Name: Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas da Síndrome de Turner (45XO) Células Fetais para Modelagem A Jusante de Déficits Neurológicos Associados à Síndrome (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de integração a partir de fibroblastos fetais usando plasmídeos episomais e nucleofecção. Este método permite modelar déficits neurológicos da síndrome de Turner.

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O apoio financeiro para a pesquisa acima foi fornecido pela Manipal Academy of Higher Education. A caracterização da linha foi conduzida parcialmente no laboratório de M.M. Panicker na NCBS. Agradecemos ao Laboratório de Diagnóstico anand pela ajuda com o karyotyping.

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<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A geração de modelos celulares estáveis de tecido fetal citogeneticamente anormal é necessária para perpetuar o fenótipo defeituoso. A rota iPSC é o método mais eficaz de preparação celular para conservação perpétua de propriedades defeituosas20.
Células-tronco pluripotentes (PSC) apresentam propriedades de auto-renovação e diferenciação em células especializadas que lembram os embriões de decote precoce21. Assim, os PSCs podem servir como excele...

As aneuploidias levam a defeitos congênitos/malformações congênitas e perda de gravidez em humanos. ~50%-70% dos espécimes de perdas de gravidez mostram anormalidades citogenéticas. Embriões aneuploides perdidos no início da gravidez não podem ser facilmente obtidos para análise experimental, levantando a necessidade de desenvolver outros modelos representando de perto a embriogênese humana. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de células diagnosticadas com distúrbios genéticos têm sido utilizadas para modelar as irregularidades genéticas representativas e suas consequências no desenvolvimento fetal1,2,3,4. Estes iPSCs se assemelham a células epiblastos do embrião em desenvolvimento e podem recapitular os primeiros eventos da formação de embriões. Permitem a compreensão e caracterização do programa de desenvolvimento de linhagens celulares e padronização em embriões mamíferos primitivos. iPSCs derivados anteriormente de fibroblastos de pele e amniócitos de testes de diagnóstico pré-natal de síndromes de aneuploidia como monosomia X (síndrome de Turner), trissomia 8 (síndrome warkany 2), trissomia 13 (síndrome de Patau) e trissomia parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) forneceram insights valiosos sobre o desenvolvimento fracassado4.
A síndrome de Turner (TS) é uma condição rara caracterizada pela infertilidade feminina, baixa estatura, distúrbios endócrinos e metabólicos, um risco aumentado de doença autoimune e uma predisposição à doença cardiovascular5. Embora seja a única síndrome de monossomia sobrevivente, também é letal para o embrião em desenvolvimento causando abortos espontâneos6. Indivíduos sobreviventes com TS apresentam graus de alteração de material x-cromossômico em suas células. Os karyótipos variam da perda completa de um cromossomo X (45,XO) a mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, a presença de cromossomos de anel, a presença de material cromossômico Y, etc5.
O diagnóstico da síndrome é geralmente feito por karyotipping sangue de indivíduos sintomáticos e amostragem de villi coriônica (CVS) para detectar síndromes de aneuploidia precoce. Como as síndromes de aneuploidia são responsáveis por ~30% dos abortos espontâneos, é rotina o karyótipo do produto da concepção (POC) após um aborto espontâneo. Essas células fetais, incluindo o villi coriônico que possui a anormalidade citogenética e os iPSCs derivados delas fornecem uma valiosa fonte de material biológico para estudar as síndromes de aneuploide4,6. Os IPSCs de TS foram previamente estabelecidos a partir de amniocitos via reprogramação retroviral4, fibroblastos de villi coriônico (obtidos através de diagnóstico pré-natal) via reprogramação retroviral6, a partir de células mononucleares de sangue7 via reprogramação do vírus Sendai e de fibroblastos de pele de indivíduos TS via reprogramação lentitina4 . Como o foco principal do nosso laboratório é entender a falha no desenvolvimento, geramos iPSCs de TS do POC, especificamente o componente de villi coriônico de um aborto espontâneo8. Todas as células isoladas deste tecido fetal tinham um karyótipo 45XO e produziam iPSCs com o mesmo karyótipo. Esses iPSCs são únicos, pois são os primeiros a serem gerados a partir de um feto abortado e fornecem um recurso valioso para estudar falhas relacionadas à aneuploidey. Este artigo fornece uma metodologia detalhada da geração de iPSCs a partir desta fonte celular única através da reprogramação epissomal.
Os primeiros métodos de geração iPSC utilizaram transdução viral e transposons para entregar os fatores de reprogramação. Os métodos de induzir células à pluripotência evoluíram do uso de vetores retrovirais integradores9, vetores lentiviras excisáveis10,11 e métodos baseados em transposon12 para vetores adenovirais não integradores13 e vetores baseados em vírus Sendai14. A reprogramação baseada em retroviral e lentiviral, embora eficiente, envolve a integração dos fatores de reprogramação nos cromossomos hospedeiros, causando mutações de inserção que têm efeitos imprevistos nos iPSCs. Além disso, a reprogramação baseada em virais impede a aplicação translacional de iPSCs. Os sistemas baseados em RNA15 e a entrega direta deproteínas 16 foram explorados para eliminar completamente os riscos potenciais associados ao uso de vírus e transfecções de DNA. No entanto, esses métodos têm se mostrado ineficientes.
Em 2011, Okita et al. relataram maior eficiência de reprogramação por plasmídeos episômicos aumentados com supressão TP53 via shRNA. Eles também substituíram o cMYC por LMYC não transformador (carcinoma pulmonar de células pequenas associados myc) para aumentar a segurança dos hiPSCs. Estes plasmídeos episômicos expressam 5 fatores de reprogramação: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC e shRNA para TP5317,18. Esses vetores são mantidos extra-cromosomally e perdidos das células reprogramadas sobre a cultura contínua, tornando as linhas livres de transgene dentro de 10-15 passagens. A nucleofecção é uma forma especializada de eletroporação que fornece ácidos nucleicos diretamente no núcleo das células hospedeiras. É um método eficiente para a entrega dos plasmídeos de reprogramação em vários tipos de células. Plasmídeos episômicos são econômicos e compensam os altos custos de nucleosfeição. Este método é eficiente e reprodutível em condições otimizadas, produzindo iPSCs estáveis de uma variedade de células somáticas. Neste protocolo, descrevemos o método de geração de iPSCs a partir de fibroblastos isolados do tecido fetal por nucleofecção de plasmídeos de reprogramação epissomal. Aqui estão os protocolos detalhados para o isolamento do fibroblasto a partir de villi coriônico fetal, purificação plasmida, nucleofecção, colheita de colônias da placa de reprogramação e estabelecimento de iPSCs estáveis.
É essencial confirmar a presença de traços de pluripotência nos iPSCs recém-gerados. Isso inclui a demonstração de fatores relacionados à pluripotência (por exemplo, expressão alcalina fosfatase, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; geralmente mostrado com imunofluorescência ou ensaios de expressão genética), identificação das três camadas de germes por ensaios de diferenciação in vitro para validar seus potenciais de diferenciação, karyotyping para determinar conteúdo cromossômico, digitação STR para estabelecer identidade com células-pais, verificar perda de genes exógenos, e ensaios in vivo mais rigorosos, como formação de teratoma e complementação tetraploide. Aqui descrevemos protocolos de caracterização de kariotipagem, coloração alcalina de fosfatese de células vivas, detecção de biomarcadores relacionados à pluripotência por imunofluorescência, ensaios de diferenciação in vitro e método para demonstrar perda de genes exógenos19.

<table><tbody><tr><td>0,15% tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>4 ', 6 diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Ensaios</td></tr> <tr><td>de diferenciaçãoFosfatase alcalina Mancha viva</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>Coloração AP</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td><td></td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II meio completo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Meio específico para culturas de células de vilosidades coriônicas fetais</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Controle de contaminação</td></tr><tr><td>Anti-E-Caderina</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-OCT3/4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>560073</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos Básico [FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Meio de pluripotência</td></tr><tr><td>Fator Morfogenético Ósseo 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>bovino Albumina sérica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Bloqueando</td></tr><tr><td>o colágeno tipo humano IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354245</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>Mistura de colagenase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Digestão de vilosidades coriônicas fetais</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Digestão de restrição</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>Giemsa Mancha</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Bandagem</td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Fixador para cariótipo</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>Solução de insulina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>Insulina Transferrina Selenita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15210040</td><td>Parada mitótica para cariótipo</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>KnockOut Substituição</td> de soro <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>ágar Luria Bertani</td><td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Purificação de plasmídeos</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Fixador para cariótipo</td></tr><tr><td>Cadeia pesada ventricular de miosina &alfa;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>NHDF Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nucleofecção</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Células de fixação</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Reprogramação episômica Plasmídeo</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Plasmídeo de reprogramação episômica</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Reprogramação episômica Plasmídeo</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific,</td><td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotência e meio corporal embrióide</td></tr><tr><td>Faloidina- Tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 comprimido de PBS dissolvido em 200mL de água deionizada e esterilizado em autoclavagem Armazenamento: Temperatura ambiente. PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS. Armazenamento: Temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Kit de purificação de plasmídeo - preparação midi</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td> Solução de cloreto de potássio de <td>purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td></td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Solução hipotônica para cariótipo</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Isolamento de DNA genômico</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Meio de diferenciação de hepatócitos</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Solução hipotônica para cariotipagem</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Permeabilização</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>Subcultura de &nbsp; fibroblastos de vilosidades coriônicas fetais</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Preparação de PBST</td></tr><tr><td>&beta; III tubulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Imunocitoquímica</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Ensaios de diferenciação</td></tr></tbody></table>

geração de células-tronco pluripotentes induzidas da síndrome de turner (45xo) células fetais para modelagem a jusante de déficits neurológicos associados à síndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Aneuploidies cromossômicos causam malformações congênitas graves, incluindo malformações do sistema nervoso central e morte fetal. O rastreamento genético pré-natal é puramente diagnóstico e não elucida mecanismo da doença. Embora as células de fetos aneuploides sejam materiais biológicos valiosos que suportam a aneuploide cromossômica, essas células têm vida curta, limitando seu uso para experimentos de pesquisa a jusante. A geração de modelos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) é um método eficaz de preparação celular para conservação perpétua de traços aneuploides. São auto-renovados e diferenciados em células especializadas que lembram o desenvolvimento embrionário. Assim, os iPSCs servem como excelentes ferramentas para estudar eventos de desenvolvimento precoce. Síndrome de Turner (TS) é uma condição rara associada a um cromossomo X completamente ou parcialmente ausente. A síndrome é caracterizada por infertilidade, baixa estatura, endócrina, metabolica, autoimune e doenças cardiovasculares e defeitos neurocognitivos. O protocolo a seguir descreve o isolamento e a culminação de fibroblastos do tecido fetal TS (45XO), geração de TSiPSCs livres de integração através da entrega de plasmídeos de reprogramação epissomal por nucleosfeitivo seguido de caracterização. Os TSiPSCs de reprogramação foram inicialmente examinados por manchas de fosfatesas alcalinas de células vivas seguidas de sondagem extensiva para biomarcadores de pluripotência. Colônias selecionadas foram dissecadas mecanicamente, passagens várias vezes e células estáveis de auto-renovação foram utilizadas para outros experimentos. As células expressaram fatores de transcrição de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superfície celular SSEA 4 e TRA1-81 típicos de células-tronco pluripotentes. O karyotype 45XO original foi mantido após a reprogramação. Os TSiPSCs foram capazes de formar corpos embrionários e diferenciar-se em células de endoderme, mesoderme e ectoderme expressando biomarcadores específicos de linhagem ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Os plasmídeos episômicos exógenos foram perdidos espontaneamente e não detectados após a passagem 15 nas células. Estes TSiPSCs são um recurso celular valioso para modelar neurodesenvolvimento molecular e celular defeituoso causando déficits neurocognitivos associados à síndrome de Turner.

Geração de iPSCs livres de integração de um feto abortado espontaneamente com karyótipo 45XO Isolamos os fibroblastos da FCV com uma síndrome de Turner (TS) específica do karyótipo 45XO e os nucleofectamos com plasmídeos de reprogramação epissomal para gerar TSiPSCs que podem ser usados para modelagem a jusante da síndrome, especificamente os déficits neurológicos associados(Figura 1a&amp;b). Utilizamos vetores episômicos não intencionais e nucleofecção p...

Este protocolo descreve a geração de iPSCs livres de integração a partir de fibroblastos de tecido fetal através da entrega de plasmídeos epissomais por nucleofecção seguida pela descrição dos métodos utilizados para caracterização do iPSC e diferenciação neuronal.

Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas da Síndrome de Turner (45XO) Células Fetais para Modelagem A Jusante de Déficits Neurológicos Associados à Síndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Síndrome de Turner é uma condição rara associada a um cromossomo X completamente ou parcialmente ausente. A síndrome é caracterizada por infertilidade, baixa estatura, doenças cardiovasculares e defeitos neurocognitivos. Em alguns casos, causa morte fetal.Embora as células somáticas dos fetos aneuploides sejam biologicamente valiosas, elas são de curta duração, limitando assim seu uso em pesquisas. A geração de iPSC é, portanto, um método eficaz de preparação celular para a conservação perpétua dos traços aneuploides. Eles são auto-renovados e podem se diferenciar em tipos de células especializadas que lembram o desenvolvimento embrionário precoce.A entrega de plasmídeos de reprogramação episômica não integrados através da ficção nuclear é um método eficiente e reprodutível para gerar iPSCs completamente reprogramados e estáveis. Este método também pode ser usado em células de difícil programa. Neste protocolo descrevemos a regeneração de iPSCs a partir de material fetal com aneupliod.Transfira o villi coriônico fetal coletado para uma placa de Petri estéril. Lave-o várias vezes com PBS contendo solução antimicomótica antibiótico 1X. Remova o PBS completamente por pipetação.Adicione 1 ml de mistura de colagenase ao villi e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que o tecido se desintegre. Após a incubação, neutralize a colagem adicionando mídia contendo soro bovino 10% fetal. Transfira o conteúdo da placa de Petri em um tubo de 15 ml.Centrifugar o digestor para coletar o villi desintegrado e células liberadas. Decante o supernatante com cuidado. Placa desintegrou villi junto com células liberadas em um frasco de cultura T25 e mídia AmnioMAX e crescer até que uma cultura fibroblasto confluente é obtida.Expandir os fibroblastos e a cultura para preparar estoques para uso em experimentos subsequentes de transfecção e caracterização. Prepare culturas de alcalino contendo os plasmídeos reprogramantes. Isole os plasmídeos usando o kit de purificação de plasmídeos Midi, de acordo com as instruções do fabricante.Suspenda-se cada palete em volume adequado de água livre DNAse RNAse para obter uma concentração final de 1 micrograma por mililitro. Verifique os plasmídeos usando o kit de digestão de restrição ECoR1, seguindo as instruções do fabricante. Trypsinize os fibroblastos de villi coriônicos.Neutralizar e centrífuga para coletar as células. Decante o supernasce, e suspenda as células em 5 ml OPTI-MEM. Conte as células usando um hemótmetro, e remova 1 milhão de células para nucleofeiciação.Centrífuga para obter palete celular. Realize a nucleofecção usando o Kit Neucleófico Amaxa NHDF. Prepare o reagente neucleófato misturando suplemento de 0,5 mL e solução nucleófato de 2,25 mL fornecida no kit.Remova 100 microliters de solução nucleofato e adicione 1 micrograma de cada plasmídeo a ele. Levemente suspender 1 milhão de células nesta mistura. Transfira a suspensão do DNA celular para cuvette, garantindo que a amostra cubra a parte inferior do cuvette sem bolhas de ar.Tampe a cuvette e insira no suporte. Selecione o programa nucleofato D-23 para alta eficiência e aplique. Retire o cuvette do suporte e adicione 1 mL de mídia AmnioMAX.Transfira o conteúdo suavemente para uma placa de Petri tratada com cultura tecidual, utilizando a pipeta fornecida no kit. Incubar as células em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius. Mantenha as células em mídia AmnioMAX por 10 dias e, em seguida, mude para o meio de pluripotência por 20 dias.Para a expansão do iPSC, disseque manualmente as colônias embrionárias semelhantes a células-tronco formadas no prato de reprogramação usando uma pipeta de vidro puxada. Propigue iPSCs adequadamente, e massageie a cada cinco ou sete dias. Os IPCA foram positivos para a fosfatase alcalina marcador de pluripotência.Gerar corpos embrionários cortando as colônias iPSC em pequenos pedaços e emplacando-as em placas de Petri de baixa fixação em meio corporal embrionário. A diferenciação do ectoderm é induzida pelo dia do emplacamento quatro corpos embrionários no meio de diferenciação de ectoderm. Da mesma forma, a diferenciação do mesoderm é induzida pelo dia de chapeamento de oito corpos embrionários no meio de diferenciação de mesoderm.Para induzir a diferenciação de endoderm, a cultura iPSCs em uma monocamadas em meio de diferenciação de endoderm. Alterações morfológicas nos fibroblastos foram monitoradas ao longo da reprogramação. Eles expressam morfologia epitelial semelhante a células e formaram colônias compactas.As células também tinham um núcleo de altura para a razão citoplasmática, típica de células pluripotentes na cultura. Os iPSCs possuíam um tipo de porta-aviões 45 XO e foram positivos para marcadores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 e E-CADHERIN. As células foram manchadas por marcadores representativos de camada de germes.A Síndrome de Turner desenvolve assim déficits neurocognitivos. Neurônios derivados da Síndrome de Turner iPSC podem ser um excelente modelo. Isto é modelado em uma placa de petri para entender a nova linha da síndrome de Turner desassociativa normal.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo mostra o procedimento para gerar células-tronco pluripotentes induzidas usando lentivírus induzível que expressam Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4.

Geração de iPS a partir de células MEFS através da expressão forçada de Sox-2, Oct-4, c-Myc e KLF4

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Um método simples e confiável sobre o isolamento e cultura de células-tronco neurais de tecido fetal humano descartado cortical é descrito. Derivados de culturas humanas conhecidas doenças neurológicas podem ser usados ​​para a caracterização de processos patológicos celular e molecular, bem como fornecer uma plataforma para avaliar a eficácia farmacológica.

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Este protocolo envolve procedimentos detalhados para isolamento de células derivadas de urina de pacientes com distrofia muscular; sua reprogramação eficiente e rápida através da transdução do vírus Sendai.

Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas

Este protocolo descreve como as células progenitoras neurais podem ser diferenciadas das células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, a fim de produzir uma população de células neurais robusta e replicativa, que pode ser usada para identificar as vias de desenvolvimento que contribuem para a patogênese da doença em muitos distúrbios neurológicos.

Um Guia para a geração e uso hiPSC NPCs derivados para o Estudo das Doenças Neurológicas

Neste estudo, geramos células-tronco pluripotentes induzidas a partir de células de líquido amniótico de camundongo, usando um sistema de transposon baseado em não vírus.

A produção de células-tronco pluripotentes de rato amniótico células do líquido Usando um Sistema Transposon

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Este protocolo descreve a reprogramação de primário amniótico fluido e membrana mesenquimais células-tronco em células-tronco pluripotentes induzidas usando uma abordagem epissomal não-integrando em condições totalmente quimicamente definidas. Procedimentos de extração, cultura, reprogramação e caracterização das células-tronco pluripotentes induzidas resultante por métodos rigorosos são detalhados.

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Descrevemos um protocolo para reprogramar fibroblastos derivados da pele humana em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs), e sua subsequente diferenciação em Astrocitos induzidos (iAs). Este método leva a uma geração rápida e reprodutível de iNPCs e iAs em grandes quantidades.

Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

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In vitro Modelagem da Neurogênese da Síndrome de Down Usando Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aqui descrevemos um protocolo que facilita a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em astrócitos funcionais específicos do prosencéfalo. Isso permite investigações sobre o papel das células gliais na patogênese de distúrbios do neurodesenvolvimento, como a Síndrome do X Frágil, e modelagem de outros distúrbios cerebrais.

Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de integração a partir de fibroblastos fetais usando plasmídeos episomais e nucleofecção. Este método permite modelar déficits neurológicos da síndrome de Turner.

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Geração de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas da Síndrome de Turner (45XO) Células Fetais para Modelagem A Jusante de Déficits Neurológicos Associados à Síndrome

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