Name: Um método para preservar raízes úmidas e rizosferas para imagem elementar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda um método de congelamento por impacto e liofilização para preservar raízes úmidas e rizosferas de plantas aquáticas. Esta técnica permite a imagem elementar de alta resolução, mantendo a estrutura e especiação química in situ para estudos de ciclagem de nutrientes.

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Os autores reconhecem uma concessão conjunta de sementes a Seyfferth e Tappero para apoiar a colaboração entre a Universidade de Delaware e o Laboratório Nacional brookhaven. Partes desta pesquisa utilizaram a linha de luz XFM (4-BM) da Fonte Nacional de Luz Síncrotron II, um Escritório de Recursos do Usuário do Departamento de Energia dos EUA (DOE) operado para o DoE Office of Science pelo Laboratório Nacional brookhaven sob o contrato nº. DE-SC0012704.

1. Preparação de equipamentos de congelamento de slam
<ol><li>Coloque dois blocos de cobre (~5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontalmente dentro de um refrigerador limpo capaz de segurar nitrogênio líquido e despeje nitrogênio líquido suficiente para submergir os blocos. Uma vez que o borbulhante diminua, coloque dois espaçadores em cima de um bloco de cobre em cada extremidade. NOTA: A altura do espaçador determina a altura da amostra a ser congelada; este exemplo usa um espaçador de 2 cm para criar cubos de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm. O volume do nitrogênio líquido dependerá do tamanho do refrigerador. Este exemplo usa aproximadamente 1 L para aproximadamente 5 cubos em série. ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual adequados e ventilação, pois o nitrogênio líquido é um criogeno e um asfixiante.</li>
	<li>Usando pinças e luvas criogênicas, levante-se o outro bloco de cobre em sua extremidade, para facilitar a recuperação quando a amostra estiver no lugar.</li>
</ol>2. Coleta de amostras e slam-freezing
<ol><li>Extrair a planta desejada e a rizosfera do solo molhado usando uma pá e garantir que o buraco cavado seja muito maior do que o volume de raiz desejado. Coloque o solo e plante em um recipiente e coloque-o em um banco. NOTA: Todo o solo em vasos e a planta de um estudo de vaso também podem ser usados.</li>
	<li>Determine a localização desejada do solo onde as raízes devem ser tomadas (ou seja, profundidade e proximidade com a filmagem). Corte o excesso de solo usando uma lâmina de aço, tomando cuidado para não perturbar o solo na área desejada. Quando a área desejada for atingida, corte um "cubo" raiz de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm e coloque imediatamente o cubo entre os dois espaçadores no bloco de cobre horizontal. Usando luvas criogênicas, pegue o bloco de cobre vertical e coloque-o em cima dos espaçadores para congelar o cubo de rizosfera.</li>
	<li>Depois de borbulhar subsídios (~5 min), recupere o cubo de rizosfera congelado dos blocos de cobre e enrole dentro de um quadrado de folha de alumínio pré-rotulado. Marque a orientação do bloco na folha, se desejar. Coloque em um segundo recipiente de nitrogênio líquido até o armazenamento em um congelador de -80 °C.</li>
	<li>Repita conforme necessário para obter o número desejado de cubos radiculares do local de campo ou do experimento. Certifique-se de que ambos os blocos de cobre têm tempo para esfriar entre as amostras.</li>
</ol>3. Congelar e incorporar cubos de rizosfera
<ol><li>Prepare a secadora de congelamento de acordo com as instruções do fabricante. Tenha cuidado para garantir que tenha obtido a pressão e temperatura adequadas do vácuo antes de remover amostras do congelador de -80 °C.</li>
	<li>Quando o secador congelado estiver pronto para receber amostras, coloque um cubo de rizosfera congelado dentro de um tubo limpo e lavado com ácido de 50 mL e cubra livremente com um lenço descartável limpo. Segure o lenço com um elástico. Repita conforme necessário para garantir um cubo por tubo. NOTA: Se a amostra for muito grande para um tubo, ela pode ser colocada diretamente no recipiente de secador congelado usando a folha de alumínio como porta-amostras.</li>
	<li>Coloque tubos contendo amostras em recipientes de secador congelado e congele por vários dias. O tempo exato de secagem dependerá das propriedades do solo. NOTA: Armazene amostras secas no secador congelado ou em um desiccador para evitar a reidratação.</li>
	<li>Use uma lâmina de aço para cortar cubos de solo secos ao tamanho para que eles se encaixem na forma desejada (por exemplo, a forma de 25 mm de diâmetro é ideal para a maioria das aplicações). Rotule cada forma, coloque os cubos de solo nas formas e coloque as formas dentro de um dessecador de vácuo.</li>
	<li>Prepare o epóxi de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que o epóxi escolhido não esteja contaminado e não cause alterações de especiação dos elementos desejados 20,29,30.</li>
	<li>Use um conta-gotas para adicionar epóxi à forma de um lado do solo, até cobrir inteiramente a amostra. O solo escurecerá de cor enquanto o epóxi molha o solo. NOTA: Adicione o epóxi lentamente para permitir que o ar no solo escape.</li>
	<li>Uma vez preenchidos formulários com epóxi, feche o desiccador de vácuo e ligue o vácuo. Dependendo da quantidade de ar presa no solo, mais epóxi pode precisar ser adicionado aos formulários periodicamente. Verifique o nível de epóxi a cada 30-90 min para as primeiras 1-4 h e adicione epóxi conforme necessário.</li>
	<li>Remova a amostra do formulário uma vez que o epóxi tenha endurecido (~5 dias).</li>
</ol>4. Cortar e seccionar os cubos da rizosfera
<ol><li>Corte a amostra usando uma serra molhada de precisão de lâmina de diamante. Corte as amostras em diferentes locais se não forem obtidas raízes no corte anterior.</li>
	<li>Lixe manualmente as amostras cortadas com lixa progressivamente mais fina (por exemplo, 220, 500, 1000 e 1500 grãos) no lado cortado para ~30 s.</li>
	<li>Realizar imagens superficiais das amostras utilizando técnicas como LA-ICP-MS. NOTA: Para preparar seções finas para S-XRF, envie as amostras para uma empresa capaz de preparar as seções finas (polimento lateral único ou duplo) ou siga os passos 4.4 - 4.6 conforme descrito abaixo.</li>
	<li>Cole o lado da amostra desejado em um slide de quartzo usando super cola e deixe curar durante a noite.</li>
	<li>Usando uma máquina de secção fina, corte o solo em lâminas até 2 mm de espessura e, em seguida, triture até a espessura desejada (tipicamente 30 μm). A superfície da amostra pode ser polida se desejar.</li>
	<li>Realize imagens S-XRF das seções. Siga as etapas apropriadas na instalação síncrotron desejada e na linha de feixe para solicitar e utilizar o tempo de imagem.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um protocolo para obter solo a granel preservado + rizosferas de raízes vegetais úmidas usando uma técnica de congelamento de slam que pode ser usada para mapeamento de imagens elementares e/ou especiação química.
Existem vários benefícios deste método em relação aos métodos existentes. Em primeiro lugar, este método permite a investigação simultânea das raízes e das rizoferas circundantes. Atualmente existem métodos para preservar e quimicamente as raízes de seu ambiente ...

As raízes e suas rizosferas são dinâmicas, heterogêneas e criticamente importantes para entender como as plantas obtêm nutrientes minerais e contaminantes1,2,3. As raízes são o caminho primário pelo qual nutrientes (por exemplo, fósforo) e contaminantes (por exemplo, arsênico) se movem do solo para as plantas e, assim, entender esse processo tem implicações para quantidade e qualidade dos alimentos, funcionamento do ecossistema e fitromediação. No entanto, as raízes são dinâmicas no espaço e no tempo crescendo em resposta às necessidades de aquisição de nutrientes e muitas vezes variam em função, diâmetro e estrutura (por exemplo, raízes laterais, raízes aventurárias, cabelos radiculares)2. A heterogeneidade dos sistemas radiculares pode ser estudada em escalas espaciais, do celular ao nível do ecossistema e em escalas temporais, de hora em hora para decadal. Assim, a natureza dinâmica e heterogênea das raízes e seu solo circundante, ou rizosfera, coloca desafios para capturar a química da rizosfera ao longo do tempo. Apesar desse desafio, é imprescindível estudar raízes em seu ambiente de solo para caracterizar essa relação crítica entre plantas e solo.
A química da rizosfera das plantas úmidas é particularmente desafiadora de investigar por causa de gradientes de oxigênio íngremes que existem do solo a granel para as raízes, que mudam no espaço e no tempo. Como as raízes precisam de oxigênio para respirar, as plantas úmidas adaptaram-se às baixas condições de oxigênio dos solos pantanosos, criando o aerenchyma4,5. Aerenchyma são tecidos cortical ocos que se estendem de brotos até raízes, permitindo a difusão do ar através da planta para as raízes. No entanto, parte desse ar vaza para a rizosfera em partes menos suberizadas das raízes particularmente perto de junções laterais radiculares, pontas radiculares menos maduras e zonas de alongamento6,7,8,9. Essa perda de oxigênio radial cria uma zona oxidada na rizofera das plantas úmidas que afeta a rizosfera (bio-geo)química e é distinta do solo a granel reduzido10,11,12. Para entender o destino e o transporte de nutrientes e contaminantes em rizosferas e raízes úmidas, é fundamental preservar o solo a granel quimicamente reduzido, a rizosfera oxidada e raízes de plantas úmidas para análise. No entanto, como o solo a granel contém constituintes reduzidos do solo que são sensíveis ao oxigênio, os métodos de preservação das raízes e do solo devem preservar estruturas radiculares e minimizar as reações sensíveis ao oxigênio.
Existem métodos para fixar tecidos vegetais e preservar a ultraestrutura para imagem, mas esses métodos não podem ser aplicados para preservar quimicamente raízes que crescem em solo pantanoso. Para investigações onde apenas a distribuição elementar dentro das células vegetais é desejada, as plantas são tipicamente cultivadas hidroponicamente e as raízes podem ser facilmente removidas da solução, fixadas sob substituição de congelamento e congelamento de alta pressão e seccionadas para uma variedade de aplicações de imagem, incluindo espectrometria de massa de íons secundários de alta resolução (nanoSIMS), microscopia eletrônica e análise de fluorescência de raios-X síncrotrons (S-XRF)análise 13, 14,15. Para investigar a placa fe na parte externa das raízes úmidas, esses estudos hidropônicos devem induzir artificialmente a formação de placas fe na solução16, que não representa com precisão a heterogeneidade da distribuição e composição mineral da formação da placa fe e elementos associados no situ17,18,19,20. Existem métodos para preservar o solo pantanoso e microrganismos associados com congelamento21,mas é difícil obter raízes com essa técnica. Os métodos atuais para visualizar raízes crescendo no solo e sua química rizosférica consistem em dois tipos de medição primária: fluxos elementares e concentração elementar total (e especiação). O primeiro é tipicamente medido usando gradientes difusivos em filmes finos (DGT)22,23,24, em que o solo é colocado em rizoboxes para apoiar o crescimento da planta em um ambiente de laboratório e elementos labile no solo difusos através de um gel em uma camada de ligação. Esta camada de ligação pode então ser imageda para quantificar os elementos labil de interesse. Esta técnica pode ilustrar com sucesso as relações entre raízes e a rizosfera24,25,26,27, mas artefatos de limitação de raízes podem existir cultivando plantas em rizoboxes, e informações sobre o interior da raiz não são capturadas com DGT. Este último envolve a amostragem das raízes e da rizosfera, preservando a amostra e analisando diretamente a distribuição elementar em uma seção amostral. Para esta amostragem ambiental das raízes das plantas úmidas e sua rizosfera circundante, é necessário um manuseio cuidadoso de amostras para evitar artefatos da preparação da amostra.
Aqui é descrito um protocolo que preserva efetivamente estruturas radiculares e química da rizofera de plantas úmidas por meio do congelamento e congelamento da secagem. O congelamento de flash pode retardar drasticamente as transformações de solutos sensíveis ao oxigênio, mas pode danificar raízes e causar mobilização quando as amostras secam. No entanto, o congelamento de slam onde a amostra é congelada entre blocos de cobre pré-resfriados com nitrogênio líquido minimiza danos radiculares e distorção amostral28. As amostras preservadas são então incorporadas em uma resina epóxi que preserva como especiação20,29 e pode ser cortada e polida para imagens de raízes dentro de seu solo rizosfera. As amostras deste relatório foram analisadas por imagem de especiação química S-XRF após secção fina. No entanto, outras técnicas de imagem também poderiam ser usadas, incluindo espectrometria de massa de plasma acoplada indutivamente a laser (LA-ICP-MS), emissão de raios-X induzida por partículas (PIXE), espectrometria de massa de íons secundário (SIMS) e imagem de espectroscopia induzida por laser (LIBS).

<table><tbody><tr><td>Blocos de cobre</td><td>McMaster Carr</td><td>89275K42</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de diamante</td><td>Buehler</td><td>15 LC, 102 mm x 0,3 mm</td> velocidade <td>de operação: 225 rpm</td></tr><tr><td>Formas epóxi</td><td>Struers</td><td>40300085</td><td>FixiForm</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Epotek</td><td>301-2FL</td><td></td></tr><tr><td>Supercola</td><td>Loctite</td><td>404</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de corte fino</td><td>Buehler</td><td>Serra úmida PetroThin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Buehler</td><td>IsoMet 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

um método para preservar raízes úmidas e rizosferas para imagem elementar

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

As raízes interagem extensivamente com seu ambiente de solo, mas visualizar tais interações entre raízes e a rizosfera circundante é um desafio. A química da rizosfera das plantas úmidas é particularmente desafiadora de capturar por causa de gradientes de oxigênio íngremes das raízes para o solo a granel. Aqui é descrito um protocolo que preserva efetivamente a estrutura radicular e a química da rizofera de plantas úmidas através do congelamento de slam e secagem congelante. O congelamento de slam, onde a amostra é congelada entre blocos de cobre pré-resfriados com nitrogênio líquido, minimiza danos radiculares e distorção amostral que pode ocorrer com o congelamento de flash, minimizando ainda as alterações de especiação química. Embora a distorção da amostra ainda seja possível, a capacidade de obter várias amostras rapidamente e com custo mínimo aumenta o potencial de obter amostras satisfatórias e otimiza o tempo de imagem. Os dados mostram que este método é bem sucedido na preservação de espécies reduzidas de arsênico em raízes de arroz e rizosferas associadas a placas de ferro. Este método pode ser adotado para estudos de relações entre plantas e solo em uma ampla variedade de ambientes pantanosos que abrangem a concentração que abrange desde o ciclismo de elementos até aplicações de fitoremediação.

Este método permite a preservação de raízes e espécies químicas nas raízes e rizosfera das plantas úmidas e no solo a granel. Neste trabalho, o método foi utilizado para avaliar como especiação e co-localização com óxidos fe e mn e nutrientes vegetais na rizosfera do arroz(Oryza sativa L.). O arroz foi cultivado na Instalação RICE da Universidade de Delaware, onde 30 mesocosmos de arroz (2 m x 2 m, 49 plantas cada) são usados para cultivar arroz sob várias condições de manejo do solo e da água com o objetivo de ...

Descrevemos um protocolo para amostrar, preservar e seção de raízes intactas e o solo circundante da rizosfera de ambientes pantanosos usando arroz(Oryza sativa L.) como espécie modelo. Uma vez preservada, a amostra pode ser analisada utilizando técnicas de imagem elementar, como a fluorescência química de raios-X síncrotron (XRF).

Um método para preservar raízes úmidas e rizosferas para imagem elementar

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Este método fornece aos pesquisadores uma nova maneira de preparar raízes de plantas aquáticas, a rizosfera circundante e o solo em massa para técnicas de imagem elementar. A principal vantagem deste método é que ele é relativamente rápido e acessível, ao mesmo tempo em que preserva com precisão a distribuição e especiação de elementos de interesse. Essa técnica pode ser usada para responder a perguntas sobre muitos elementos e sistemas vegetais, desde nutrientes em sistemas agrícolas até o destino e transporte de contaminantes em sistemas de fettermiation.Certifique-se de trabalhar rapidamente e, ao mesmo tempo, esteja atento à área desejada ou áreas do sistema radicular para amostragem. E pegue várias amostras por sistema radicular. Para preparar o equipamento de congelamento de slam para um experimento, coloque dois, cinco por cinco por 15 centímetros blocos de cobre horizontalmente em um refrigerador limpo capaz de segurar nitrogênio líquido.E usando o EPI apropriado, despeje nitrogênio líquido suficiente no refrigerador para submergir os blocos. Uma vez que o borbulhante diminua, coloque um espaçador em cada extremidade de um bloco de cobre. Em seguida, usando pinças e luvas criogênicas, coloque o outro blog de cobre em sua extremidade para facilitar a recuperação quando a amostra estiver no lugar.Para coletar a amostra, use uma planta de vasos ou use uma pá para começar a extrair a planta desejada e a rizosfera do solo molhado, cuidando que o buraco cavado seja muito maior do que o volume raiz desejado. Use uma lâmina de aço para cortar qualquer excesso de solo, tomando cuidado para não perturbar o solo dentro da área desejada. Quando as áreas desejadas atingirem, corte um cubo raiz de aproximadamente três por três por dois centímetros, e imediatamente coloque o cubo entre os dois espaçadores no bloco de cobre horizontal.Para um congelamento da amostra, usei as luvas criogênicas para colocar o bloco de cobre vertical nos espaçadores por cerca de cinco minutos. Quando o borbulhante diminuir, transfira a amostra do cubo de rizosfera congelado em um pedaço de quadrado de papel alumínio pré-rotulado. Para congelar os cubos do solo, quando o secador congelado atingir a pressão e temperatura adequada do vácuo, coloque uma amostra de cubo de rizosfera congelada para limpar e ácido lavado tubo de 50 mililitros ou diretamente no secador congelado e use um lenço descartável limpo para evitar que o pó entre na bomba de vácuo.Coloque as amostras no recipiente de secador congelado por pelo menos alguns dias até secar. Quando os tecidos tiverem sido congelados, use uma lâmina de aço para secar cubos de solo em um tamanho apropriado para a análise antes de colocar os cubos em formas rotuladas dentro de um dessecador de vácuo. Depois de preparar o epóxi de acordo com as instruções do fabricante, use um conta-gotas para adicionar lentamente epóxi à forma de um lado do solo, até que o epóxi cubra inteiramente a amostra.O solo escurecerá de cor enquanto o epóxi molha o solo. Uma vez que os formulários estejam cheios de epóxi, feche o desiccador e ligue o vácuo. Verifique o nível de um epóxi a cada 30 a 90 minutos durante a primeira de uma a quatro horas, adicionando epóxi adicional, se necessário.Uma vez que o epóxi tenha endurecido, remova a amostra. Após a incorporação, use uma serra molhada de precisão de lâmina de diamante para cortar a amostra. Corte a amostra em uma direção diferente se não forem obtidas raízes no corte anterior.Após o corte, escoe manualmente o lado cortado de cada amostra com lixa progressivamente mais fina por 30 segundos por tamanho de grão. Nesta figura, vários diâmetros radiculares podem ser observados dentro da matriz do solo como seções transversais. As raízes podem demonstrar diferentes níveis de qualidade.Por exemplo, nesta imagem, uma raiz bem preservada, uma raiz distorcida pelo processo de secagem congelante e uma raiz que foi puxada para fora durante o processo de secção fina podem ser observadas. A análise desta seção transversa raiz com uma raiz lateral na seção longitudinal por imagens de fluorescência de raios-X síncrotrons como demonstrado permite a detecção de ferro, manganês e arsênico. A presença de ferro dentro do solo e ao redor da raiz na placa de ferro também é visível nas imagens de micrografo de luz.O manganês está presente exclusivamente dentro do córtex da raiz lateral, mas também co-localiza com ferro em algumas áreas dentro da placa de ferro como uma tonalidade verde-azul. Arsênico é encontrado principalmente dentro da vasculatura da raiz lateral mesclando-se à vasculatura da raiz primária. A especiação química revela uma variabilidade na localização da espécie arsênico.Como observado neste enredo tricolor, a glutona arsenita e arsenita estão intimamente associadas na vasculatura, enquanto o arsenato localiza principalmente dentro do exterior da raiz, associado à placa de ferro. Antes da coleta da amostra, determine a parte desejada do sistema radicular para imagens elementares. Isso ditará a orientação de localização da chave raiz removida.Seguindo este protocolo, as amostras podem ser imagens em escala de míccro ou mais grosseiras usando uma variedade de técnicas, dependendo das questões específicas de pesquisa, elementos de interesse ou instrumentação disponíveis.

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Ambiente

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