Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Este protocolo permite o isolamento eficiente e a cultura das células RPE do mouse. Culturas de RPE de camundongos primários saudáveis são modelos valiosos para entender os mecanismos das doenças oculares subjacentes. Culturas de RPE confluentes e viáveis obtêm dentro de três dias e podem ser cultivadas por semanas.

Este protocolo tem sido usado com sucesso para compreender os mecanismos subjacentes à degeneração macular relacionada à idade precoce, que é a principal causa de cegueira entre os idosos nos países desenvolvidos. É importante visualizar as etapas de dissecção. Os detalhes são fundamentais para o sucesso do protocolo, por exemplo, como lidar com os globos oculares para que a esclera não seja perfurada, onde exatamente os cortes devem ser realizados, e como incorporar os copos oculares na trippsina para que fiquem abertos.

Comece com a preparação de todos os reagentes necessários para o protocolo. Em seguida, comece a limpar o globo ocular removendo cuidadosamente todo o tecido conjuntivo, sangue e músculos, usando Dumont número cinco fórceps e tesouras angulares, sem fazer nenhum corte na esclera. Transfira o globo ocular para um prato fresco contendo três mililitros de tampão HBSS sem HEPES regularmente para manter os olhos frescos e limpos e evitar qualquer contaminação.

Use o nervo óptico como alça para segurar o globo ocular e fazer um buraco no centro da córnea com uma lâmina de aço carbono afiada número 11. Faça três incisões na córnea através do orifício com dumont número cinco tesoura, garantindo que haja espaço suficiente para remover a lente. Segure o nervo óptico e aplique uma leve pressão na ora serrata com a base da tesoura angular, até que a lente saia completamente.

Mantenha o epitélio de íris intacto para evitar o descolamento da retina neural e do RPE durante a incubação. Coloque o olho no buffer HBSS sem HEPES. Incubar os olhos sem lentes na solução de hialuronidase a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora aerada de dióxido de carbono de 5% para desprender a retina neural do RPE.

Coloque cada olho em um novo poço com 1,5 mililitros de tampão HBSS HEPES frio por poço e incuba-o no gelo por 30 minutos. Após a lavagem, coloque cada olho em um prato de cultura de 35 milímetros com tampão HBSS HEPES fresco. Corte a córnea através das incisões originais com uma tesoura Vannas de oito centímetros até que a ora serrata seja atingida, depois corte abaixo da serrata de ora para remover o epitélio de íris e córnea.

Segure a serrata de ora com pinças curvas e usando micro fórceps angulares, puxe a retina neural, certificando-se de que a camada RPE não seja cortada. Em seguida, corte o apego interno ao nervo óptico. Corte o nervo óptico e transfira cada copo ocular para uma placa diferente de 12 poços contendo 1,5 mililitros de trippsina-EDTA fresca por poço.

Certifique-se de que os copos oculares permaneçam abertos e completamente submersos na trippsina. Incubar os copos oculares a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Colete cada copo de olho junto com quaisquer folhas de RPE destacadas durante a incubação de trippsina e transfira-as para uma placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de solução FBS por poço.

Se as folhas RPE permanecerem na solução trypsin, use uma micropipette para transferi-las para o poço com a solução FBS. Segure cada copo ocular pelo nervo óptico e agite-o de frente para baixo na placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de 20% FBS no tampão HBSS HEPES até que o descolamento completo das folhas RPE seja alcançado. Colete quaisquer folhas de RPE e clusters RPE com uma micropipette, evitando quaisquer pedaços brancos de esclera ou coroide, que possam contaminar as culturas, e coloque-as em um tubo de 15 mililitros.

Puxe dois olhos do mesmo rato em um tubo. Em seguida, centrifufique a mistura de RPE a 340 x g por dois minutos em temperatura ambiente e descarte o supernaspe. Resuspenque suavemente a pelota RPE em uma mistura de um mililitro de 0,25% trypsin-EDTA e incuba-a por um minuto em um banho de água a 37 graus Celsius para desagregar as folhas RPE em células únicas.

Em seguida, delicadamente pipeta para cima e para baixo 10 vezes, evitando a formação de bolhas. Adicione nove mililitros de meio RPE recém-preparado para diluir e inativar a trippsina e centrifugar a mistura a 340 x g por dois minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernascer e resuspenja cuidadosamente a pelota celular em 150 microliters de meio RPE com 5%FBS.

Em seguida, remova o PBS da câmara inferior da inserção de membrana revestida de laminina previamente preparada e adicione 700 microliters de meio RPE a ele. Remova a laminina da câmara superior da inserção da membrana e distribua a suspensão da célula RPE em termos de gota e uniformemente para o centro da câmara. Coloque a inserção da membrana intacta em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por pelo menos 24 horas.

Em seguida, verifique a inserção da membrana sob o microscópio para certificar-se de que a maioria das células RPE estão ligadas à inserção e a confluência é de pelo menos 50% Não mude a mídia durante as primeiras 72 horas. As células RPE isoladas usando este protocolo mostraram o tamanho típico de RPE, morfologia e pigmentação. Uma monocamada RPE altamente polarizada com dois núcleos unidos por junções apertadas, juntamente com a presença de microvilli apical e dobras basais, foi observada após uma semana.

A polarização da monocamada RPE foi confirmada pelos valores ter, com a média superior a 200 centímetros quadrados, que se manteve estável ao longo do tempo. Em ensaios de fagocitose realizados no FITC rotulados pos bovinos, observou-se engolfação e digestão de PDV, indicando formação de uma monocamada confluente funcional de células RPE. Culturas viáveis requerem pouco tempo de dissecção, o que é alcançado com experiência.

Algumas células RPE podem permanecer ligadas à retina neural, mas se várias folhas RPE permanecerem anexadas, o protocolo não terá sucesso. A hialuronidase fresca deve ser usada sempre para evitar este problema. Essas culturas funcionais de células RPE do rato primário são uma ferramenta valiosa para estudar a patobiologia do RPE em muitas doenças oculares.

Por exemplo, este protocolo possibilitou estudar a pathobiologia do RPE em um modelo de camundongo de degeneração macular.