Name: Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a registrar atividade de neurônios sensoriais em tempo real usando eletrofisiologia de patch em larvas de zebrafish. Este método oferece melhor resolução temporal que técnicas ópticas para estudar circuitos de células ciliadas.

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Agradecemos o apoio do Instituto Nacional de Saúde (DC010809), da Fundação Nacional de Ciência (IOS1257150, 1856237) e do Whitney Laboratory for Marine Biosciences ao J.C.L. Gostaríamos de agradecer aos membros do passado e do presente do Laboratório Liao por estimular as discussões.

<ol><li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral-line+organ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).</li>
<li>Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+and+motorneuron+activity+in+response+to+single+neuromast+stimulation+in+the+posterior+lateral+line+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).</li>
<li>Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+properties+of+primary+afferent+neurons+in+the+posterior+lateral+line+system+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).</li>
<li>Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li>
<li>Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomics+of+the+zebrafish%27s+lateral+line+neuromast+reveals+wiring+and+miswiring+in+a+simple+microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit.</a> eLife. 7, 33988(2018).</li>
<li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transporter+3+is+required+for+synaptic+transmission+in+zebrafish+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Manley, G. A., Robertson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+spontaneous+activity+of+auditory+neurons+in+the+spiral+ganglion+of+the+guinea-pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea.</a> The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).</li>
<li>Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiang%2C+NYS+%22Discharge+patterns+of+single+fibers+in+the+cat%27s+auditory+nerve%22">Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve</a>. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+basis+of+the+receptor+potential+in+a+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell.</a> Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).</li>
<li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+from+zebrafish+lateral-line+hair+cells+and+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li>
<li>Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descending+diencephalic+dopamine+system+is+tuned+to+sensory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli.</a> Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nature Communications. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Pichler, P., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+behavior+selectively+inhibits+hair+cells+activated+forward+motion+in+the+lateral+line+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish.</a> Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).</li>
<li>Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+exhibit+rheotaxis+and+can+escape+a+continuous+suction+source+using+their+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line.</a> PloS One. 7 (5), 36661(2012).</li>
<li>Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheotaxis+in+larval+zebrafish+is+mediated+by+lateral+line+mechanosensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells.</a> PLoS One. 7 (2), 29727(2012).</li>
<li>Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+for+mechanosensory-based+rheotaxis+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish.</a> Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).</li>
<li>McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+zebrafish+rapidly+sense+the+water+flow+of+a+predator%27s+strike%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike.</a> Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).</li>
<li>Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+evade+predators+by+sensing+water+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).</li>
<li>Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lateral+line+ablation+and+regeneration+in+schooling+giant+danios%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166(2018).</li>
<li>Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+recordings+from+the+lateral+line+in+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).</li>
<li>Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+activity+during+undulatory+body+motions+suggests+a+feedback+link+in+closed-loop+control+of+sea+lamprey+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming.</a> Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).</li>
<li>Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+line+sensitivity+in+free-swimming+toad+fish+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau.</a> The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587(2019).</li>
<li>Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+signal+processing+in+the+lateral+line+system+of+the+dwarf+scorpionfish+Scopeana+papillosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus.</a> The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).</li>
<li>Montgomery, J. C., Bodznick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+filter+that+cancels+self-induced+noise+in+the+electrosensory+and+lateral+line+mechanosensory+systems+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish.</a> Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).</li>
<li>Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+anterior+lateral+line+to+natural+stimuli+in+the+oyster+toadfish%2C+Opsanus+tau+%28Linnaeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus).</a> The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).</li>
<li>Russell, I. J., Roberts, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+spontaneous+lateral-line+activity+of+efferent+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation.</a> The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).</li>
<li>Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efferent+modulation+of+spontaneous+lateral+line+activity+during+and+after+zebrafish+motor+commands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands.</a> Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).</li>
<li>Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharmacology+of+efferent+synapses+in+the+lateral-line+system+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis.</a> The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).</li>
<li>Roberts, B. L., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+lateral-line+efferent+neurons+in+stationary+and+swimming+dogfish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish.</a> The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).</li>
<li>Flock, A., Russell, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-synaptic+action+of+efferent+fibres+in+the+lateral+line+organ+of+the+burbot+Lota+lota%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota.</a> The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).</li>
<li>Montgomery, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+cancellation+in+the+electrosensory+system+of+the+thornback+ray%3B+common+mode+rejection+of+input+produced+by+the+animal%27s+own+ventilatory+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement.</a> Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).</li>
<li>Tricas, T. C., Highstein, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+octavolateralis+efferent+system+upon+the+lateral+line+of+free-swimming+toadfish%2C+Opsanus+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau.</a> Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).</li>
<li>Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+pathways+modulate+efferent+neurons+to+the+inner+ear+and+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).</li>
<li>Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B19%3A+an+acetylcholine+receptor+with+novel+pharmacological+properties+expressed+in+rat+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells.</a> Cell. 79 (4), 705-715 (1994).</li>
<li>Masino, M. A., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fictive+swimming+motor+patterns+in+wild+type+and+mutant+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).</li>
<li>Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHentschke%2C+H+%22MATLAB+Central+File+Exchange%22">MATLAB Central File Exchange</a>. , (2020).</li>
<li>Harris, G. G., Milne, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+characteristics+of+the+lateral-line+sense+organs+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).</li>
<li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li>
<li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+and+analyses+of+interspike-intervals+of+spontaneous+activity+in+afferent+neurons+of+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line.</a> Nature Science Reports. 8, 14851(2018).</li>
<li>Liao, J. C., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+versus+specialized+glycinergic+spinal+interneurons+in+axial+motor+circuits+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).</li>
<li>von Holst, E., Mittelstaedt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+principle+of+reafference%3A+interactions+between+the+central+nervous+system+and+the+peripheral+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Naturwissenschften%22%5BJournal%5D)">The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs.</a> Die Naturwissenschften. 37, 463(1950).</li>
<li>Crapse, T. B., Sommer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corollary+discharge+across+the+animal+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Corollary discharge across the animal kingdom.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).</li>
<li>Brichta, A. M., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+efferent+activation+and+excitatory+response-intensity+relations+of+turtle+posterior-crista+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents.</a> Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O protocolo experimental descrito fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado. Especificamente, ele detalha uma abordagem in vivo para realizar gravações extracelulares simultâneas de neurônios de linha lateral e raízes motoras ventrais em zebrafish larval. A atividade aferente espontânea tem sido previamente caracterizada em zebrafish sem considerar a potencial atividade motor simultânea1,<...

Diferentes neurônios de sistemas de mecanosensoria transmitem informações das células ciliares para o cérebro durante a audição e equilíbrio. A eletrofisiologia pode revelar a sensibilidade de neurônios diferentes através de gravações diretas. Embora a remenda celular inteira das células ciliares possa ser desafiadora, o registro a partir de neurônios a montante é mais fácil e permite a avaliação dos potenciais de ação em resposta às estimulações controladas1,2,3. Estimular as células ciliadas leva à sua deflexão, o que modifica estruturas mecanosensoriais, desencadeando assim um aumento nos potenciais de ação (picos) em neurônios diferentes4,5,6. Na ausência de estímulos externos, os neurônios aferentes também aumentam espontaneamente devido ao vazamento de glutamato das células ciliadas nos diferentes terminais pós-sinápticos7,8, e têm se mostrado contribuintes para a manutenção da sensibilidade9,10. O registro do grampo de correção da atividade aferente permite a observação da sensibilidade das células ciliares e da dinâmica do sinal que não são possíveis utilizando técnicas com menor resolução temporal, como na microfônica11,12 ou imagem funcional de cálcio13,14,15. O protocolo a seguir permitirá o registro de atividades diferentes concomitantemente com comandos motores para revelar alterações instantâneas na sensibilidade das células ciliares.
Os zebrafish (Danio rerio) utilizam células ciliares contidas em neuromasses que compõem o sistema de linha lateral para detectar o movimento da água em relação ao seu corpo, o que é traduzido em sinais neurais essenciais para a navegação16,17,18, prevenção de predadores, captura de presas19,20, e escolaridade21. O fluxo de água também pode ser autogerado pelos movimentos da natação22,23,24, respiração22,25,26e alimentação27. Esses comportamentos compreendem movimentos repetitivos que podem fadigar as células ciliares e prejudicar a detecção. Portanto, é fundamental que o sistema de linha lateral diferencie entre estímulos de fluxo externos (exafentes) e autogerado (reafeto). Uma descarga corolária atenua sinais de fluxo autogerados durante a locomoção em zebrafish. Este sinal motor preditivo inibidor é retransmitido através de neurônios descendentes para os receptores sensoriais para modificar a entrada ou interromper o processamento do feedback reafesso28,29. O trabalho seminal que contribuiu para a nossa compreensão inicial deste sistema de alimentação contou com preparações in vitro onde a conectividade e a atividade endógena do circuito neural não foram mantidas28,30,31,32,33,34,35. Este protocolo descreve uma abordagem para preservar um circuito neural intacto onde a dinâmica de feedback endógeno é mantida, permitindo assim uma melhor compreensão da descarga corolária in vivo.
O protocolo aqui descrito descreve como monitorar a linha lateral posterior a atividade de neurônios e neurônios motores simultaneamente em zebrafish larval. Caracterizar uma dinâmica de sinal diferente antes, durante e depois dos comandos motores, fornece insights sobre o feedback endógeno em tempo real do sistema nervoso central que modula a sensibilidade das células ciliares durante a locomoção. Este protocolo descreve quais materiais precisarão ser preparados antes dos experimentos e, em seguida, descreve como paralisar e preparar larvas de zebrafish. O protocolo descreverá como estabelecer uma gravação de remendo solto estável de neurônios aferentes e gravações de raiz ventral extracelular (VR) de neurônios motores. Os dados representativos que podem ser obtidos por meio deste protocolo são apresentados a partir de um indivíduo exemplar e a análise foi realizada em múltiplas réplicas do protocolo experimental. O pré-processamento de dados é realizado usando scripts escritos personalizados no MATLAB. No geral, esse paradigma experimental in vivo está pronto para proporcionar uma melhor compreensão do feedback sensorial durante a locomoção em um modelo de sistema de células ciliadas vertebradas.

<table><tbody><tr><td>Copo de 100 mL</td><td>Recipiente PYREX</td><td>1000</td><td>para gravação</td></tr><tr><td>Objetiva de imersão em água 10x</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10xW</td><td>baixa ampliação para posicionamento de larvas e eletrodo de registro</td></tr><tr><td>Objetiva de imersão em água 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td>maior ampliação para posicionar a ponta do eletrodo e estabelecer o patch-clamp</td></tr><tr><td>abfload.m</td><td></td><td>arquivo de codificação suplementar</td><td>script MATLAB escrito sob medida para converter gravações de eletrofisiologia bruta em arquivos .mat</td></tr><tr>arquivo de <td>codificação suplementar</td><td>AffVR_preprocess.m</td><td></td><td>script MATLAB escrito sob medida para pré-processamento de dados de gravação</td></tr><tr><td>Cabos coaxiais BNC</td><td>ThorLabs</td><td>2249-C-12</td><td>conectando canais de amplificador e digitalizador; requer 4</td></tr><tr><td>capilares de vidro borossilicato com filamento</td><td>Warner Instrumentos</td><td>G150F-3</td><td>diâmetro interno: 0,86, diâmetro externo: 1,50; vidro capilar usado para formar eletrodos de gravação</td></tr><tr><td>burst_detect</td><td></td><td>arquivo de codificação suplementar</td><td>função MATLAB escrita personalizada necessária para executar o computador AffVR_preprocess.m</td></tr><tr><td></td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>qualquer computador deve funcionar</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação DC</td><td>Tenma</td><td>72-420</td><td>usada para gravar eletricamente os pinos de dissecação</td></tr><tr><td>digitalizador de eletrofisiologia</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>Axon DigiData 1440A</td><td>permite a aquisição de filamento de dados patch-clamp</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB255B</td><td>filamento de caixa de 2,5 mm usado em pinças finas extratoras de micropipetas</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Item nº 11295-10</td><td>usado para manipular larvas e inserir pinos</td></tr> de <tr><td>estágio fixo DIC microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>microscópio usado para visualizar e estabelecer gravações de patch-clamp</td></tr> ponta <tr><td>de pipeta flexível e cônica</td> As pontas flexíveis <td>Fisher Scientific</td><td>02-707-169</td><td>permitem a inserção no eletrodo de gravação para dispensar solução extracelular na ponta</td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>FD3510-100</td><td>prato de gravação com fundo de vidro</td></tr><tr><td>de cobertura KimWipe</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>limpeza de tarefas usada para absorver o excesso de fluido das larvas</td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>Elastômero sylgard de automistura</td> <td>710172</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2020b</td><td>software de linha de comando para pré-processamento</td></tr><tr><td>de dados amplificador de microeletrodo</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td> Amplificador de grampo de patch <td>MultiClamp 700B</td><td>para gravações de canal duplo</td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>microforge para polir micromanipulador de eletrodo de gravação</td></tr><tr><td> unidade de controle</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000-eR/T</td><td>Coordenador de discagem de 4 eixos para controle do micromanipulador</td></tr><tr><td>extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td>para puxar o vidro capilar para eletrodos de gravação</td></tr><tr><td>unidade de controle do microscópio</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000e</td><td>posiciona o microscópio ao redor do estágio fixo e preparação</td></tr><tr><td>micromanipulador</td> <td>motorizadoSiskiyou</td><td>MX7600</td><td>posiciona o cabeçote e o eletrodo de gravação anexado para gravação de patch-clamp</td></tr><tr><td>MultiClamp Commander</td><td>Molecular Devices</td><td>2.2.2</td><td>para download da página de download do Axon MultiClamp 700B Commander</td></tr><tr><td>mesa de ar óptico Mesa</td> de isolamento <td>de placa de ensaio VH3036W-OPT</td> da <td>Newport Corporation</td><td>para microscópio flutuante e minimizar vibrações durante as gravações</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Devices</td><td>10.7.0</td><td>para download do Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Software de análise Página de download</td></tr> marcador <tr><td>de tinta permanente</td><td>Sharpie</td><td>encomenda de amazon.com</td><td>para marcar o lado da borda de ataque do eletrodo VR para garantir a orientação adequada ao inserir no porta-pipetas</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>35-3001</td><td>usado para imergir larvas em porta-pipetas paralíticas</td></tr><tr><td></td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>1-HL-U</td><td>segurar o eletrodo de gravação e conectar ao cabeçote</td></tr><tr><td>transdutor pneumático</td><td>Fluke Biomedical Instruments</td><td>DPM1B</td><td>para controlar o eletrodo de registro pressão interna</td></tr><tr><td>hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>gravante para gravação pinos de dissecação</td></tr><tr><td>tubulação de silicone</td><td>Tubulação Tygon</td><td>14-169-1A</td><td>para conectar o transdutor pneumático ao suporte da pipeta</td></tr><tr><td>spike_detect</td><td></td><td>arquivo</td> <td>de codificação suplementarfunção MATLAB escrita sob medida necessária para executar o</td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td> AffVR_preprocess.m <td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>usado para visualizar pontas de pinos e durante a preparação de larvas</td></tr><tr><td>lâmina de barbear de borda reta</td><td>Canopus</td><td>encomenda de amazon.com</td><td>corta o fio de tungstênio enquanto faz pinos de dissecação</td></tr><tr><td>swimbout_detect</td><td></td><td>arquivo</td> <td>de codificação suplementarfunção MATLAB escrita sob medida necessária para executar a seringa AffVR_preprocess.m</td></tr><tr><td></td><td>Becton Dickinson Compoany</td><td>309602</td><td>preenchida com solução extracelular para injetar em eletrodos de gravação</td></tr><tr><td>pipeta de transferência</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z135003-500EA</td><td>pipeta não estéril de uso único para transferência de larvas</td></tr><tr><td>tricaína metanossulfonato</td><td>Syndel</td><td>12854</td><td>Farmacêutico anestésico usado para eutanasiar larvas com alta dosagem.</td></tr><tr><td>fio de tungstênio</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>715500</td><td>0,002 polegadas, 50,8 &mu; m de diâmetro; usado para fazer pinos de dissecação</td></tr><tr><td>unidade de filtração a vácuo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCGVU11RE</td><td>unidades de filtração a vácuo de uso único, estéreis usadas para esterilizar solução extracelular usada para eletrofisiologia campainha de eletrodo grampo</td></tr><tr><td>de tensão grampo de corrente headstage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>fornecido com amplificador MultiClamp 700B usado como headstages esquerdo e direito</td></tr><tr><td>&alpha;-bungarotoxina</td><td>ThermoFisher</td><td>B1601</td><td>para imobilizar as larvas antes da gravação</td></tr></tbody></table>

atividade da linha lateral posterior neurônios diferentes durante a natação em zebrafish

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sistemas sensoriais reúnem pistas essenciais para o direcionamento do comportamento, mas os animais devem decifrar quais informações são biologicamente relevantes. A locomoção gera sinais reafemináveis de que os animais devem se desembaraçar de pistas sensoriais relevantes do ambiente circundante. Por exemplo, quando um peixe nada, o fluxo gerado a partir de ondulações corporais é detectado pelos neuromasts mecanorreceptivos, compreendendo células ciliar, que compõem o sistema de linha lateral. As células ciliares então transmitem informações de movimento fluido do sensor para o cérebro através dos neurônios sensoriais diferentes. Simultaneamente, a descarga corolária do comando motor é transmitida para as células ciliadas para evitar sobrecarga sensorial. A contabilização do efeito inibidor dos sinais motores preditivos durante a locomoção é, portanto, crítica ao avaliar a sensibilidade do sistema de linha lateral. Desenvolvemos uma abordagem eletrofisiológica in vivo para monitorar simultaneamente a linha lateral posterior aferente neurônio e atividade de raiz motor ventral em larvas de zebrafish (4-7 dias após a fertilização) que pode durar várias horas. Gravações extracelulares de neurônios aferentes são obtidas usando a técnica de grampo de remendo solto, que pode detectar atividade a partir de neurônios únicos ou múltiplos. Gravações radiculares ventrais são realizadas através da pele com eletrodos de vidro para detectar a atividade do neurônio motor. Nosso protocolo experimental fornece o potencial para monitorar mudanças endógenas ou evocadas na entrada sensorial através de comportamentos motores em um vertebrado intacto e comportado.

Depois que as larvas de zebrafish são devidamente imobilizadas e a linha lateral posterior é alcançada, a atividade em neurônios aferentes e motores pode ser medida simultaneamente. Os canais de gravação são exibidos usando protocolos de gravação livres de lacunas (etapa 1.4) para monitoramento contínuo de atividades aferentes e vr. Em tempo real, podem ser observadas reduções na taxa de pico espontâneo efervescente, concomitantemente com atividade vr indicativa de natação fictícia(Figura 1E...

Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Este protocolo permite que o pesquisador monitore a atividade e a resposta de neurônios sensoriais únicos a uma estimulação controlada em uma vértebra de comportamento intacta. Esta eletrofisiologia de patches é uma maneira rápida e direta de registrar a partir da atividade de espiar de neurônios individuais em tempo real. E isso proporciona melhor resolução de tempo e sensibilidade a um custo menor do que a maioria das técnicas de imagem óptica.As células ciliares da linha lateral são homólogas às do ouvido interno humano. Então essa técnica está pronta para revelar as propriedades dos circuitos de células ciliadas que se aplicam à surdez humana e distúrbios auditivos. Eletrofisiologia é uma nave que utiliza habilidades motoras finas que precisa ser vista e imitada fisicamente.As instruções do texto deixam muito espaço para má interpretação. Para começar, dispense uma fina camada de elastômero de silicone auto-misturado, como Sylgard, em um prato de cultura de tecido com fundo de vidro para fazer um prato de gravação de fundo de elastômero de silicone. Para fazer pinos de dissecção, forneça uma carga negativa de cinco volts a um béquer de 100 mililitros de Etchant usando uma fonte de alimentação DC e conecte um fio de tungstênio à saída carregada positivamente.Mergulhe repetidamente a ponta do fio no banho Etchant até que a ponta se reduza a um ponto afiado. Sob um microscópio estéreo, corte o fio aproximadamente um milímetro da ponta com uma lâmina de barbear de borda reta. Repita isso três vezes e insira pinos no prato de gravação curado usando fórceps finos.Para preparar eletrodos de gravação, puxe tubos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipette com filamento de caixa. O eletrodo deve ter uma ponta de diâmetro de 30 micrômetros com um taper que será usado para registrar neurônios diferentes da linha lateral posterior. Puxe um tubo capilar de vidro borossilicato adicional em um par de eletrodos com diâmetros menores de uma a cinco mímetros.Segurando um eletrodo em cada mão, execute delicadamente as pontas umas pelas outras para quebrar as pontas. Com um microforge, polir a ponta chanfrada até ficar homogêneo. O diâmetro da ponta final deve ser entre 30 a 50 micrômetros.Imobilize as larvas de zebrafish e transfira-as para uma placa de petri de 35 milímetros usando uma grande ponta para transferir pipeta. Remova o máximo possível da solução circundante. Mergulhe larvas em 10 microlitadores de 0,1% alfa-Bungarotoxin por aproximadamente cinco minutos.Lave a larva paralisada com solução extracelular por 10 minutos. Em seguida, use uma pipeta de transferência para mover a larva do banho de solução extracelular para o prato de gravação com fundo de silicone. Sob um microscópio estéreo, posicione suavemente as larvas com fórceps finos sobre o centro deste tapete de silicone, lado lateral para cima com as extremidades anterior e posterior do corpo correndo da esquerda para a direita.Utilizando fórceps finos, insira o pino da borda ortogonalmente ao silicone através do notochord dorsal das larvas diretamente dorsal ao ânus. Insira o segundo pino através do notochord perto da extremidade da cauda e insira o terceiro pino através do notochord dorsal da bexiga de gás. Insira o quarto pino através da vesícula otica, proporcionando uma leve rotação à medida que o pino se insere no encapsulante.À medida que uma leve rotação é aplicada, observe o tecido entre o cleithrum e o vesícula otic para revelar o aglomerado de somata aferente. Coloque a larva do pino sob o objetivo de 10 vezes em um estágio fixo do microscópio DIC e oriente as fissuras mioceptais dos blocos musculares paralelos ao vetor do estágio da cabeça esquerda. Coloque o fio moído na solução do banho e certifique-se de que ele esteja conectado ao estágio da cabeça esquerda.Encha o eletrodo de gravação VR com 30 microliters de solução extracelular usando uma ponta flexível de pipeta de carregamento de gel e insira-o no suporte de pipeta da cabeça esquerda. Aumente a ampliação para 40 vezes e baixe a pipeta de gravação na solução do prato, aplicando pressão positiva produzida por um transdutor pneumático. Leve a ponta do eletrodo sobre um myoseptum entre os dois myomeres ventral para a linha lateral até que a fissura esteja centrada na abertura da ponta do eletrodo VR Abaixe a pipeta até que a borda defasada da abertura da ponta entre em contato suavemente com o epitélio.Após o contato inicial, manobre a pipeta na diagonal para garantir que a borda principal faça contato e possa gerar uma vedação. Aplique pressão negativa com o transdutor pneumático e segure-o. No software de grampo de correção, clique no botão Reproduzir na barra de ferramentas para monitorar o sinal VR.Certifique-se de que a gravação vr está sendo alcançada uma vez que a atividade do neurônio motor com a dinâmica de sinal de explosão estereotipado de Wells é observada. Encha o eletrodo de gravação aferente com 30 microliters de solução extracelular e insira-o no suporte de pipeta da cabeça direita. Em seguida, abaixe-o na solução de prato enquanto aplica pressão positiva produzida por um transdutor pneumático.Localize o eletrodo e traga a ponta do eletrodo sobre a amostra. Usando um micromanipulador, abaixe a ponta de eletrodo diferente até que esteja mantendo posição acima do cleithrum. Aumente a ampliação para 40 vezes a imersão e localize a intersecção do nervo da linha lateral posterior e do cleithrum.Leve a ponta do eletrodo sobre o gânglio aferente e baixe a pipeta até que a ponta entre em contato com o epitélio. Suavemente, manobre o eletrodo para que toda a circunferência da ponta entre em contato com o gânglio aferente. Aplique pressão negativa com o transdutor pneumático e segure-o.Depois de clicar em Reproduzir no software de grampo de remendo, certifique-se de que toda a gravação de correção solta de células de neurônios aferentes seja alcançada quando os picos ocorrerem espontaneamente aproximadamente a cada 100 a 200 milissegundos. Uma vez detectada a atividade de neurônios e neurônios motores, clique no botão Gravar na barra de ferramentas no grampo de pico 10 para capturar gravações simultâneas livres de lacunas em ambos os canais. Realize o pré-processamento de dados conforme descrito no manuscrito do texto.Usando este protocolo de gravação livre de lacunas, a atividade em tempo real de neurônios aferentes e VR pode ser medida simultaneamente. Scripts escritos personalizados e pré-processamento geram parcelas para auxiliar na visualização da detecção de picos usando parâmetros como limiar, duração mínima e intervalo mínimo de interspike. Sinais isolados foram obtidos ajustando as variáveis de detecção de limite inferior e superior no script de pré-processamento.A detecção de picos de raízes ventral segue parâmetros idênticos com entradas adicionais. As rajadas dentro de um comando motor são definidas por um mínimo de dois picos dentro de 0,1 milissegundos com duração de cinco milissegundos pelo menos e delineadas por um mínimo de três rajadas com intervalos de bloqueio inferiores a 200 milissegundos Os scripts pré-processamento irão sobrepor seções de atividade aferente inseridas em um período bem definido de interesse. Neste caso, a atividade espontânea média mostra mudanças dramáticas em resposta ao início da atividade motora retratada no eixo X como tempo igual a zero.Diferenças significativas foram detectadas em diferentes taxas de pico entre as taxas de pico pré-natação e as taxas de pico dos períodos de natação e pós-natação. As taxas de pico aferentes foram negativamente correlacionadas com a duração da natação. Não há correlação detectada entre a taxa de pico relativo e a frequência de natação.A saúde animal é a coisa mais importante na tentativa desse procedimento. É crucial monitorar o fluxo sanguíneo rápido para não apenas garantir o bem-estar animal, mas também aumentar a probabilidade de sucesso de registro neural. Ao aproveitar ferramentas genéticas disponíveis no Zebrafish, este protocolo de eletrofisiologia pode ser elogiado por linhas transgênicas para investigar poderosamente a conectividade de circuitos anatômicos e funcionais em sistemas de células ciliadas e além.Esta modificação simplificada da técnica de grampo de remendo nos permite monitorar como os sistemas sensoriais funcionam in vivo.

activity-posterior-lateral-line-afferent-neurons-during-swimming

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o ensaio de reotaxia em peixe-zebra. O método envolve a medição do comportamento de orientação do peixe-zebra em resposta a diferentes taxas de fluxo de água sob a influência de diferentes campos magnéticos.

Ensaio de reotaxia de peixe-zebra: um método para medir o comportamento da orientação em resposta a diferentes taxas de fluxo de água

Este vídeo descreve técnicas optogenéticas ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados e registrando a resposta comportamental provocada com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Optogenética do peixe-zebra: ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados para estudar respostas comportamentais larvais

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

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Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

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Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

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Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

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Aprenda a registrar atividade de neurônios sensoriais em tempo real usando eletrofisiologia de patch em larvas de zebrafish. Este método oferece melhor resolução temporal que técnicas ópticas para estudar circuitos de células ciliadas.

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

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