Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Este protocolo usa dois ensaios semiautomatados diferentes para quantificar rapidamente a atividade locomotor de C.elegans em meio líquido, e tem o potencial de ser aplicado para rastreamento de medicamentos em modelos de doença de C.elegans. As principais vantagens dessas duas técnicas são sua facilidade de uso e facilidade de reprodutibilidade. Ambas as técnicas têm o potencial de avaliar os efeitos medicamentosos no comportamento dos vermes com rendimento variável.

Estes ensaios de motilidade são úteis para avaliar a atividade locomotor dos modelos de doença mitocondrial C.elegans em que o sistema neuromuscular dos animais é prejudicado. Para analisar a atividade locomotor de C.elegans em meio líquido em lâminas de vidro após sincronizar o controle em cepas de vermes mutantes em placas de NGM com e sem tratamentos medicamentosos de interesse para o estágio L4, use uma picareta de vermes e um estereomicroscópio para colher cinco vermes por cepa e condicionar em 20 gotas de microliter individuais de solução S.basal em um slide de vidro. Adicione vermes da mesma condição experimental de diferentes placas de NGM a várias gotículas no mesmo slide para obter múltiplas réplicas técnicas.

Quando todos os vermes tiverem sido coletados, permita que os animais se aclimatem no slide por um minuto à temperatura ambiente antes de registrar a atividade de natação dos vermes em cada gota por um minuto a 15 quadros por segundo por gota. Para analisar a atividade locomotor C.elegans gravada usando o software ZebraLab, use a opção ZEBRALAB AVI para enviar vídeos para o software. Clique na opção Quantização com Arquivos AVI.

Para criar um novo protocolo, selecione Parâmetros, Parâmetros de Protocolo e Tempo e defina a duração do experimento para um minuto. Selecione No Time Bin e desmarque o Período de Integração de acordo com a saída de dados desejada e selecione Arquivo e Abra um filme para carregar cada arquivo de vídeo gravado anteriormente. Para construir uma única área de detecção, use a ferramenta círculo para criar uma área em torno de toda a gota líquida na qual os vermes estão localizados.

A atividade de todos os vermes dentro da área selecionada será detectada. Para indicar a distância para calibrar, desenhe uma linha horizontal da esquerda para a direita da área de vídeo e selecione Calibração, Desenhe e Aplique ao Grupo. Para permitir a detecção de todas as diferentes cepas de worms C.elegans a serem analisadas, desmarque o ícone de Área e ajuste a Sensibilidade de Detecção no Limiar de Atividade.

Para visualizar as faixas feitas pelos animais enquanto a análise de atividade está em andamento, defina a Escala de Exibição para 70 e selecione Aplicar ao Grupo. Para analisar os vídeos, clique em Reproduzir e selecione Experimentar e Executar para inserir um nome de arquivo para o vídeo. Após a salvação, uma janela aparecerá perguntando se analisará o vídeo na velocidade máxima do computador.

Clique em Sim. A janela de experimentos será aberta. Clique em Iniciar.

Quando a análise de gravação estiver concluída, clique em Experimentar e pare para salvar a atividade analisada na gota em uma planilha. Para analisar a atividade locomotor C.elegans em meio líquido em um formato de placa de 96 poços, quando os vermes atingiram o estágio L4, adicione 50 microliters de 2% de peso por volume de E.coli OP50 e meio S.basal para cada poço de uma microplaca inferior plana clara de 96 poços. Use o estereómico para escolher manualmente 15 worms sincronizados por poço da placa de 96 poços e permitir que os vermes se aclimatem por 20 minutos.

No final do período de aclimatação, use um scanner padrão para digitalizar cada microplaca duas vezes com menos de 10 segundos entre as varreduras Para analisar as varreduras, use um software de código aberto para alinhar as duas varreduras sequenciais e adquirir os dados de mudança de pixel entre as duas imagens e a pontuação relativa de varredura de worm para determinar as alterações na resposta locomotor com base na intensidade de luz produzida pelo scanner quando definido para um pixel limiar de cinco. Nesta análise da atividade locomotor de C.elegans em uma única gota de meio líquido, os vermes do complexo mitocondrial I demonstraram uma diminuição significativa de 38% em sua atividade locomotor no estágio L4 em comparação com vermes do tipo selvagem. Da mesma forma, a análise de varredura de vermes das mesmas populações mostrou uma redução significativa na atividade locomotor para os vermes modelo de doença estágio L4 em comparação com vermes do tipo selvagem N2 Bristol.

Essa perda de atividade locomotiva também foi observada no primeiro dia adulto, em um estágio mitocondrial complexo I, conforme avaliado pela análise de vermes. É essencial lembrar de usar o número correto de worms ao configurar cada ensaio. Após este procedimento, nosso laboratório frequentemente realiza uma triagem de drogas.

Estas duas técnicas são utilizadas em nosso laboratório para avaliar os efeitos de drogas de interesse na atividade de vermes em modelos animais pré-clínicos da doença mitocondrial.