do nariz estereotaxico para o tubo de intubação. Insira o tubo de intubação na traqueia. Certifique-se de que parte da fenda no tubo permaneça fora da traqueia para permitir a respiração.Fixar a traqueia na pele do peito do rato fazendo de três a quatro laços de instrumento. Amarre a traqueia com a rosca de sutura para fixar o tubo de intubação. Corte o músculo estetoide ao longo das fibras musculares com os fórceps finos.Corte a parte isolada com a tesoura de mola. Livre cuidadosamente as sobras de traqueia e laringe do músculo para minimizar os danos nos vasos sanguíneos no músculo. Remova as sobras de traqueia e laringe.Livre do esôfago do tecido conectado com fórceps e corte-o com uma tesoura de mola. Remova o músculo longitudinal que cobre o tronco cerebral e o arco ventral do atlas. Remova o músculo que cobre o arco ventral atlas e o tubérculo anterior.Corte os arcos ventral do atlas com o rongeur. Remova o tubérculo anterior do atlas. Remova o sangue e o fluido para ver o forame magnum e o tronco cerebral.Expanda o foramen magnum removendo o osso occipital com o rongeur. Remova a cartilagem e descasque cuidadosamente a camada periosteal da dura-maternidade com as fórceps finas para ter uma visão clara do tronco cerebral ventral. Aperte o sensor SpO2 na coxa do mouse para monitorar sinais vitais como frequência cardíaca, saturação de oxigênio e taxa de respiração.Monte a lente GRIN na haste de implantação. Limpe a lente cuidadosamente com tecido de limpeza 70% encharcado de etanol. Fixar a haste de implantação na estrutura estereotaxic e montar o microscópio em miniatura na haste de implantação.Adicione várias gotas de soro fisiológico na área do tronco cerebral para imersão das lentes GRIN. Aproxime-se do tronco cerebral com a lente GRIN. GCaMP6s expressando neurônios de oliva inferiores na área superficial podem ser encontrados em uma região em forma de retângulo, cerca de 0,5 a 1,7 milímetros rostral para o atlas restante, e cerca de 2,6 a 1,1 milímetros lateral para a linha média.Ligue o LED azul excitação em microscópio em miniatura para localizar neurônios de oliva inferiores transfectados GCaMP6s. Os neurônios mostram diferentes intensidades de fluorescência de linha de base devido a vários níveis de expressão GCaMP6s. A mudança do nível de cálcio do neurônio de oliva inferior circulado somata no vídeo à esquerda nos mostrará delta F dividido por traços F à direita.Embora o rato seja mantido aquecido e hidratado, ele inevitavelmente será enfraquecido por anestesia prolongada e cirurgia. É essencial manter a duração da cirurgia curta para que a condição física do rato seja boa para a gravação. Um pesquisador qualificado pode terminar a cirurgia em 70 minutos.Este método, com modificações, pode ser usado para estudar outras regiões adjacentes do tronco cerebral ventral.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Fonte: Shannonhouse, J., et al. In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios da raiz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). O vídeo demonstra uma técnica de imagem de cálcio in vivo para monitorar a atividade neuronal nos gânglios da raiz dorsal (DRG) de um camundongo transgênico. Os neurônios DRG expressam um indicador de cálcio que aumenta a intensidade da fluorescência ao se ligar ao cálcio. Estímulos mecânicos ou térmicos aplicados a...

Imagem de cálcio in vivo de conjuntos neuronais nos gânglios intactos da raiz dorsal de um camundongo

Fonte: Lee, H. et. al., Imagem de cálcio in vivo bem-sucedida com um microscópio miniaturizado montado na cabeça na amígdala de um camundongo que se comporta livremente. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra imagens de cálcio in vivo em um camundongo usando um índice de refração gradiente, ou lente GRIN, e um microscópio miniaturizado. A configuração combina a fixação da cabeça dentro de um sistema de gaiola móvel sem atrito, estimulando os neurônios e desencadeando o influxo de íons de...

Imagem microendoscópica de cálcio em tempo real em um camundongo que se move livremente

Este protocolo apresenta etapas para adquirir e analisar imagens fluorescentes de cálcio de pericytes e dados de fluxo sanguíneo de vasos sanguíneos próximos em camundongos anestesiados. Essas técnicas são úteis para estudos de fisiologia celular mural e podem ser adaptadas para investigar transitórios de cálcio em qualquer tipo de célula.

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

O giro dentado do hipocampo desempenha funções essenciais e distintas na aprendizagem e na memória. Este protocolo descreve um conjunto de procedimentos robustos e eficientes para imagens de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado em camundongos em movimento livre.

Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos 

Este protocolo detalha a imagem in vivo de cálcio de neurônios hipotalâmicos usando um microscópio miniaturizado (miniscópio) em camundongos que se comportam livremente durante manipulação do estado social (isolamento social e reunião social). Esse método permite a imagem, com resolução de neurônio único, da atividade hipotálmica que representa necessidade social e saciedade social, possibilitando estudos mecanicistas da homeostase social.

In Vivo Imagem de Cálcio com Microscópio Miniaturizado no Hipotálamo para Compreensão de Comportamentos Sociais em Camundongos

Aprenda a realizar imagem de cálcio in vivo no olivo inferior de camundongos adultos usando lentes GRIN. Este protocolo cirúrgico minimamente invasivo permite monitorar atividade neuronal em tempo real sem danificar estruturas vitais do tronco encefálico.

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

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