Name: Loteamento tumoral em Drosophila melanogaster com um Injetor Auto-Nanoliter Programável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Aprenda o loteamento tumoral em Drosophila melanogaster utilizando um injetor auto-nanoliter programável. Este método aumenta a eficiência, velocidade e rendimento das pesquisas sobre neoplasia em modelos de câncer.

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Agradecemos aos ex-membros do laboratório Dr. Sheng-An Yang e Sr. Juan-Martin Portilla por sua contribuição no desenvolvimento deste protocolo. Somos gratos pelo laboratório do Dr. Yan Song na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Pequim por compartilhar seu protocolo sobre a locotraplantação manual. Agradecemos também ao Sr. Calder Ellsworth e ao Sr. Everest Shapiro pela leitura crítica do manuscrito.
A ADM recebeu financiamento (GM072562, CA224381, CA227789) para este trabalho do Instituto Nacional de Saúde (https://www.nih.gov/) e financiamento (IOS-155790) da Fundação Nacional de Ciência (htps://nsf.gov/). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

1. Preparação do tumor do anel imaginário de SG
<ol><li>Moscas adultas cruzadas com genótipos de UAS-NICD (Masculino: 10-15 moscas) e Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts (Fêmea Virgem: 10-15 moscas) e permitem que elas se reproduzam por 1 dia a 18 °C. As moscas adultas selecionadas devem ter de 5 a 9 dias para garantir alta fertilidade.</li>
	<li>Permita que as moscas adultas coloquem ovos nos alimentos de mosca contidos em frascos por 24 h a 18 °C e, em seguida, remova as moscas adultas. NOTA: A comida fly é preparada usando a receita padrão de alimentos de fubá do Drosophila Stock Center8. Cada frasco deve conter cerca de 10mL de alimentos para moscas.</li>
	<li>Deixe os ovos incubarem por 6 dias a 18 °C. Durante este período, as larvas chocarão.</li>
	<li>Transfira os frascos que contenham larvas para uma incubadora de 29 °C e incubar por mais 7 dias. NOTA: Esta etapa de incubação é opcional dependendo do design experimental específico.</li>
</ol>2. Preparação de Drosophila adulto selvagem para aotransplantação
<ol><li>Anestesiar o tipo selvagem ou moscas adultas mutantes apropriadas com 100% de CO2 e classificar moscas baseadas em sexos. Tanto moscas masculinas quanto femininas podem ser usadas como hospedeiros tumorais.</li>
	<li>Fixar um pedaço de fita de 5 cm de comprimento em um slide de microscópio com o lado pegajoso para cima, fixando-o com dois pedaços menores de fita, um em cada extremidade.</li>
	<li>Imobilize as moscas aderindo suas asas à fita. Use fórceps enquanto manobra as moscas.<ol>
<li>Repita o passo acima para 60-80 moscas adultas usadas como aceitadores de alusão. NOTA: É melhor organizar moscas em linhas limpas, com seu eixo corporal alinhado paralelo um ao outro para um processo de injeção mais eficiente mais eficiente mais tarde. A Figura 1 mostra fileiras de moscas hospedeiras coladas desta maneira.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montagem do aparelho autoinjetor
<ol><li>Conecte o aparelho autoinjetor e o cabo de alimentação à caixa do controlador.<ol>
<li>Ajuste o volume de injeção para 59,8 nL. Isso ajudará a manter a quantidade adequada de forças de sucção e injeção durante a adução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a caixa do controlador e o autoinjetor em lados opostos do microscópio de luz. NOTA: Para operadores destros, a caixa de controle deve ser colocada no lado esquerdo do microscópio com o injetor do lado direito. Vice-versa para operadores canhotos.</li>
	<li>Prepare o capilar de vidro de 3,5'' para uso, cortando a extremidade fechada com fórceps.<ol>
<li>Processe uma extremidade do capilar de vidro usando um puxador de micropipette de quatro etapas e aqueça a uma extremidade estreita e fechada usando as seguintes especificações do instrumento: Calor = 650, Força = 200 e Distância = 8. Coloque os capilares perfeitamente no aparelho do puxador e execute o programa depois de inserir as configurações acima.</li>
		<li>Use fórceps para cortar o capilar em um ângulo de aproximadamente 60° para fazer uma extremidade mais nítida para fácil entrada no abdômende mosca adulto 1. Veja a Figura 2 como um exemplo de um capilar bem cortado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Levemente desaparafusar a tampa do injetor. Segure o botão Vazio para avançar a agulha do injetor até que 70%-80% de seu comprimento total esteja aparecendo. Para acelerar o avanço capilar, pressione o botão Encher uma vez enquanto segura simultaneamente o botão Vazio .</li>
	<li>Use uma seringa para encher o capilar de vidro com óleo mineral. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro na agulha do injetor até que o primeiro esteja firmemente preso à rolha de borracha do injetor. Agora aparar a tampa do injetor.<ol>
<li>Limpe o resíduo de óleo mineral na superfície externa da tampa capilar de vidro para evitar contaminar o meio durante a ação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dissecção do tumor do anel imaginário SG
<ol><li>Selecione uma das larvas e transfira-a para uma placa de dissecção preenchida com 100 μL do Médio de Schneider para preparar a dissecção do tumor do anel imaginário SG. NOTA: Apenas os espécimes que abrigam o tumor permanecerão como larvas. Isso porque o crescimento do tumor atrasa o desenvolvimento larval e a progressão9. Dois terços dos espécimes não abrigarão o tumor e, portanto, terão progredido para pupas/adultos.<ol>
<li>Para fins de dissecção e adução, use um estereótipo com uma faixa de ampliação de 10x-20x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando um par de fórceps para segurar a parte central do corpo larval, belisque a cabeça larval usando outro par de fórceps e aplique uma força de alongamento longitudinalmente.</li>
	<li>Localize o SG em forma de Y das larvas e isole-o do resto do tecido larval10.</li>
	<li>Disseca e isole o tumor do anel imaginário SG removendo o tecido adjacente. Consulte a Figura 3 para uma representação deste processo de dissecção.</li>
	<li>Repita os passos 4.1-4.4 para um adicional de 10 a 20 tumores de anel imaginário SG com base nas necessidades da pesquisa.</li>
</ol>5. Aoenxerto do tumor do anel imaginário primário de SG
<ol><li>Submergir o capilar no Meio schneider contendo os tumores de anel imaginário sg primário. Segure o botão Encher para encher o capilar de vidro com o Médio de Schneider até o segmento superior de 0,5 cm. Este segmento superior deve permanecer cheio de óleo mineral. NOTA: Acelere esse processo pressionando o botão Vazio uma vez enquanto segura simultaneamente o botão Fill .</li>
	<li>Localize um tumor primário e pressione o botão Fill até que o tumor seja aspirado no capilar.<ol>
<li>Certifique-se de que o tumor está na ponta do capilar ou vários milímetros de distância da ponta do capilar. Isso ajuda a evitar que o tumor fique à deriva e se perca na solução contida no capilar. Consulte a Figura 4A para uma demonstração do local do tumor apropriado, pois ele está no capilar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localize uma mosca adulta imobilizada para a fita no slide do microscópio. Usando fórceps, segure suavemente o abdômen inferior. Em seguida, fure a cutícula lateral inferior do abdômen com o capilar. Pressione o botão Esvaziar até que o tumor entre no novo abdômen hospedeiro. Consulte a Figura 4B para uma demonstração desta técnica.</li>
	<li>Usando fórceps, aperte suavemente as asas do host para removê-la da fita. Coloque o anfitrião em um novo frasco com comida fresca. É melhor colocar o frasco de lado para as 24 horas iniciais após a injeção. Cada frasco deve conter apenas até um máximo de 20 moscas. NOTA: Algumas moscas hospedeiras terão asas faltando e outras feridas em seus corpos após a injeção e podem ficar com a comida de mosca se o frasco for colocado na vertical.</li>
	<li>Repita os passos 5.2 a 5.4 para transplantar os tumores primários restantes em seus novoshospedeiros adultos.
</li>
	<li>Descarte os capilares no recipiente de sharps e limpe o resíduo de óleo mineral do exterior do autoinjetor antes de substituir o aparelho de volta em sua caixa.</li>
	<li>Armazene o frasco de hosts em temperatura ambiente por 1 dia e transfira o frasco para uma câmara de incubação a 29 °C. Transfira os hosts para novos frascos a cada 2-3 dias.</li>
	<li>Monitore os hosts de mosca diariamente e calcule as taxas de sobrevivência. Após uma semana, os tumores devem ser visíveis sob um microscópio estéreo com adaptador de fluorescência e podem ser continuamente monitorados para seu tamanho e progressão.</li>
</ol>6. Re-aoento de tumores transplantados
<ol><li>Em torno de 10-14 dias após o aoenxerto, tela para tumores que cresceram no abdômen hospedeiro usando um microscópio de fluorescência.</li>
	<li>Anestesiar um host com CO2 e colocá-lo em uma placa de dissecção preenchida com 100 μL Schneider's Medium. Disseca o tumor amberxado cultivado fora do hospedeiro usando dois pares de fórceps.<ol>
<li>Use um par de fórceps para segurar o abdômen e o outro par para inspirar a cutícula abdominal, expondo o tumor a todo-enxerto1.</li>
		<li>Isole cuidadosamente o tumor dos tecidos do hospedeiro preso tanto quanto possível usando marcadores de fluorescência como orientação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o passo 6.2 para preparar dois a três tumores alusões adicionais.</li>
	<li>Transfira a placa de dissecção contendo os tumores colhidos para o estágio de um microscópio leve.</li>
	<li>Use agulhas estéreis e disseque os tumores em pedaços menores que sejam apropriados para o tamanho capilar.</li>
	<li>Repita os passos 4.1-4.5 para preparar a nova geração de hospedeiros adultos e repetir etapas 5.1-5.7 para completar a aotransplantação dos tumores. NOTA: As taxas de sucesso são geralmente mais altas para tumores não primários em comparação com os tumores primários.</li>
	<li>Repetir as etapas 6.1-6.6 para cada geração subsequente de moscas utilizadas no estudo. NOTA: Escolha linhas de host Drosophila adequadas às necessidades experimentais.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, F., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+tumor+growth+in+Drosophila+using+the+tissue+allograft+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).</li>
<li>Magadi, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Hes-centred+transcriptional+networks+in+neural+stem+cell+maintenance+and+tumorigenesis+in+Drosophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem cell maintenance and tumorigenesis in Drosophilia.</a> Development. 147 (22), (2020).</li>
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<li>Mejia, M., Heghinian, M. D., Busch, A., Marí, F., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+nanoinjection+and+electrophysiology+assay+to+screen+for+bioactivity+of+compounds+using+the+Drosophila+melanogaster+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Paired nanoinjection and electrophysiology assay to screen for bioactivity of compounds using the Drosophila melanogaster giant fiber system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3597(2012).</li>
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<li>Yang, S. A., Portilla, J. M., Mihailovic, S., Huang, Y. C., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+notch+triggers+neoplastic+tumorigenesis+in+a+transition-zone-like+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic notch triggers neoplastic tumorigenesis in a transition-zone-like tissue microenvironment.</a> Developmental Cell. 49 (3), 461-472 (2019).</li>
<li>Bloomington Drosophila Stock Center. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22BDSC+Cornmeal+Food%22">BDSC Cornmeal Food</a>. , (2020).</li>
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<li>Kennison, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+larval+salivary+glands+and+polytene+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissection of larval salivary glands and polytene chromosome preparation.</a> CSH Protocols. 2008, (2008).</li>
<li>Ji, H., Han, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LarvaSPA%2C+a+method+for+mounting+drosophila+larva+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">LarvaSPA, a method for mounting drosophila larva for long-term time-lapse imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).</li>
<li>Mirzoyan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+organism+to+study+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model organism to study cancer.</a> Frontiers in Genetics. 10, 51(2019).</li>
<li>Bangi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+at+the+intersection+of+infection%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Drosophila at the intersection of infection, inflammation, and cancer.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 103(2013).</li>
<li>Saavedra, P., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+tumor-induced+organ+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for tumor-induced organ wasting.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1167, 191-205 (2019).</li>
<li>Figueroa-Clarevega, A., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+drosophila+tumors+interrupt+insulin+signaling+to+induce+cachexia-like+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Malignant drosophila tumors interrupt insulin signaling to induce cachexia-like wasting.</a> Developmental Cell. 33 (1), 47-55 (2015).</li>
<li>Koyama, L. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bellymount+enables+longitudinal%2C+intravital+imaging+of+abdominal+organs+and+the+gut+microbiota+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bellymount enables longitudinal, intravital imaging of abdominal organs and the gut microbiota in adult Drosophila.</a> PLOS Biology. 18 (1), 3000567(2020).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse para declarar entre os autores.

A aotransplantação tumoral pode ajudar os pesquisadores a resolver certos problemas que surgem durante o crescimento e progressão do tumor de Drosophila. Um desses desafios é a evasão de mortes prematuras de larvas tumorais ou adultos durante a cultura do tumor primário12. Nesse contexto, a aotransplante tumoral contínua permite que os tumores cresçam indefinidamente, o que facilita estudos longitudinais de crescimento tumoral, metástase e evolução. A aotransplante tumoral também é útil p...

Este protocolo fornece uma orientação passo-a-passo para a ação da glândula salivar larval Drosophila (SG) tumores imagináveis de anel em abdômens de hospedeiros adultos usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera (por exemplo, Nanoject). Este protocolo também fornece instruções para o subsequente re-alusão de tumores em novas gerações de hospedeiros adultos, o que oferece oportunidades para o estudo longitudinal contínuo das características tumorais, como evolução tumoral e interações tumorais-hospedeiros. O protocolo também pode ser aplicado para experimentos de triagem de drogas.
Este método foi desenvolvido para melhorar a eficácia da realização da alotransplante tumoral em Drosophila utilizando injetores manuais1, que muitas vezes são inconsistentes em suas forças de sucção e injeção, levando a resultados subótimos para alotransplante tumoral. Um aparelho autoinjetor fornece melhor controle e pode resultar em taxas mais baixas de mortalidade por moscas pós-aoenxerto. Um operador treinado poderia alcançar uma taxa de sobrevivência de host de mais de 90% com o autoinjetor, em comparação com cerca de 80% quando o injetor manual foi usado1. A taxa global de aquisição de tumores é de 60%-80% no dia 8-12 pós-aoenxerto. O tempo médio de injeção também foi melhorado de 30-40 s por mosca usando um injetor manual para 20-25 s por mosca usando o autoinjetor.
Este protocolo está entre os primeiros protocolos para usar o aparelho autoinjetor na aotransplantação do tumor Drosophila . Um estudo recente também usou o autoinjetor para aotransplantação de células-tronco neurais tumorais2. Anteriormente, o aparelho autoinjetor foi utilizado em Drosophila para estudar virulência bacteriana3, infecções parasitárias e defesahospedeira 4, bem como triagem para bioatividade de diferentes compostos5. Nosso protocolo adapta o aparelho autoinjetor para uso de injeção de tumor e busca fornecer aos pesquisadores de Drosophila resultados de maior qualidade e mais consistentes, economizando-lhes tempo considerável. Este protocolo não só pode ser usado para a aotransplantação de tumores, mas também pode ser adaptado para a aotransplantação de tecidos selvagens e mutantes de calibresemelhante 6.
O tumor de Drosophila NICD usado neste protocolo foi introduzido pela primeira vez por Yang et al.7 na zona de transição do anel imaginário SG, um "hotspot tumoral" que exibe altos níveis de atividade endógena de Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription (JAK-STAT) e atividade c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Além disso, a zona de transição possui altos níveis de matriz metaloproteinase-1 (MMP1)7, o que torna essa região particularmente propícia à tumorigênese. A ativação da via de entalhe através da superexpressão nicd é suficiente para iniciar consistentemente a formação de tumores. Esses tumores podem ser posteriormente aotransplantados para permitir a investigação de uma ampla gama de tópicos, incluindo divisão de células tumorais, invasão e interações tumorais-hospedeiros.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de Varredura a Laser Confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 980</td><td>Também conhecido como "Zeiss LSM 980"</td></tr> <tr><td>Alimento para Moscas de Fubá</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>N/A</td><td>Também conhecido como "Alimento Padrão BDSC para Fubá"Agulha</td></tr> de <tr><td>Dissecção (30Gx1/2)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Dissecção</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td></td></tr><tr><td>Fly Tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015A</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Fluorescência para Microscópio Stero</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>SFA-UV</td><td>Também conhecido como "Adaptador de Fluorescência NightSea"</td></tr> <tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td>Também conhecido como "Zeiss Stereo Discovery.V8"</td></tr> <tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Também conhecido como "Fórceps Dumont #5"&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilar de Vidro (3.5'')</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Cola</td><td>Elmer</td><td>E305</td><td>Também conhecido como "Elmer Washabale Clear Glue"Light</td></tr> <tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>435063-9010-100</td><td>Também conhecido como "Zeiss Stemi 305"Extrator</td></tr> de <tr><td>Micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Também conhecido como "Extrator de Micropipetas de Quatro Passos"</td></tr><tr><td>Nanoject Apparatus</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>Também conhecido como "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>21720001</td><td></td></tr><tr><td>Seringa (27G x1/2)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Vial</td><td>Fisherbrand</td><td>AS507</td><td></td></tr></tbody></table>

loteamento tumoral em drosophila melanogaster com um injetor auto-nanoliter programável

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

Este protocolo descreve a aotransplantação de tumores em Drosophila melanogaster usando um aparelho de injeção de auto-nanolitera. Com o uso de um aparelho autoinjetor, operadores treinados podem obter resultados de transplante mais eficientes e consistentes em comparação com aqueles obtidos usando um injetor manual. Aqui, abordamos temas de forma cronológica: desde o cruzamento das linhas de Drosophila , até a indução e dissecação do tumor primário, o transplante do tumor primário em um novo hospedeiro adulto e o transplante geracional contínuo do tumor para estudos prolongados. Como demonstração, aqui usamos o domínio intracelular notch (NICD) sobreexpressão induzida tumores de anel de glândula salivar imaginária para transplante geracional. Esses tumores podem primeiro ser induzidos de forma confiável em um microambiente de zona de transição dentro de anéis imaginários da glândula salivar larval, depois alusorados e cultivados in vivo para estudar o crescimento contínuo do tumor, evolução e metástase. Este método de aotransplante pode ser útil em programas potenciais de triagem de medicamentos, bem como para estudar interações tumorais-hospedeiros.

Aqui, realizamos a alocagem de gerações de tumores de anel imaginável SG usando o aparelho autoinjetor de injeção de nanoliter e conduzimos imagens subsequentes de tumores com um microscópio de varredura a laser confocal, o que permitiu um mergulho mais profundo em tópicos de crescimento tumoral, migração de células tumorais e interações tumorais-hospedeiros. Ao montar moscas, cole-as a um slide de microscópio e contê-as através de um bloco de polidimtilatilasiloxano (PDMS)bloco 11.
<p class="...

Este protocolo fornece orientação detalhada para a ação de aotransplante geracional inicial e contínua de tumores de Drosophila no abdômen de hospedeiros adultos para estudar vários aspectos da neoplasia. Usando um aparelho autoinjetor, os pesquisadores podem obter melhor eficiência e rendimentos tumorais em comparação com os alcançados pelos métodos tradicionais e manuais.

Loteamento tumoral em Drosophila melanogaster com um Injetor Auto-Nanoliter Programável

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Este protocolo está entre os primeiros a descrever o uso de um aparelho autoinjetor na aotransplantação do tumor Drosophila. Um tema que cresceu em popularidade nos últimos anos. A principal vantagem desse método é que ele aumenta a eficiência da pesquisa sobre câncer em Drosophila, melhorando a velocidade, consistência e rendimento da aotransplantação tumoral.A aotransplantação tumoral em Drosophila é uma técnica delicada que pode ser difícil de dominar. Seja paciente e confie que a prática faz a perfeição. Depois de atravessar as moscas e incubar os ovos por seis dias a 18 graus Celsius, transfira os frascos contendo as larvas eclodidas para uma incubadora a 29 graus Celsius.Classificar o tipo selvagem anestesiado ou moscas adultas mutantes com base em seus sexos. Fixar um pedaço de fita de mosca de cinco centímetros de comprimento em um slide de microscópio com o lado pegajoso para cima. Imobilize as moscas aderindo suas asas à fita com fórceps.Coloque a caixa do controlador e o autoinjetor em lados opostos do microscópio de luz. Processe uma extremidade do capilar de vidro usando um puxador de micro pipeta de quatro passos, aquecendo-o a uma extremidade estreita e fechada. Use fórceps para cortar o capilar em um ângulo de aproximadamente 60 graus para preparar um capilar de vidro de 3,5 polegadas.Levemente desaparafusar a tampa do injetor. Segure o botão vazio para avançar a agulha do injetor até que 70 a 80% do seu comprimento total esteja mostrando. Use uma seringa para encher o capilar de vidro com óleo mineral.Selecione uma das larvas e transfira para uma placa de dissecção preenchida com 100 microliters do Médio de Schneider para preparar para dissecção do tumor de anel imaginário SG. Usando um par de fórceps para segurar a parte média do corpo larval, belisque a cabeça larval usando outro par de fórceps e aplique uma força de alongamento longitudinalmente. Localize e isole o SG em forma de Y das larvas, em seguida, disseque o tumor do anel imaginário SG removendo o tecido adjacente.Encha o capilar de vidro com o Médio de Schneider até o segmento superior de 0,5 centímetros segurando o botão de enchimento. Localize um tumor primário e pressione o botão de preenchimento até que o tumor seja aspirado no capilar. Certifique-se de que o tumor está na ponta do capilar ou vários milímetros de distância da ponta do capilar.Localize uma mosca adulta imobilizada na fita. Em seguida, use fórceps para segurar suavemente o abdômen inferior e perfurar a cutícula lateral inferior do abdômen com o capilar. Pressione o botão vazio até que o tumor entre no novo abdômen hospedeiro.Usando fórceps, aperte suavemente as asas do host para removê-la da fita. Em seguida, colocá-lo em um novo frasco com alimentos frescos. Tela para tumores que cresceram no abdômen hospedeiro usando um microscópio de fluorescência em torno de 10 a 14 dias após o alusão e dissecar o tumor a todo-enxerto cultivado fora do hospedeiro usando dois pares de fórceps.Use um par de fórceps para segurar o abdômen e o outro par para incisar a cutícula abdominal, expondo o tumor a todo-enxerto. Isole cuidadosamente o tumor dos tecidos do hospedeiro ligados. Use agulhas estéreis e disseque os tumores em pedaços menores que sejam apropriados para o tamanho capilar.Repita este processo para uma nova geração de hospedeiros adultos para completar a aotransplantação do tumor. O processo de desenvolvimento do tumor foi rastreado por imagens ao vivo de um tumor de anel imaginário de primeira geração que cresce em um abdômen hospedeiro adulto no dia 10, pós-aotransplante. Um tumor de anel imaginário de sexta geração SG ocupando uma grande parte do abdômen hospedeiro no dia 10, pós-aotransplante é mostrado aqui.Imagens nesta fase podem ajudar a revelar padrões de crescimento tumoral, bem como seus comportamentos de migração e invasão. O transplante de tumor é uma ótima técnica para estudos longitudinais para progressão do tumor, evolução e metástase. Resultados de grande importância, para o estudo das interações do hospedeiro tumoral.Este proto tem grande potencial em telas de drogas contra o câncer usando as drogas Temodal. Usando essa técnica, os pesquisadores poderão economizar tempo e esforço significativos na investigação.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Nós apresentamos uma nova abordagem para quantificar a localização das nanopartículas na vasculatura de tumores humanos xenografted utilizando dinâmicas, imagens em tempo real intravital em um modelo embrião aviária.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.

Um protocolo para indução genética e Visualização de tumores benignos e invasoras em Cephalic Complexos de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo demonstra como gerar tumores clonais fluorescente marcada, geneticamente definidas no Drosophila olho / discos imaginais antenares (DAE). Ele descreve como dissecar o EAD e do cérebro a partir do terceiro larvas e como processá-los para visualizar e quantificar as mudanças de expressão gênica e invasão tumoral.

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

O transplante de células cancerosas é uma ferramenta importante para a identificação de mecanismos de câncer e respostas terapêuticas. As técnicas atuais dependem de animais imune-incompetentes. Descrevemos aqui um método para transplantar células tumorais de zebrafish em embriões imunocompetentes para a análise a longo prazo do comportamento de células tumorais e respostas de fármacos in vivo .

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

O objetivo deste método é gerar um modelo in vivo de angiogênese tumoral por xenoenxertos de células tumorais de mamíferos em um embrião de zebrafish que tem vasos sanguíneos com rótulo fluorescentamente. Por imagem do Xenoenxerto e vasos associados, uma medida quantitativa da resposta angiogênica pode ser obtida.

In vivo Imaging e Quantitation da resposta angiogênica hospedeira em xenoenxertos de tumor de zebrafish

As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.

Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas

Descrevemos um protocolo de xenotransplante na gema de embriões transparentes de peixe-zebra que é otimizado por um método de estadiamento simples e rápido. As análises pós-injeção incluem sobrevida e avaliação da carga da doença de células xenotransplantadas por citometria de fluxo.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para implantação automatizada de xenoenxerto tumoral em larvas de peixe-zebra usando um sistema de injeção robótica de última geração. Além disso, apresentamos vídeos de injeção e dados de validação que demonstram o desempenho bem-sucedido do sistema.

Automatizando a implantação de tumores em larvas de peixe-zebra para pesquisa e medicina do câncer

Este protocolo descreve a reprogramação in vivo de células cancerígenas de camundongo em células dendríticas tipo 1 dentro do microambiente tumoral por meio da expressão forçada dos fatores de transcrição PU.1, IRF8 e BATF3.

Reprogramação In Vivo Tratável de Células Tumorais para Células Dendríticas Convencionais Tipo 1

Com o crescente interesse na imunoterapia intratumoral, a seleção de modelos tumorais acessíveis e práticos é essencial. Tumores subcutâneos são fáceis de estabelecer, mas difíceis de visualizar e manipular. Neste protocolo, descrevemos métodos para gerar tumores intradérmicos que proporcionam melhor visibilidade e acessibilidade.

Implantação de Tumores Intradérmicos como Modelo Robusto para Estudos de Imunoterapia Intratumoral do Câncer de Múrino

Aprenda o loteamento tumoral em Drosophila melanogaster utilizando um injetor auto-nanoliter programável. Este método aumenta a eficiência, velocidade e rendimento das pesquisas sobre neoplasia em modelos de câncer.

Loteamento tumoral em Drosophila melanogaster com um Injetor Auto-Nanoliter Programável

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