Métodos de microscopia em escala de tempo para a caracterização de microbolhas fluorescentes para liberação de medicamentos acionados por ultrassom

Este protocolo pode ser usado para caracterizar a resposta de microbolhas fluorescentes rotuladas que são projetadas para aplicações de entrega de medicamentos desencadeadas por ultrassom, que inclui os mecanismos de ativação e os biofeitos. A chave está na combinação de técnicas de imagem que nos permite desvendar o problema em várias escalas da entrega de drogas desencadeadas por ultrassom com bolhas, tanto em escalas espaciais diferentes quanto em escalas de tempo diferentes. Para uma única imagem de bolha por microscopia Brightfield, coloque uma agulha de ventilação de calibre 19 e use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 19 para remover uma pequena quantidade da suspensão de microbolhas do frasco de vidro em um pequeno tubo para facilitar a tubulação na próxima etapa.

Usando uma pipeta, dilui a solução de microbolhas em soro fisco filtrado tamponado. Use uma seringa de 10 mililitros para injetar a amostra em uma saída do suporte de amostra até que o suporte esteja cheio sem criar bolhas de ar, injetando mais da amostra, se necessário. Feche ambas as válvulas do suporte da amostra e coloque o suporte da amostra perpendicular ao eixo óptico do microscópio.

Antes da análise da amostra, defina a frequência de condução de ultrassom desejada e a pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e, começando com o campo de visão em um canto do suporte da amostra, use o estágio XYZ para mover o suporte para localizar microbolhas únicas no campo de visão do microscópio, em seguida, anexar uma fibra óptica conectada a um banho de água a uma luz estroboscópica e iniciar a gravação. Repita a imagem quantas vezes desejarem por configuração de ultrassom, movendo o suporte da amostra pelo menos dois milímetros para um campo de visão contendo microbolhas nãoônicas para cada análise. Para imagens microscópicas de fluorescência dos microbolhas, depois de diluir a solução de microboque em salina tamponada de fosfato como demonstrado, defina a frequência de condução de ultrassom desejada e a pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e defina o atraso do gatilho para o laser no gerador de atraso de pulso para excitação de fluorescência das nanopartículas dos microcompletos, em seguida, use o estágio XYZ para mover o suporte de amostra para localizar microcompletos únicos e trazê-los para o foco de microcomplepâncias o objetivo, em seguida, acionar a gravação.

Repita a imagem conforme desejado alterando as configurações do ultrassom e movendo o suporte da amostra para o novo campo de visão como demonstrado. Para a imagem por microscopia intravital, posicione primeiro um suporte animal aquecido no estágio de posicionamento XY entre o guia de ondas e o objetivo e adicione gel de acoplamento ao guia de ondas. Insira um cateter da veia da cauda na veia traseira de um rato com rolamento de tumor anestesiado e coloque o mouse equipado com uma câmara de janela no suporte aquecido.

Adicione uma gota de água ao deslizamento de cobertura. Para visualizar a vasculatura do tecido tumoral, injete por via intravenosa 30 microlitros de quatro miligramas por mililitro rotulado fluorescentemente 2 megadalton dextran no cateter da veia traseira e use o estágio de tradução XY para mover o rato até que um campo de visão com vasos sanguíneos adequados possa ser localizado. Ajuste a taxa de quadros, o campo de visão e o comprimento da gravação de acordo com os parâmetros do experimento e registo imagens da linha de base dos vasos.

Quando as imagens da linha de base tiverem sido adquiridas, defina a frequência de condução do ultrassom, o comprimento do pulso e a amplitude da pressão acústica no gerador de forma de onda arbitrária e injete por via intravenosa 50 microlitros de amostra de microbolhas na veia da cauda. Em seguida, imagem a vasculatura como demonstrado. A análise dos microbolhas por microscopia de fluorescência confocal revela uma distribuição de partículas não uniformes da concha de microbolhas.

A estrutura geral dos microbolhas pode ser visualizada por meio da microscopia eletrônica de varredura. A análise da dinâmica radial e do comportamento fenomenológico da microbolhas insonizadas pela microscopia brightfield permite a valorização da mudança relativa no raio de microbolhas ao longo do tempo. Aqui, uma sequência de imagem de uma entrega típica bem sucedida de nanopartículas fluorescentes rotuladas é mostrada.

As nanopartículas embutidas na concha de microbolhas podem ser observadas para fluoresce quando a luz laser atinge a bolha. Como observado neste parto mal sucedido, no entanto, as nanopartículas fluorescentes acendem sobre a casca da microbolhas, que permanece intacta durante a exposição ao ultrassom. Imagens multifótons intravitais podem ser usadas para determinar a extravasão espacial e temporal das nanopartículas durante a exposição ao ultrassom, o que pode ser benéfico para entender e otimizar os mecanismos subjacentes à entrega de nanopartículas mediadas por ultrassom.

Com o alinhamento perfeito das vias ópticas e acústicas em todas as escalas de tempo e tempo, uma visão abrangente sobre o fornecimento de medicamentos desencadeados por ultrassom é fornecida. As respostas entregues por nossos experimentos em várias escalas serão agora traduzidas para a prática clínica. Os resultados fornecerão informações valiosas para uma série de aplicações terapêuticas, incluindo a terapia contra o câncer.