Impressão 3D de Microcarriers de hidrogel in vitro alternando jatos de força viscosa-inercial

Oferecemos um leve processo bioimpresso para preparar microcarriers com boa controlabilidade e biocompatibilidade. Após o encapsulamento por células, os portadores também podem ser usados na expansão celular in vitro e na construção de microtissue funcionais. O deslocamento limitado, em vez de forças severas em condições semelhantes, atuam no bocal durante o processo de impressão, mantendo as propriedades físicas/químicas originais da bioindálua na medida máxima.

Além das microcarriers convencionais, podem ser construídas e aplicadas unidades com distribuição celular interna ou estruturas cápsulas encapsuladas por tritosinas. Para a preparação do bocal, carregue micropipettos de vidro no puxador de acordo com as instruções do fabricante e defina os parâmetros de puxar para o puxador. Use um microforge para cortar o bocal no diâmetro designado para obter o diâmetro da ponta específica para o experimento e esterilizar o bocal em álcool por cinco minutos.

Em seguida, enxágue o bocal três vezes com água estéril para remover qualquer álcool residual. Para preparar a bioind tinta hidrogel, diluir a solução de estoque de alginato de sódio de 4% em 0,9% cloreto de sódio a 0,5, 1, 1,5 e 2% de peso por volume concentrações. Para formação de microdroplet, carregue cinco mililitros de bio-tinta em uma seringa estéril descartável e instale a seringa em uma bomba de seringa.

Usando uma mangueira de um milímetro de diâmetro interno, conecte a seringa e o bocal de impressão. Aperte o parafuso de fixação para fixar o bocal no lugar e deprimir rapidamente a bomba de seringa para carregar a tinta biológica no bocal. Defina os parâmetros do gerador de sinal e predefina o caminho de movimento e o modo de gatilho da vibração para cair sob demanda.

Em seguida, imprima as gotículas seguindo os padrões pré-projetados. Para a formação de microcarriers, adicione cinco mililitros de solução de crosslinking a uma placa de Petri, e coloque a placa sob o bocal de impressão como o substrato. Após a impressão, cruze as microcarriers por três minutos antes de transferir a suspensão da microcarrier para um tubo de centrífuga.

Em seguida, enriqueça as microcarriers por centrifugação e resuspensá-las em um meio de cultura apropriado em aproximadamente 600 microcarriers por mililitro. Antes de sua inoculação, substitua o supernacido de uma cultura celular A549 por cinco mililitros de meio livre de soro suplementados com corante CMFDA verde de 10 micromolar para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura celular. Ao final da incubação, substitua a solução de corante por meio fresco e resuspenme as células a uma densidade de 1,6 vezes 10 para as seis células por mililitro de médio.

Adicione um mililitro de suspensão de microcarrier às células e um mililitro de células A549 a cada poço de uma placa de cultura de seis poços de baixa adesão. Coloque a placa em um agitador na incubadora de cultura celular a 30 revoluções por minuto. No final da incubação, remova a placa do agitador e permita que as microcarriers se acomodem por 30 minutos antes de observar e medir o bocal de impressão, placas de Petri e células microcarrier-inoculadas por microscopia de fluorescência de campo brilhante e confocal.

Usando um bico de ponta de 30 micrômetros, vários tipos de bioindálida, incluindo PBS, 1,5% de alginato e 1,5% de gelatina podem ser impressos em placas de Petri. À medida que as tintas aumentam na viscosidade, o processo de impressão torna-se cada vez mais difícil e são necessárias maiores forças motrizes para obter gotículas maiores. Os parâmetros de impressão podem ser definidos para imprimir as gotículas em arranjos 2D específicos, como observado neste experimento de impressão.

O diâmetro da ponta do bocal tem um impacto direto do tamanho do microcarrier que pode ser impresso. Como observado nessas imagens de campo brilhante e confocal, as células A549 aderem aos microcarriers alginato-colágeno após dois dias de cultura. Após seis dias, as células A549 cobrem quase totalmente as superfícies da microcarrier.

Após este procedimento, revestemos a superfície da microcarrier com quitosan, e usamos gluconato para dissolver o gel de alginato para formar uma estrutura cística que pode ser aplicada para construir estruturas ocas como alvéolos. O processo de impressão para a preparação de microcarriers é bastante suave, portanto, este método pode ser amplamente utilizado para impressão de microcarriers contendo células.