Name: Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar células epiteliais de pigmento de retina primárias de rato. Este método produz monocamadas polarizadas e funcionais para estudar mecanismos de doenças oculares e testar terapias em modelos in vitro.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Genômica Ocular em Massachusetts Eye and Ear.

Foram seguidas as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
NOTA: Este método tem sido comprovado com sucesso com camundongos de diferentes origens genéticas, incluindo C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, e ratos albinos, em várias idades. Use preferencialmente camundongos de 8 a 12 semanas para obter células RPE. As células RPE de camundongos mais velhos proliferam menos na cultura e os camundongos mais jovens têm células cada vez menores, o que requer a junção de olhos de diferentes animais para ter culturas viáveis.
1. Preparação de reagentes e inserções de membrana
<ol><li>Prepare os seguintes reagentes.<ol>
<li>Prepare o HBSS-H− (HBSS sem cálcio, sem tampão de magnésio + 10 mM HEPES): Adicione 1 mL de 1 M HEPES a 99 mL de hbss- (sem Ca/Mg). Armazenar a 4 °C até 1 mês.</li>
		<li>Prepare o HBSS-H+ (HBSS com cálcio, com tampão de magnésio + 10 mM HEPES): Adicione 1 mL de 1 M HEPES a 99 mL de tampão HBSS+ (com Ca/Mg). Armazenar a 4 °C até 1 mês.</li>
		<li>Preparar solução de hialuronidase (1 mg/mL): Adicionar 10 mg de hialuronidase a 10 mL de HBSS-H e filfiliá-lo com um filtro de seringa estéril de 0,4 μm usando uma seringa de 10 mL. Prepare-se fresco antes de usar e deixe-o em temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).</li>
		<li>Prepare a solução FBS: Misture 20% de FBS com HBSS-H+. Adicione 2 mL de FBS a 8 mL de HBSS-H+. Prepare-se fresco antes do uso.</li>
		<li>Preparar o meio RPE: N1 Suplemento Médio 1/100 (v/v), glutamina 1/100 (v/v), penicilina-estreptomicina 1/100 (v/v) e solução de aminoácido não essencial 1/100 (v/v), hidrocortisona (20 μg/L), taurina (250 mg/L) e triiodo-thyronin (0,013 μg/L) em mem alfa + 5% FBS ou sem FBS1,23,24. Se desejar, o FBS pode ser inativado pelo calor; nenhuma diferença foi observada. Prepare-se fresco para o isolamento RPE. Para manutenção da cultura celular, armazene a 4 °C até 1 mês.</li>
		<li>Prepare trypsin-EDTA: Prepare pequenas alíquotas de uso único (~8 mL) de trypsin-EDTA fresco (0,25%) e congelá-los a -20 oC. Descongele-os no RT antes de cada uso. Evite ciclos de congelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as pastilhas de membrana (por exemplo, inserções Transwell).<ol>
<li>Equilibre as pastilhas de membrana de 6,5 mm com meio RPE por pelo menos 30 min a 37 °C, em uma incubadora de 5% de CO2-aeradas. Use uma inserção de membrana para células RPE de duas células de camundongos.</li>
		<li>Após a incubação, substitua o meio do compartimento inferior por 700 μL de PBS.</li>
		<li>Retire o meio do compartimento superior e cubra a inserção da membrana com 100 μL de laminina de rato de 10 μg/mL (em PBS) por pelo menos 2 h no RT (incubações mais curtas podem levar à má fixação das células à pastilha).</li>
		<li>Cubra uma inserção de membrana extra para usar em branco para medições ter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissecção e enucleação dos olhos do rato
<ol><li>Eutanize os camundongos por asfixia de CO2 colocando-os em uma câmara de CO2 e liberando lentamente CO2 a uma taxa de preenchimento de 30-70% do volume da câmara por minuto.</li>
	<li>Coloque as pontas em ângulo e serrilhadas de micro-fórceps em cada lado do olho do mouse e pressione suavemente para proptose o globo ocular (enucleação).</li>
	<li>Feche as fórceps colocadas ao redor do globo ocular. Em seguida, puxe suavemente enquanto se move para frente e para trás para desprender todo o olho com o nervo óptico dos músculos oculares, garantindo que nenhum tecido conjuntivo permaneça preso à esclera.</li>
	<li>Enxágüe o globo ocular enucleado em 70% de etanol antes de colocá-los em um poço de uma placa de seis poços com 3 mL de HBSS-H- no gelo.</li>
	<li>Repita as etapas 2.2 a 2.4 para remover o segundo olho do mouse. Prossiga com os próximos passos dentro de 30 minutos. NOTA: Recomenda-se enuclear/dissecar apenas dois olhos por vez até que alguma experiência seja adquirida.</li>
</ol>3. Coleta do RPE
NOTA: Execute as seguintes etapas em condições estéreis em um capô de fluxo laminar. Para evitar incubações estendidas no gelo, que podem resultar em morte celular RPE, não colecione mais de dois olhos por vez.
<ol><li>Use um estereótipo dissecador, Dumont #5 fórceps e tesouras angulares para limpar cuidadosamente todo o tecido conjuntivo, sangue e músculos que permanecem presos ao globo ocular sem fazer nenhum corte na esclera. Altere o tampão de 3 mL de HBSS-H regularmente, conforme necessário, para manter os olhos frescos e limpos, e evitar a contaminação das culturas RPE.</li>
	<li>Use o nervo óptico como alça para segurar o globo ocular e fazer um buraco no centro da córnea com uma lâmina de #11 de aço carbono afiada.</li>
	<li>Use Dumont #5 tesoura para fazer três incisões na córnea através do orifício acima mencionado, garantindo que haja espaço suficiente para remover a lente.</li>
	<li>Segure o nervo óptico e aplique uma leve pressão na ora serrata com a base da tesoura angular até que a lente saia completamente. Deixe o epitélio de íris no lugar para evitar o descolamento da retina neural e do RPE durante a incubação. Coloque o olho no tampão HBSS-H.</li>
	<li>Repita os passos 3.1-3.4 para dissecar o segundo olho.</li>
	<li>Incubar os olhos sem lentes em solução de hialuronidase em uma placa de 12 poços a 37 °C por 45 min em uma incubadora de 5% de CO2-aerado (1,5 mL/bem) para desprender a retina neural do RPE.</li>
	<li>Coloque cada olho em um novo poço e incuba-o no gelo por 30 minutos com 1,5 mL de tampão HBSS-H+ frio por poço para parar a atividade de hialuronidase. Não prolongue a incubação por mais de 45 minutos.</li>
	<li>Lave e coloque cada olho em um prato de cultura de 35 mm com tampão HBSS-H+ fresco e corte a córnea através das incisões originais até chegar à serrata de ora usando uma tesoura Vannas de 8 cm. Em seguida, corte abaixo da ora serrata para remover o epitélio de íris e córnea.</li>
	<li>Segure a borda da opa/serrata de ora com pinças curvas e, usando microforceps angulares, afaste a retina neural certificando-se de que a camada RPE não seja cortada. Em seguida, corte o apego interno ao nervo óptico. Se algumas células RPE permanecerem ligadas à retina neural, estenda o tempo de incubação, mas não exceda o total de 45 minutos.</li>
	<li>Corte o nervo óptico e transfira cada pálpebra para uma placa diferente de 12 poços contendo 1,5 mL de trippsina-EDTA fresca por poço. Certifique-se de que as copas dos olhos permaneçam abertas e completamente submersas na trippsina. Incubar as soluços a 37 °C por 45 min em uma incubadora de CO2 de 5%.</li>
	<li>Colete cada ocular juntamente com quaisquer folhas de RPE destacadas durante a incubação de trippsina e transfira-as para uma placa de 12 poços contendo 1,5 mL de solução FBS por poço. Se as folhas RPE permanecerem na solução trypsin, use uma micropipette para transferi-las para o poço com a solução FBS.</li>
</ol>4. Isolamento das células RPE do mouse primário
<ol><li>Segure cada xícara ocular pelo nervo óptico e agite-a de frente para baixo na placa de 12 poços contendo 1,5 mL de 20% de FBS no HBSS-H+ até que o desprendimento completo das folhas RPE seja alcançado.</li>
	<li>Colete quaisquer folhas RPE e clusters RPE com uma micropipette e coloque-as em um tubo de 15 mL. Evite quaisquer pedaços brancos de esclera ou coroide, que possam contaminar as culturas. Piscina dois olhos do mesmo rato em um tubo.</li>
	<li>Centrifugar a mistura a 340 x g por 2 min no RT e descartar o supernaspe.</li>
	<li>Ressuspenque suavemente a pelota RPE em 1 mL de trypsin-EDTA (0,25%) e incubar a mistura por 1 min em um banho de água a 37 °C para desagregar as folhas RPE em células únicas. Após a incubação, cochilhe suavemente para cima e para baixo 10x com uma micropipette, evitando a formação de bolhas durante a pipetação.</li>
	<li>Adicione 9 mL de meio RPE recém-preparado para diluir e inativar a trippsina e centrifugar a mistura a 340 x g por 2 min no RT.</li>
	<li>Aspire o supernascer e resuspenque cuidadosamente a pelota celular em 150 μL de meio RPE com 5% de FBS usando uma micropipette, garantindo que as células sejam resuspensadas e evitando a formação de bolhas durante a pipeta.</li>
	<li>Faça a pastilha de membrana revestida de laminina a partir da etapa 1.2, remova o PBS da câmara inferior e adicione 700 μL de meio RPE.</li>
	<li>Remova a laminina da câmara superior da inserção da membrana e distribua a suspensão da célula RPE de forma gota e uniformemente para o centro da câmara, evitando a formação de bolhas durante a pipetação.</li>
	<li>Coloque a inserção da membrana em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C e deixe intacta por pelo menos 24 h.</li>
	<li>Após 24h, verifique a inserção da membrana sob o microscópio para certificar-se de que a maioria das células RPE estão presas à inserção e a confluência é de pelo menos 50%(Figura 1A). É fundamental não mudar a mídia durante as primeiras 72 h.</li>
</ol>5. Cultura de monocamadas RPE polarizadas
<ol><li>Mantenha as células RPE isoladas na cultura por pelo menos 72 h antes de atualizar o meio RPE para permitir o apego celular. Uma confluência celular de 50% ou mais na semeadura é fundamental para a formação de uma monocamada RPE polarizada adequada.</li>
	<li>Altere o meio de cultura duas vezes por semana usando meio RPE fresco e pré-aquecido (passo 1.1.5) depois que as células estiverem conectadas. O soro pode ser removido do meio de cultura após as primeiras 72 h. NOTA: Após uma semana na cultura, as células devem ser confluentes, hexagonais, binucleadas, pigmentadas e polarizadas(Figura 1B),com o número de células esperados em torno de 50.000 células por inserção transwell de 6,5 mm. Após duas semanas na cultura, são observadas monocamadas RPE compostas por células saudáveis. As culturas RPE exibem microvilli apical, dobras basais e junções apertadas(Figura 1C).</li>
</ol>6. Medição ter
NOTA: Realize medições TER das células RPE após um mínimo de 4 dias na cultura para garantir uma boa integridade e polarização da monocamada RPE.
<ol><li>Limpe os eletrodos do voltohmômetro com 70% de etanol e seque-os cuidadosamente.</li>
	<li>Pegue as transes da incubadora e realize a medição do TER dentro de 3 minutos para evitar alterações devido às flutuações de temperatura. Para medir o TER, mergulhe o eletrodo curto do voltohmômetro na câmara superior e o eletrodo longo na câmara inferior da pastilha da membrana. Evite contato com a monocamada RPE para evitar o descolamento celular.</li>
	<li>Para calcular o TER, deduza o valor do vazio (inserção de membrana revestida com laminina sem células) da amostra. Em seguida, multiplique o valor obtido (em ohms) pela área superficial da pastilha da membrana (0,33 cm2 no caso da pastilha de membrana de 6,5 mm). O produto deve ter pelo menos 200 Ω x cm2 após 72 h na cultura. Os valores ter devem medir acima de 400 Ω x cm2 após duas semanas. Descarte culturas RPE com baixos valores ter.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Enquanto vários métodos para o isolamento e cultura das células RPE do camundongo haviam sido desenvolvidos antesde 1,13,20,22,26,27, o método de Fernandez-Godino usou pela primeira vez inserções de membrana permitindo o crescimento eficiente das células RPE na cultura durante as semanas1,<s...

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células de pigmento de retina de camundongos (RPE), que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas transwell. O RPE é uma monocamada localizada no olho entre a retina neural e a membrana do Bruch. Esta camada única consiste em células epiteliais altamente polarizadas e pigmentadas unidas por junções apertadas, exibindo uma forma hexagonal que se assemelha a um favo de mel2. Apesar dessa aparente simplicidade histológica, o RPE executa uma grande variedade de funções críticas à retina e ao ciclo visual normal2,3,4. As principais funções da monocamada RPE incluem absorção de luz, nutrição e renovação de fotorreceptores, remoção de produtos finais metabólicos, controle da homeostase de íon no espaço subretral e manutenção da barreira hemintária2,3. O RPE também tem um papel importante na modulação local do sistema imunológico no olho5,6,7,8,9,10,11. Degeneração e/ou disfunção do RPE são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares como retinite pigmentosa, amaurose congênita leber, albinismo, retinopatia diabética e degeneração macular12,13,14,15. Infelizmente, a disponibilidade de tecidos humanos é limitada. Dada a sua homologia genética altamente conservada com humanos, os modelos de camundongos representam uma ferramenta adequada e útil para o estudo de distúrbios oculares16,17,18,19. Além disso, o uso de células RPE primárias cultivadas proporciona vantagens como manipulação genética e testes de drogas que podem acelerar o desenvolvimento de novas terapias para esses transtornos que ameaçam a visão9,11.
Os métodos existentes disponíveis para isolamento e cultura de RPE do mouse carecem de reprodutivelmente e não recapitulam os recursos RPE in vivo com confiabilidade suficiente. As células tendem a perder pigmentação, forma hexagonal e resistência elétrica transeptelial (TER) dentro de poucos dias na cultura13,20. Uma vez que estabelecer essas culturas primárias de células RPE a partir de camundongos é um processo desafiador, este protocolo otimizado foi criado com base em outros protocolos para isolar células RPE de ratos e olhos humanos21,22,23 para dissecar os olhos do rato, coletar o RPE e cultivar as células RPE do mouse in vitro.

<table><tbody><tr><td>Seringa de ponta BD Luer-Lok de 10 ml, descartável</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>VWR International</td><td>21008-103</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>VWR International</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micropinça angular</td><td>WPI</td><td>501727</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>Thermo</td><td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phospate Buffered Saline sem Cálcio, sem Magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 45&deg; Pinças de Biologia Médica, ponta de 0,05 x 0,01 mm, comprimento de 11 cm</td><td>WPI</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>Inativado por calor.</td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada mais cálcio e magnésio, sem fenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Solução salina balanceada mais cálcio e magnésio, sem fenol vermelho B6</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3506 1G</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0396</td><td></td></tr><tr><td>Capa de fluxo laminar</td><td>Thermo</td><td>CLASSE II A2 4 115V PACOTECLA</td><td></td></tr><tr><td>Laminina 1mg/ ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1 MG</td><td>Diluir em PBS a 37C a 1mg/ml</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Tesoura 8 cm de comprimento</td><td>WPI</td><td>503216</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N1 Suplemento 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica de aço carbono Bard-Parker estéril tamanho 11</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 poços tratadas para cultura de tecidos</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços tratadas para cultura de tecidos</td><td>Fisher-Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Transwell suporta 6,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-thyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-5516</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Pinça</td><td>Gibco 25200056</td><td></td></tr>, <tr><td>Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curva, aço inoxidável 0,02 x 0,06 mm Pontas Mod</td><td>WPI</td><td>500232</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tesoura 8cm de comprimento, aço inoxidável</td><td>WPI</td><td>501790</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Seringa Whatman Puradisc 25mm 0.45&mu; m tamanho do poro</td><td>Fisher-Scientific</td><td>6780-2504</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Os distúrbios oculares afetam milhões de pessoas em todo o mundo, mas a disponibilidade limitada de tecidos humanos dificulta seu estudo. Modelos de camundongos são ferramentas poderosas para entender a fisiopatologia de doenças oculares devido às suas semelhanças com a anatomia humana e a fisiologia. Alterações no epitélio pigmento da retina (RPE), incluindo alterações na morfologia e função, são características comuns compartilhadas por muitas doenças oculares. No entanto, o isolamento bem sucedido e a cultura das células RPE do mouse primário é muito desafiador. Este artigo é uma versão audiovisual atualizada do protocolo publicado anteriormente por Fernandez-Godino et al. em 2016 para isolar e cultivar eficientemente células RPE do mouse primário. Este método é altamente reproduzível e resulta em culturas robustas de monocamadas RPE altamente polarizadas e pigmentadas que podem ser mantidas por várias semanas na Transwells. Este modelo abre novos caminhos para o estudo dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes às doenças oculares. Além disso, fornece uma plataforma para testar abordagens terapêuticas que podem ser usadas para tratar doenças oculares importantes com necessidades médicas não atendidas, incluindo distúrbios hereditários da retina e degenerações maculares.

Este protocolo tem sido usado para isolar e cultivar células RPE de camundongos geneticamente modificados1. Não foram observadas diferenças entre cepas de camundongos ou sexo. Os resultados têm ajudado a compreender alguns aspectos importantes do mecanismo subjacente às doenças oculares subjacentes, como a degeneração macular relacionada à idade, que é a causa mais comum de perda de visão entre os idosos9. As células RPE isoladas após este protocolo foram completamente liga...

Este protocolo, que foi originalmente relatado por Fernandez-Godino et al. em 20161,descreve um método para isolar eficientemente e cultivar células RPE do mouse, que formam uma monocamada RPE funcional e polarizada dentro de uma semana em placas Transwell. O procedimento leva aproximadamente 3 horas.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Este protocolo permite o isolamento eficiente e a cultura das células RPE do mouse. Culturas de RPE de camundongos primários saudáveis são modelos valiosos para entender os mecanismos das doenças oculares subjacentes. Culturas de RPE confluentes e viáveis obtêm dentro de três dias e podem ser cultivadas por semanas.Este protocolo tem sido usado com sucesso para compreender os mecanismos subjacentes à degeneração macular relacionada à idade precoce, que é a principal causa de cegueira entre os idosos nos países desenvolvidos. É importante visualizar as etapas de dissecção. Os detalhes são fundamentais para o sucesso do protocolo, por exemplo, como lidar com os globos oculares para que a esclera não seja perfurada, onde exatamente os cortes devem ser realizados, e como incorporar os copos oculares na trippsina para que fiquem abertos.Comece com a preparação de todos os reagentes necessários para o protocolo. Em seguida, comece a limpar o globo ocular removendo cuidadosamente todo o tecido conjuntivo, sangue e músculos, usando Dumont número cinco fórceps e tesouras angulares, sem fazer nenhum corte na esclera. Transfira o globo ocular para um prato fresco contendo três mililitros de tampão HBSS sem HEPES regularmente para manter os olhos frescos e limpos e evitar qualquer contaminação.Use o nervo óptico como alça para segurar o globo ocular e fazer um buraco no centro da córnea com uma lâmina de aço carbono afiada número 11. Faça três incisões na córnea através do orifício com dumont número cinco tesoura, garantindo que haja espaço suficiente para remover a lente. Segure o nervo óptico e aplique uma leve pressão na ora serrata com a base da tesoura angular, até que a lente saia completamente.Mantenha o epitélio de íris intacto para evitar o descolamento da retina neural e do RPE durante a incubação. Coloque o olho no buffer HBSS sem HEPES. Incubar os olhos sem lentes na solução de hialuronidase a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora aerada de dióxido de carbono de 5% para desprender a retina neural do RPE.Coloque cada olho em um novo poço com 1,5 mililitros de tampão HBSS HEPES frio por poço e incuba-o no gelo por 30 minutos. Após a lavagem, coloque cada olho em um prato de cultura de 35 milímetros com tampão HBSS HEPES fresco. Corte a córnea através das incisões originais com uma tesoura Vannas de oito centímetros até que a ora serrata seja atingida, depois corte abaixo da serrata de ora para remover o epitélio de íris e córnea.Segure a serrata de ora com pinças curvas e usando micro fórceps angulares, puxe a retina neural, certificando-se de que a camada RPE não seja cortada. Em seguida, corte o apego interno ao nervo óptico. Corte o nervo óptico e transfira cada copo ocular para uma placa diferente de 12 poços contendo 1,5 mililitros de trippsina-EDTA fresca por poço.Certifique-se de que os copos oculares permaneçam abertos e completamente submersos na trippsina. Incubar os copos oculares a 37 graus Celsius por 45 minutos em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Colete cada copo de olho junto com quaisquer folhas de RPE destacadas durante a incubação de trippsina e transfira-as para uma placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de solução FBS por poço.Se as folhas RPE permanecerem na solução trypsin, use uma micropipette para transferi-las para o poço com a solução FBS. Segure cada copo ocular pelo nervo óptico e agite-o de frente para baixo na placa de 12 poços contendo 1,5 mililitros de 20% FBS no tampão HBSS HEPES até que o descolamento completo das folhas RPE seja alcançado. Colete quaisquer folhas de RPE e clusters RPE com uma micropipette, evitando quaisquer pedaços brancos de esclera ou coroide, que possam contaminar as culturas, e coloque-as em um tubo de 15 mililitros.Puxe dois olhos do mesmo rato em um tubo. Em seguida, centrifufique a mistura de RPE a 340 x g por dois minutos em temperatura ambiente e descarte o supernaspe. Resuspenque suavemente a pelota RPE em uma mistura de um mililitro de 0,25% trypsin-EDTA e incuba-a por um minuto em um banho de água a 37 graus Celsius para desagregar as folhas RPE em células únicas.Em seguida, delicadamente pipeta para cima e para baixo 10 vezes, evitando a formação de bolhas. Adicione nove mililitros de meio RPE recém-preparado para diluir e inativar a trippsina e centrifugar a mistura a 340 x g por dois minutos à temperatura ambiente. Aspire o supernascer e resuspenja cuidadosamente a pelota celular em 150 microliters de meio RPE com 5%FBS.Em seguida, remova o PBS da câmara inferior da inserção de membrana revestida de laminina previamente preparada e adicione 700 microliters de meio RPE a ele. Remova a laminina da câmara superior da inserção da membrana e distribua a suspensão da célula RPE em termos de gota e uniformemente para o centro da câmara. Coloque a inserção da membrana intacta em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por pelo menos 24 horas.Em seguida, verifique a inserção da membrana sob o microscópio para certificar-se de que a maioria das células RPE estão ligadas à inserção e a confluência é de pelo menos 50% Não mude a mídia durante as primeiras 72 horas. As células RPE isoladas usando este protocolo mostraram o tamanho típico de RPE, morfologia e pigmentação. Uma monocamada RPE altamente polarizada com dois núcleos unidos por junções apertadas, juntamente com a presença de microvilli apical e dobras basais, foi observada após uma semana.A polarização da monocamada RPE foi confirmada pelos valores ter, com a média superior a 200 centímetros quadrados, que se manteve estável ao longo do tempo. Em ensaios de fagocitose realizados no FITC rotulados pos bovinos, observou-se engolfação e digestão de PDV, indicando formação de uma monocamada confluente funcional de células RPE. Culturas viáveis requerem pouco tempo de dissecção, o que é alcançado com experiência.Algumas células RPE podem permanecer ligadas à retina neural, mas se várias folhas RPE permanecerem anexadas, o protocolo não terá sucesso. A hialuronidase fresca deve ser usada sempre para evitar este problema. Essas culturas funcionais de células RPE do rato primário são uma ferramenta valiosa para estudar a patobiologia do RPE em muitas doenças oculares.Por exemplo, este protocolo possibilitou estudar a pathobiologia do RPE em um modelo de camundongo de degeneração macular.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O epithelium retinal do pigment (RPE) é um epitélio multi-funcional do olho. Aqui nós apresentamos um protocolo para estabelecer culturas de célula primária derivadas o RPE murino.

Culturas de células primárias do Mouse epithelium Retinal do Pigment

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

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Aqui, um método fácil de seguir para a cultura de células epiteliais primárias do pigmento da retina suína in vitro é apresentado.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para isolar células gliais de Müller da retina de olhos de camundongos. O protocolo começa com a enucleação e dissecção dos olhos de camundongos, seguida de isolamento, semeadura e cultura de células de Müller.

Isolamento de células primárias de Müller glial da retina de camundongo

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para isolar células primárias de Müller retinianas de ratos Sprague-Dawley (SD) neonatais. O procedimento inclui enucleação dos globos oculares, dissecção do tecido retiniano, extração e identificação de células e considerações importantes para a cultura de células subsequente.

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A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento...

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Nesta publicação, é descrito um procedimento rápido e conveniente para o isolamento e cultura de células acinares pancreáticas primárias do pâncreas murino. Este método constitui uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia das células primárias normais do pâncreas fresco / não transformada exócrinas.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.

Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

Aprenda a isolar e cultivar células epiteliais de pigmento de retina primárias de rato. Este método produz monocamadas polarizadas e funcionais para estudar mecanismos de doenças oculares e testar terapias em modelos in vitro.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

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