Entrega do Complexo cas9/sgRNA Ribonucleoproteína em Células Imortalizadas e Primárias através de Partículas semelhantes a vírus ("Nanoblades")
31 de março de 2021
Desenvolvemos um protocolo simples e barato para carregar complexos de ribonucleoproteína Cas9/guia único (sgRNA) dentro de partículas semelhantes a vírus. Essas partículas, chamadas "Nanoblades", permitem a entrega eficiente do complexo Cas9/sgRNA em células imortalizadas e primárias, bem como in vivo.
Os nanoblades permitiram a entrega rápida, eficiente e dependente de doses do complexo Cas9 e guiar o RNA, tanto em células imortalizadas quanto em células primárias, e na ausência de anti-transgene. A principal vantagem deste método é que os nanoblados são fáceis e relativamente baratos de se preparar. Eles podem entregar o Cas9 e guiar o complexo de RNA de forma dependente de dose e transitória, limitando assim os efeitos fora do alvo, permitindo a edição eficiente do genoma.
O protocolo de preparação para nanoblades é muito simples. No entanto, a qualidade das células produtoras, bem como sua origem e sua semeação antes da transfecção, são essenciais para obter altos rendimentos de partículas semelhantes a vírus. Demonstrando o procedimento estará Laura Guiguettaz, engenheira do meu laboratório.
No primeiro dia, sementes 3,5 a 4 milhões de células HEK 293T em 10 mililitros de DMEM modificados e estreptomicina penicilina em um prato de cultura celular de 10 centímetros. Após 24 horas, quando as células atingirem 70% de confluência, substitua o meio por DMEM fresco e use uma pipeta P-1000 para adicionar solução de reagente de transfecção de forma em gota. Comece a colher nanobladas no quarto dia coletando o supernanato médio da cultura com uma pipeta de 10 mililitros.
É normal que a cor do meio cultural se transforme em amarelo nesta fase. Centrifugar o supernante coletado a 500 G por cinco minutos para remover detritos celulares, e recuperar nove mililitros do supernatante sem perturbar a pelota celular. Pellte os nanoblades em um ultracentrifuuge a 209, 490 G por 75 minutos a quatro graus Celsius.
Após a centrifugação, aspire lentamente o meio e resuspenque a pelota branca com 100 microliters de PBS frio. Cubra o tubo com parafilm e incubar por uma hora a quatro graus Celsius com agitação suave. Em seguida, resuspense a pelota novamente, pipetting para cima e para baixo.
Prepare uma solução de 10% de sacarose em PBS e filtre-a através de um filtro de seringa de 0,2 micrômetro. Coloque 2,5 mililitros de 10% de sacarose em um tubo ultracentrífuga. Incline o tubo e adicione lentamente os nove mililitros da amostra contendo VLP com uma pipeta de baixa velocidade enquanto eleva progressivamente o tubo para uma posição vertical.
Coloque tubos nos baldes de rotor, depois centrifufique as amostras a 209, 490 G por 90 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenatante cuidadosamente e coloque o tubo de cabeça para baixo no papel de tecido para remover qualquer líquido restante. Para fins didáticos e melhor visualização da pelota viral, nanoblades carregados com a proteína fluorescente mCherry podem ser preparados.
Após um minuto, adicione 100 microliters de PBS. Coloque o tubo com uma tampa de parafilm em um suporte de tubo em uma mesa de agitação por uma hora a quatro graus Celsius, e resuspenque a pelota pipeta para cima e para baixo. Prepare o tampão de diluição adicionando um volume de tampão de lise contendo um surfactante não iônico em quatro volumes de PBS.
Diluir dois microliters de nanoblados concentrados em 50 microliters de tampão de diluição e vórtice brevemente. Transfira 25 microliters da mistura para um novo tubo contendo 25 microliters de tampão de diluição e repita o procedimento para ter seis tubos de diluições de nanoblade. Faça o controle padrão adicionando dois microliters de nuclease Cas9 recombinante em 50 microliters de tampão de diluição, vórtice brevemente, e fazer oito diluições seriais.
Detectar 2,5 microliters de cada diluição VLP, e 2,5 microliters de cada padrão em uma membrana nitrocelulose cuidadosamente com uma pipeta multicanal. Uma vez absorvidas as partículas, bloqueie a membrana com TBST suplementada com leite seco de 5% sem gordura por 45 minutos em temperatura ambiente. Descarte o TBST e incubar a membrana durante a noite a quatro graus Celsius com o anticorpo peroxidase de rabanete Cas9.
Lave a membrana três vezes com TBST e visualize o sinal usando um kit de substrato de chemiluminescente aprimorado. Para transdução de células-alvo por nanoblados, substitua o meio de cultura celular por 500 microlitres do meio contendo nanobladas purificadas. Após quatro a seis horas de incubação celular, substitua o meio à quantidade normal de meio fresco.
No protocolo, as células foram semeadas para distribuição homogênea com confluência de 70 a 80% no dia da transfecção, formando sincronia levando a células maiores com múltiplos núcleos após 24 horas. 40 horas após a transfecção, a maioria das células formaram sincronia e começaram a se desprender da placa. A quantidade de Cas9 carregada dentro de nanoblades foi quantificada usando uma mancha de ponto em uma membrana nitrocelulose, que exibiu quimiominascência aprimorada em comparação com a referência recombinante Cas9.
Uma curva de calibração foi traçada para o sinal de quimiominascência quantificada para diluições cas9 recombinantes contra a quantidade conhecida de Cas9. Em seguida, foi mapeada a concentração de proteínas Cas9 em cada preparação de nanoblade, revelando diferentes concentrações de Cas9 de lote em lote. O ensaio endonuclease T7 demonstrou que a eficiência dos nanoblades pode diferir de lote para lote.
Por exemplo, observou-se que um lote tinha 20% de eficiência de edição global, enquanto o outro lote apresentava 60% de eficiência. As proteínas flag-DDX3 foram imuno-precipitadas usando contas anti-bandeira agarose, seguidas pela análise ocidental das proteínas recuperadas usando um anticorpo anti-bandeira. A inserção direcionada ao local da tag de bandeira no lócus DDX3 também foi avaliada pelo PCR usando primers flanqueando o local de inserção, ou primers avançados e invertidos específicos do lócus DDX3 a jusante do local de inserção da bandeira.
É importante colocar as células em uma confluência correta, e obter uma distribuição uniforme das células. Após a centrifugação de nanoblade, também é importante resuspensar a pelota e obter uma amostra homogênea de partículas virais concentradas. Os nanoblades permitiram que os cientistas estudassem o mecanismo de reparação de quebra de DNA de dupla fita, fornecendo o Cas9 e guiando o complexo de RNA para loci genômica específica de forma rápida e coordenada.
Eles também permitiram inativar RNAs de longa não codificação em células primárias do sistema imunológico inato, a fim de estudar seu papel.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a preparação e aplicação de "Nanoblades" — partículas semelhantes a vírus (VLPs) projetadas para entregar o complexo proteína Cas9 e RNA guia único (sgRNA) para edição do genoma. Os Nanoblades oferecem um método transitório, eficiente e dependente de dose para a entrega de CRISPR-Cas9 em células imortalizadas e primárias, superando várias limitações dos vetores virais clássicos.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Edição genômica
- Biologia molecular
- Biologia celular
- Tecnologias de entrega gênica
Contexto
- O CRISPR-Cas9 revolucionou a edição do genoma em células eucarióticas.
- Vetores virais tradicionais (por exemplo, lentivírus, AAVs) entregam eficientemente Cas9 e sgRNA, mas apresentam desvantagens como integração genômica, capacidade limitada de carga e expressão prolongada.
- A entrega transitória de complexos Cas9/sgRNA pode reduzir efeitos fora do alvo e evitar modificações genéticas permanentes.
- Os Nanoblades são partículas virais semelhantes a vírus (VLPs) baseadas no vírus da leucemia murina (MLV) que entregam Cas9/sgRNA sem codificar transgenes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver e demonstrar um protocolo simples, eficiente e econômico para a produção de Nanoblades.
- Permitir a entrega rápida e transitória de complexos Cas9/sgRNA a diversos tipos celulares.
- Fornecer um método que minimize efeitos fora do alvo e evite a integração de DNA estranho.
Métodos Utilizados
- Produção de Nanoblades mediante transfeção de células HEK 293T com plasmídeos que codificam proteínas de fusão Gag-Cas9 e sgRNA.
- Coleta e purificação de VLPs do sobrenadante de cultura utilizando ultracentrifugação e travesseiro de sacarose.
- Quantificação do conteúdo de Cas9 em Nanoblades por meio de dot blot e análise de quimiluminescência.
- Transdução de células-alvo com Nanoblades purificados e avaliação da eficiência de edição genômica utilizando ensaio de endonuclease T7 e PCR.
Resultados Principais
- Os nanoblades permitem entrega rápida, eficiente e dependente da dose de complexos Cas9/sgRNA a células imortalizadas e primárias.
- O protocolo é simples e de baixo custo, adequado para a maioria dos laboratórios de biologia celular.
- Foi observada variabilidade entre lotes na carga de Cas9 e na eficiência de edição, destacando a importância do controle de qualidade.
- Os nanoblades facilitaram a edição direcionada do genoma, incluindo inserção em sítios específicos e inativação de genes específicos e RNAs não codificantes.
Conclusões
- As Nanoblades fornecem uma plataforma versátil e transitória de entrega de CRISPR-Cas9 que evita as desvantagens dos vetores virais clássicos.
- O método é acessível, escalonável e adaptável para diversas aplicações de edição genômica in vitro e in vivo.
- O correto semeadura celular, ressuspendimento do pellet e controle de qualidade são fundamentais para a produção e desempenho ideais das Nanoblades.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A entrega eficiente e transitória de complexos de edição genômica é um gargalo crítico na descoberta terapêutica em estágios iniciais e na genômica funcional. Nanoblades — partículas semelhantes a vírus que entregam ribonucleoproteínas Cas9/sgRNA — reduzem o risco de integração e os efeitos fora do alvo, apoiando testes rápidos de hipóteses e a eliminação de riscos mecanicistas. Esta plataforma permite edição genômica escalonável e reprodutível em células imortalizadas e primárias, impactando diretamente a validação de alvos e o desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite interrogar rapidamente a função gênica por meio de edição transiente e não integrativa do genoma.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao minimizar a expressão persistente de Cas9 e atividade fora do alvo.
- Facilita a validação funcional de alvos em sistemas celulares primários e relevantes para doenças.
- Aprimora a confiança preditiva para o triagem downstream da carteira.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas celulares validados para triagem de alto conteúdo e ensaios fenotípicos.
- Fornece saídas de edição quantitativas e dependentes da dose para padronização de ensaios.
- Permite fluxos de trabalho reproduzíveis e escalonáveis para avaliação de compostos e perturbações genéticas.
- Reduz efeitos de confusão decorrentes da integração de transgenes ou atividade prolongada de nucleases.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a edição do genoma com modelos relevantes para doenças em estudos translacionais de biomarcadores.
- Apóia a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica mediante a edição in vivo.
- Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco com base em modificações gênicas transitórias e controladas.
- Permite estudos funcionais de RNAs não codificantes e vias de reparo do DNA em células primárias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
As nanolâminas atuam na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, integrando a validação de alvos, o desenvolvimento de ensaios e a geração de modelos translacionais.
- Biologia de Descoberta: Fornece edição gênica rápida e livre de integração para testes de hipóteses e análise de vias.
- Telagem: Oferece edição padronizada e quantitativa para preparo de ensaios e reprodutibilidade.
- Análises: Permite a quantificação específica por lote do conteúdo de Cas9 e da eficiência de edição para comparação robusta de dados.
- Pesquisa Translacional: Apoia a edição genômica in vivo e genômica funcional em sistemas primários e relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma amplamente adaptável e de baixo custo para uso repetido em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de função gênica.
- Valor Operacional: Simplifica o preparo, padroniza a entrega e melhora a reprodutibilidade entre experimentos.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de prosseguir ou interromper projetos e a eficiência do capital ao minimizar riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos e modelos validados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, produção de partículas tipo vírus (VLP) e análises de edição genômica.
- Exige acesso a infraestrutura de ultracentrifugação e quantificação por quimiluminescência.
- Exige controle de qualidade rigoroso lote a lote para a carga de Cas9 e eficiência de edição.
- A padronização do semeadura celular e da ressuspensão de VLPs é essencial para a reprodutibilidade.
- A eficiência de edição e a reprodutibilidade podem variar conforme o tipo celular e a qualidade do lote.
