Name: Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Aprenda a modelar metástase cerebral em camundongos usando injeção na veia caudal de células de câncer de mama inflamatório. Este método reproduz fielmente a colonização metastática cerebral para pesquisa oncológica.

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Agradecemos a Christine F. Wogan, MS, ELS, da Divisão de Oncologia por Radiação do MD Anderson, pela edição científica do manuscrito, e a Carol M. Johnston, do Núcleo de Histologia da Divisão de Cirurgia do MD Anderson, pelo auxílio na coloração de hematoxilina e eosina. Somos gratos ao Núcleo de Medicina e Cirurgia Veterinária do MD Anderson por seu apoio aos estudos com animais. Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 para BGD), American Cancer Society Research Scholar grant (RSG-19–126–01 para BGD) e State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Também apoiado em parte pelo Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 do Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde, para o Centro de Câncer MD Anderson da Universidade do Texas.

O método aqui descrito foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do MD Anderson Cancer Center e está em conformidade com as Diretrizes do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O fluxo de trabalho esquemático, com todas as etapas incluídas, é apresentado como Figura 1.
1. Preparação celular
NOTA: A linhagem celular MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), gerada no laboratório24 do Dr. Woodward, foi transduzida de forma estável com um plasmídeo de proteína fluorescente verde luciferase (Luc-GFP).
<ol><li>Cultura de células transduzidas em meio F-12 de Ham, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina e 1% de antibiótico-antimitótico.</li>
	<li>Placa MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C e 5% CO2 em frasco T-75 até confluente. Troque de meio a cada 3 dias antes que as células sejam confluentes o suficiente para passar.</li>
	<li>Colher as células removendo o meio, lavando cada frasco com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco (i.e., isento de cálcio e magnésio) e adicionando 2 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%. Incubar durante 3-5 minutos a 37 °C até que as células se desprendam.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de meio completo ao balão para coletar as células e transferir todo o conteúdo para um tubo de centrífuga de 15 mL (otimizado para 50 mL de tubo de centrífuga, dependendo do número total de células necessárias). Centrifugar a 290 x g por 5 min para células de pellets. NOTA: O meio completo é o meio F-12 de Ham, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina e 1% de antibiótico-antimitótico.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células com 10 mL de 1x DPBS. Centrifugar a 290 x g por 5 min para peletizar as células e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Ressuspenda as células com 1 mL de 1x DPBS fresco e misture bem pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Para fazer suspensões de célula única, filtre as células através de filtros de células estéreis de 40 μm.</li>
	<li>Calcule a densidade celular usando um contador de células automatizado. NOTA: Para reduzir os erros na contagem, crie diferentes diluições de células e conte-as separadamente e calcule o valor médio para determinar a concentração de células (número de células/mL).<ol><li>Recolher 2 μL de suspensão celular + 8 μL de 1x DPBS para fazer uma amostra de diluição 1:5.</li>
		<li>Recolher 1 μL de suspensão celular + 9 μL de 1x DPBS para fazer uma amostra de diluição 1:10.</li>
		<li>Adicionar 10 μL de coloração azul de tripano a 0,4%. Misture bem a mistura da amostra, pipetando-a para cima e para baixo algumas vezes.</li>
		<li>Pipetar suavemente 10 μL da amostra para a área de carregamento da amostra em forma de meia-lua das lâminas da câmara de contagem. Certifique-se de que não há bolhas dentro; Aguarde 30 s para permitir que as celas se acomodem na câmara antes de contar.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir as células com 1x DPBS para uma densidade de 5 x 105 ou 1 x 106 células por 100 μL. Transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL para injeção na veia caudal. Coloque as células no gelo até a injeção para manter a viabilidade.</li>
</ol>2. Injeção da veia caudal
<ol><li>Use camundongos SCID/bege fêmeas de 4 a 6 semanas de idade.</li>
	<li>Prepare uma seringa de 30 G para retirar 100 μL de suspensão celular. Remova todas as bolhas de ar.</li>
	<li>Coloque o rato num redutor de roedores (diâmetro de cerca de 1 polegada) para facilitar a injeção da veia caudal e evitar lesões durante o processo de injeção.</li>
	<li>Use almofadas de algodão com álcool (feitas com etanol 70%) para limpar suavemente a cauda do rato 3-4 vezes e segure por 5-10 s para tornar a veia da cauda mais claramente visível.</li>
	<li>Introduza a seringa na cauda do rato num ângulo de 15-30°. Empurre lentamente a suspensão celular para a veia da cauda.</li>
	<li>Retire a seringa suavemente e use o algodão para segurar a cauda por alguns segundos para ajudar a parar qualquer sangramento.</li>
	<li>Devolva os ratos às suas gaiolas e verifique-os 2-4 h após a injeção para garantir que não ocorram efeitos adversos.</li>
</ol>3. Avaliação da carga de metástases cerebrais
<ol><li>Preparar solução diluída de D-luciferina. NOTA: A concentração de estoque é de 47,6 mM (15,15 mg/mL), e a concentração para uso é de 1,515 mg/mL.<ol><li>Adicionar 5 mL de 1x DPBS ao frasco de D-luciferina.</li>
		<li>Colocar 2,5 ml da solução em cada um dos dois tubos cónicos de 50 ml.</li>
		<li>Adicione mais 5 mL de 1x DPBS ao frasco de D-luciferina novamente para enxaguar. Colocar 2,5 mL em cada tubo cônico de 50 mL.</li>
		<li>Coloque mais 5 mL de 1x DPBS no frasco e enxágue novamente. Repita o processo de enxágue duas vezes.</li>
		<li>Adicione 1x DPBS a cada tubo de 50 mL para um total de 66 mL (cerca de 33 mL por tubo). Deve haver cerca de 33 mL da solução em cada tubo.</li>
		<li>Misture bem os tubos e, em seguida, combine ambos em uma unidade de filtração estéril (filtro de PES de 150 mL 0,45 μm).</li>
		<li>Filtrar a solução e, em seguida, aliquotar a solução filtrada em microtubos âmbar estéreis de 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de metástases cerebrais por imagem de luciferase.<ol><li>Descongelar a D-luciferina mantendo o gelo e o vórtice antes da injeção nos ratos.</li>
		<li>Limpe a área de injeção com almofadas de algodão de álcool e injete 100 μL de D-luciferina por camundongo por via intraperitoneal usando uma seringa de insulina de 0,5 mL, uma seringa para cada gaiola.</li>
		<li>Após 10 min, anestesiar os camundongos com isoflurano (2% O 2-2,5% isoflurano) por 5 min usando o vaporizador veterinário conectado à câmara de indução do pequeno animal.</li>
		<li>Ligue o sistema de imagem in vivo. Enquanto os camundongos da primeira gaiola estiverem sob anestesia, injete a D-luciferina nos camundongos da próxima gaiola.</li>
		<li>Coloque camundongos na máquina do sistema de imagem in vivo e obtenha imagens ventrais e dorsais. Selecione um tempo de exposição de 2 min e, na visualização de campo, escolha a opção E (corpo inteiro). Pressione Adquirir. Em seguida, salve a imagem (Figura 2). NOTA: Se a imagem apresentar saturação de luminescência, reduza o tempo de exposição.</li>
	</ol></li>
	<li>Detecção de metástases cerebrais por imagem de GFP.<ol><li>Preparação do tecido cerebral.<ol><li>Cerca de 8-10 semanas após a injeção de células ou quando os camundongos estão moribundos devido à carga de metástase cerebral, eutanasiar os camundongos por inalação de uma overdose de isoflurano seguida de luxação cervical, de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC.</li>
			<li>Após a eutanásia com isoflurano seguida de deslocamento cervical, pulverizar os camundongos com uma solução de etanol a 70% e remover o pelo da área da cabeça e orelhas com tesoura. Em seguida, faça um corte na região cervical do pescoço (tomando cuidado para não decapitar o rato). Corte o crânio e retire-o. Em seguida, remova cuidadosamente o cérebro.</li>
			<li>Coloque os cérebros coletados em de tecido.</li>
			<li>Transfira os para um recipiente com 1x DPBS frio. NOTA: As amostras de cérebro não devem ser mantidas em 1x DPBS por mais de 1 h. Se forem recolhidas várias amostras cerebrais ao mesmo tempo, eutanasiar apenas alguns ratinhos de cada vez (10 por ronda).</li>
		</ol></li>
		<li>Imagem estereomicroscópica.<ol><li>Transfira todo o cérebro para uma tampa de prato de tecido de 100 cm.</li>
			<li>Ligue o estereomicroscópio e a luz UV, na posição 3 com lente 0,5x, para permitir a visualização de todo o cérebro como mostra a Figura 3A (quadrado vermelho).</li>
			<li> Pressione Visualização dinâmica (Figura 3A, quadrado verde).</li>
			<li>Concentre a visão enquanto o cérebro está na posição ventral.</li>
			<li>Selecione GFP (se as células forem marcadas com GFP ) ou TXRED (se as células forem marcadas com RFP) (Figura 3A, quadrado amarelo) no software, selecione o filtro apropriado no microscópio e tire uma foto. NOTA: Mantenha a configuração da fonte de luz SOLA em cerca de 30%; se a GFP for muito brilhante, reduza até que o sinal adequado seja observado.</li>
			<li>Sem mover a amostra, acenda a luz brilhante e selecione BF (Figura 3A, quadrado amarelo). Tire uma foto.</li>
			<li>Repita os passos anteriores com o cérebro na posição dorsal. NOTA: Dependendo do tamanho, a mesma lesão de metástase cerebral positiva para GFP pode aparecer nas posições ventral e dorsal. Nesse caso, evitar a quantificação duplicada da mesma lesão. Salve as imagens com uma extensão TIFF (que mantém todas as informações no arquivo de imagem).</li>
			<li>Salve as imagens com uma extensão TIFF (que mantém todas as informações no arquivo de imagem).</li>
			<li>Repita as etapas para todas as amostras.</li>
			<li>Converta as imagens TIFF em JPEG para que os arquivos possam ser abertos com qualquer computador que não tenha o software associado instalado (Arquivo | Importação/Exportação | converter arquivos).</li>
			<li>Para mesclar a imagem fluorescente com a imagem de campo brilhante, abra as duas imagens e vá para Arquivo | Mesclar canais. Selecione os componentes adequados, verde para GFP e brightfield para BF e pressione Ok. Salve a imagem mesclada.</li>
			<li>Para quantificar a área do tumor cerebral, use a imagem fluorescente. Selecione Medida | Medição Manual | área. Selecione a seleção automática (Figura 3B, quadrado verde), mova a seta para a área positiva para GFP e clique para criar automaticamente uma seleção. Clique novamente para confirmar a seleção e, em seguida, todas as medidas serão exibidas (Figura 3B, quadrado vermelho). Se mais de uma área positiva para GFP estiver presente, repita o procedimento.</li>
		</ol></li>
		<li>Após a obtenção das imagens cerebrais, proceder-se aos protocolos rotineiros de fixação tecidual com formalina tamponada a 10%.<ol><li>Uma vez fixados os cérebros, proceder-se ao corte histológico padrão, seguido de coloração de hematoxilina e eosina para confirmar a presença de metástases cerebrais e coloração imuno-histoquímica para detectar marcadores selecionados. NOTA: A imunocitoquímica foi realizada no Laboratório do Núcleo de Patologia do UT MD Anderson Cancer Center, que padronizou o protocolo para coloração imuno-histoquímica de marcadores conhecidos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O protocolo inclui várias etapas críticas. As células devem ser mantidas no gelo por não mais de 1 hora para manter a viabilidade. Almofadas de algodão com álcool devem ser usadas para limpar as caudas dos ratos antes da injeção, com cuidado para não limpar com muita força ou com muita frequência para evitar danificar a pele da cauda. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes na suspensão celular, para evitar que os ratos morram de êmbolos dos vasos sanguíneos. Mantenha o ângulo de injeção a 45° ou menos para ev...

Metástases cerebrais são complicações comuns e mortais de neoplasias malignas sistêmicas. A maioria das metástases cerebrais origina-se de tumores primários de pulmão, mama ou pele, que coletivamente representam 67-80% doscasos1,2. As estimativas da incidência de metástases cerebrais variam entre 100.000 e 240.000 casos, e esses números podem estar subestimados, pois a autópsia é rara em pacientes que morreram de câncer metastático3. Pacientes com metástases cerebrais têm pior prognóstico e menor sobrevida global em relação aos pacientes sem metástases cerebrais4. As opções atuais de tratamento para metástases cerebrais são, em grande parte, paliativas e não melhoram os resultados de sobrevida da maioria dos pacientes5. Assim, a metástase cerebral permanece um desafio, e a necessidade permanece premente para entender melhor os mecanismos de progressão da metástase cerebral para desenvolver terapias mais eficazes.
O uso de modelos experimentais tem fornecido importantes informações sobre mecanismos específicos de progressão metastática do câncer de mama para o cérebro e permitido avaliar a eficácia de várias abordagens terapêuticas6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . No entanto, poucos modelos podem recapitular com precisão e total os meandros do desenvolvimento de metástases cerebrais. Vários modelos experimentais in vivo foram gerados via inoculação de células cancerosas em camundongos por diferentes vias de administração, incluindo injeções ortotópicas, venosas caudais, intracardíacas, intracarotídeas arteriais e intracerebrais. Cada técnica apresenta vantagens e desvantagens, conforme revisado em outra edição3. Nenhum desses modelos de camundongo, no entanto, pode replicar totalmente a progressão clínica da metástase cerebral.
Metástases cerebrais são particularmente comuns em pacientes com câncer de mama inflamatório (IBC), uma variante rara, mas agressiva, do câncer de mama primário. O IBC é responsável por 1% a 4% dos casos de câncer de mama, mas é responsável por 10% desproporcionais das mortes relacionadas ao câncer de mama nos Estados Unidos17,18. Sabe-se que o IBC metástase rapidamente; de fato, um terço dos pacientes com CIG apresenta metástases à distância no momento do diagnóstico19,20. Especificamente para metástases cerebrais, pacientes com CIM têm maior incidência de metástases cerebrais do que pacientes sem CBI21. Recentemente, demonstramos que a linhagem celular MDA-IBC3, derivada do líquido de derrame pleural maligno de um paciente com IBC ER-/PR-/HER2+ que recapitula as características do IBC em xenoenxertos de camundongos, tem maior propensão a desenvolver metástases cerebrais em vez de metástases pulmonares em camundongos quando injetada pela veia caudal, tornando essa linhagem celular um bom modelo para estudar o desenvolvimento de metástasescerebrais16.
Descrevemos os procedimentos para gerar metástases cerebrais via injeção na veia caudal de células MDA-IBC3 e avaliar a carga metastática via microscopia estereofluorescente e imagem com luciferase. Esse método tem sido utilizado para descobrir mediadores-chave da metástase do câncer de mama para o cérebro e testar a eficácia de intervenções terapêuticas 16,22,23. A desvantagem desta técnica é que ela não recapitula todas as etapas do processo metastático cerebral. No entanto, suas principais vantagens incluem robustez e reprodutibilidade, envolvimento da biologia relevante da metástase do intravasamento, atravessando os pulmões e extravasamento para o cérebro, e sua relativa simplicidade em termos de técnica.

<table><tbody><tr><td><forte>Cultura de Células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Ponta de pipeta L filtrada</td><td>Genesee Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetas Sorológicas</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>1%</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 15 mL a granel</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 500 mL Hams F-12 Médio [+] L-glutamina</td><td>GIBICO Inc. EUA</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Contador de Células Automatizado Countess II (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centufuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>16000044</td><td>10%</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp; Filtros de Células Estéreis (40 &mu; m)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de insulina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td>5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Linhas celulares MDA-IBC3</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Geradas pelo laboratório do Dr. Woodward24</td></tr><tr><td>Luciferase&ndash; proteína fluorescente verde (Luc&ndash; GFP) plasmídeo</td><td>System Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>microtubos transparentes estéreis 1.7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 &micro; Ponta de Barreira de Alcance L, Baixa Encadernação, Racked, Estéril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frascos tratados com TC (T75), 250mL, Vent</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%) para uso com o contador de células automatizado Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td><forte>Injeção na veia da cauda</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Bege</td><td>Envigo</td><td>SCID/camundongos</td><td></td>bege</tr><tr><td>Seringa de Insulina BD com a Agulha Ultrafina BD 0,5mL 30Gx1/2" (12,7mm)</td><td>BD</td><td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs &nbsp; Restrições de Roedores Estilo Broome</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Pedido deThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolFornecedor Parceiro de Diversidade Etanol 95% SDA (190 Provas)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70% usado</td></tr><tr><td><forte>Imagem</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Lo-Dose&nbsp; Seringas de Insulina U-100</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro PES Descartáveis 0.45 &micro; m</td> Sistema <td>de filtro FB12566501</td><td>Fisherbrand</td><td>para esterilizar a D-luciferina</td></tr><tr><td>D-Luciferina Biosynth</td><td></td><td>L8220-1g</td><td>concentração estoque = 47,6 mM (15,15 mg/mL); concentração de uso = 1,515 mg/mL</td></tr><tr><td>1,7 mL microtubo âmbar</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-14043-704-06</td><td>Anestésico líquido para uso em vaporizador anestésico</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp;</td><td>Máquina PerkinElmer</td><td></td><td>para imagens de luciferase, até 5 imagens de camundongos ao mesmo tempo, com máquina de anestesia</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico com tampas&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>de Tecido</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Preparação de Álcool&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Imagem Estereoscópica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio AZ100&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>modelo AZ-STGE</td><td>software NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td> <td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC pratos tratados 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modelando metástase cerebral via injeção venosa caudal de células inflamatórias de câncer de mama

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

A disseminação metastática para o cérebro é uma manifestação comum e devastadora de muitos tipos de câncer. Só nos Estados Unidos, cerca de 200 mil pacientes são diagnosticados com metástases cerebrais a cada ano. Progressos significativos foram feitos na melhoria dos resultados de sobrevida para pacientes com câncer de mama primário e neoplasias sistêmicas; No entanto, o prognóstico sombrio para pacientes com metástases cerebrais clínicas destaca a necessidade urgente de desenvolver novos agentes terapêuticos e estratégias contra essa doença mortal. A falta de modelos experimentais adequados tem sido um dos principais obstáculos que impedem o avanço de nossa compreensão da biologia e do tratamento de metástases cerebrais. Neste trabalho, descrevemos um modelo de metástase cerebral em camundongos xenoenxerto gerado por injeção na veia caudal de uma linhagem celular endogenamente amplificada por HER2 derivada de câncer de mama inflamatório (IBC), uma forma rara e agressiva de câncer de mama. As células foram marcadas com luciferase de vagalume e proteína verde de fluorescência para monitorar metástases cerebrais e quantificadas carga metastática por imagem de bioluminescência, estereomicroscopia fluorescente e avaliação histológica. Camundongos desenvolvem metástases cerebrais de forma robusta e consistente, permitindo a investigação de mediadores-chave no processo metastático e o desenvolvimento de testes pré-clínicos de novas estratégias de tratamento.

Com o raciocínio de que as células marcadas facilitam o monitoramento e a visualização de metástases cerebrais em modelos pré-clínicos de camundongos, marcamos células MDA-IBC3 com Luc e com GFP para monitorar metástases cerebrais e quantificar a carga metastática usando imagens de bioluminescência e estereomicroscopia fluorescente. A injeção de células MDA-IBC3 marcadas nas veias caudais de camundongos SCID/Beige imunocomprometidos resultou em altas porcentagens de camundongos desenvolvendo metástases cerebrais (isto é,...

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Utilizamos o método da veia caudal para gerar metástases cerebrais em modelos de camundongos usando linhagens celulares derivadas de pacientes com câncer de mama inflamatório, ou IBC, uma forma altamente agressiva de câncer de mama primário. A geração de metástases cerebrais em modelos de camundongos tipicamente envolve injeções arteriais intracardíacas ou intracarotídeas. No entanto, o método da veia caudal oferece vantagem sobre essas técnicas, pois imita melhor as etapas da colonização de metástases cerebrais e é relativamente simples de executar.Os médicos Xiaoding Hu e Emilly Villodre, ambos instrutores em meu laboratório, demonstrarão o procedimento. Para detectar metástases cerebrais por imagem de GFP oito a 10 semanas após a injeção de células tumorais, desinfete o camundongo com etanol a 70% e remova o pelo da cabeça e das orelhas. Corte a área cervical do pescoço.Excise e remova o crânio para permitir que o cérebro seja colhido. Coloque o cérebro em um de tecido e coloque o em um recipiente de DPBS frio por não mais do que uma hora. Para obtenção de imagens por microscopia estéreo, transfira o cérebro para uma tampa de prato de tecido de 100 centímetros sob um microscópio estéreo equipado com uma luz UV e selecione a objetiva de 0,5x para permitir a visualização de todo o cérebro.Pressione a visualização ao vivo e concentre a visão enquanto o cérebro está na posição ventral. Selecione o filtro apropriado no software e no microscópio para o marcador fluorescente nas células e tire uma foto. Sem mover a amostra, alterne para imagens de campo brilhante e selecione o filtro de campo brilhante.Tire uma foto. Em seguida, imagine o cérebro na posição dorsal, como demonstrado anteriormente. Para analisar as imagens de todo o cérebro, primeiro converta os arquivos de imagem de TIFF para JPEG para que eles possam ser abertos com qualquer computador que não tenha o software associado.Em seguida, abra um par de imagens de campo brilhante e fluorescentes e selecione os canais de arquivo e mesclagem. Selecione os componentes adequados, clique em OK e salve a imagem mesclada. Para quantificar a área do tumor cerebral na imagem fluorescente, selecione a seleção automática.Mova a seta para a área de posição GFP e clique para criar uma seleção automaticamente. Em seguida, clique novamente para confirmar a seleção. Todas as medidas serão mostradas.Se mais de uma área positiva para GFP puder ser observada, repita a medida com a área subsequente. Lesões metastáticas cerebrais podem ser detectadas oito semanas após a injeção por imagem de luciferase e microscopia de fluorescência estéreo. Após exames de imagem, porções das metástases cerebrais podem ser fixadas em formalina e processadas para coloração de hematoxilina e eosina para validar a presença de lesões de metástases cerebrais e para coloração imuno-histoquímica para detectar marcadores proteicos específicos de interesse.Ao tentar este protocolo, é importante manter a viabilidade celular, mantendo as células no gelo por não mais do que uma hora, e evitar bolhas de ar na suspensão celular para evitar a formação de êmbolos e mortalidade em camundongos. Após a injeção da veia caudal, monitoramos o crescimento e a progressão das metástases cerebrais com imagens de luciferase. Após a eutanásia, microscopia de fluorescência estéreo e histologia confirmaram lesões metastáticas.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve uma técnica de injeção de células cancerígenas marcadas usando injeção de veia da cauda em um modelo de camundongo. Além disso, monitoramos a formação e o crescimento de metástases de câncer de mama usando imagens de animais vivos in vivo em tempo real.

Injeção na veia da cauda: um método para administrar células cancerígenas para estudos metastáticos em um modelo de camundongo

Fonte: Lim, M., et al. Modelagem de metástases cerebrais por injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)Neste vídeo, um camundongo anestesiado é submetido a um procedimento cirúrgico no qual células cancerígenas são injetadas na artéria carótida comum (CCA) para facilitar a entrega direcionada ao cérebro. O procedimento envolve sutura e manipulação precisas das artérias carótidas para direcionar as células injetadas para a artéria carótida interna (ACI),...

Modelagem de metástase de tumor cerebral por meio de injeção de células cancerígenas na artéria carótida interna

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Este manuscrito fornece o procedimento detalhado de injeção de artéria intra-ilíaca (IIA), uma técnica para entregar células cancerígenas especificamente aos tecidos dos membros posteriores, incluindo ossos, para estabelecer metástases ósseas experimentais. Embora inicialmente estabelecido com modelos de tumor de mama, esse protocolo pode ser facilmente estendido a outros tipos de câncer.

Injeção Artéria Intra-ilíaca para eficiente e seletiva Modelagem de microscópico metástase óssea

A metástase desempenha um papel profundo na virulência do câncer, sendo responsável por cerca de 90% das mortes.  Relatamos um protocolo para um modelo de melanoma metastático em camundongos que é útil para determinar a eficácia de agentes terapêuticos contra esse fenômeno clínico.

Injeção de células Singênico Murino melanoma para determinar o seu potencial metastático nos pulmões

Um procedimento cirúrgico foi desenvolvido para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino por meio de injeção na veia porta. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática em um hospedeiro totalmente imunocompetente, incluindo extravasamento de células tumorais, semeadura, sobrevivência e crescimento metastático no fígado.

Um modelo de injeção da veia porta para o Estudo do Fígado metástase do câncer de mama

Aqui, apresentamos um protocolo para implante de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de forma simples, menos invasiva e fácil de manusear de maneira, e este modelo de câncer de mama ortotópico rato com um ambiente adequado do tecido mamário pode ser usado para investigar vários aspectos da câncer.

Ortotópico injeção de células de câncer de mama para a almofada de gordura mamária de ratos

A abordagem descrita combina ensaios experimentais de metástase da veia da cauda com imagens de animais vivos in vivo in vivo para permitir o monitoramento em tempo real da formação e crescimento da metástase do câncer de mama, além da quantificação do número e tamanho da metástase nos pulmões.

Uso combinado de ensaios de metástase de veia de cauda e imagens in vivo em tempo real para quantificar a colonização metastática do câncer de mama e carga nos pulmões

A injeção intravenosa de células cancerígenas é frequentemente usada em pesquisas de metástase, mas a carga tumoral metastática pode ser difícil de analisar. Aqui, demonstramos um modelo de injeção de veias traseiras de metástase e incluímos uma nova abordagem para analisar a carga do tumor pulmonar metastático resultante.

Análise patológica da metástase pulmonar após injeção lateral de cauda-veia de células tumorais

A modelagem da metástase cerebral intracraniana é complicada pela incapacidade de monitorar o tamanho do tumor e a resposta ao tratamento com métodos precisos e oportunos. A metodologia apresentada casais injeção de tumor intracraniano com análise de ressonância magnética, que, quando combinada, cultiva injeções precisas e consistentes, monitoramento animal aprimorado e medições precisas de volume de tumor.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Aprenda a modelar metástase cerebral em camundongos usando injeção na veia caudal de células de câncer de mama inflamatório. Este método reproduz fielmente a colonização metastática cerebral para pesquisa oncológica.

Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

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