Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

O Scipion fornece as ferramentas para criar todo o fluxo de trabalho de processamento de forma integrativa para uma única análise de partículas em crio-EM para obter uma reconstrução de alta resolução do espécime biológico. Essa estrutura permite criar o fluxo de trabalho de processamento usando vários pacotes de processamento de imagens, favorecendo a interoperabilidade, rastreabilidade, reprodutibilidade e a combinação de informações transmitidas por diferentes métodos para gerar uma saída mais precisa. O scipion está em constante crescimento, incluindo novos métodos e pacotes.

Além disso, foi estendido à tomografia crio-elétron e à modelagem atômica, permitindo também criar fluxos de trabalho para processar esses dados. Para criar um projeto no Scipion, clique em Criar Projeto para criar o projeto. Para importar os filmes de microscópio, selecione Importar filmes.

Uma nova janela aparecerá. Nesta janela, insira o caminho para os dados e ajuste a tensão do Microscópio para 300 quilovolts, a aberração esférica para dois milímetros, o contraste amplitude a 0,1, a taxa de ampliação para 50.000, o modo de taxa de amostragem para A imagem, e o tamanho do Pixel para 1,34 astromngs. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, clique em Executar.

Quando o método terminar, abra a guia Resumo clique em Analisar resultados. Uma nova janela aparecerá com uma lista das saídas geradas pelo método. Para executar o método de fluxo óptico para alinhamento de filme, abra o método de alinhamento óptico xmipp3 e selecione os filmes importados como os filmes de entrada e defina os Quadros para ALINHAR variam de 2 a 13.

Em Parâmetros Adicionais, defina Usar o alinhamento de filme anterior para a opção quadros SUM para No.Deixar todas as outras opções definidas para seus valores padrão e executar o programa. Clique em Analisar resultados para verificar os micrografos obtidos e a trajetória dos turnos estimados. Para cada micrografo, é possível verificar a densidade espectral de potência, as trajetórias obtidas para alinhar o filme nas coordenadas cartesianas e polares, e o nome do arquivo do micrografo obtido.

Observe que as partículas do espécime são muito mais visíveis no micrografo em comparação com um único quadro do filme. Para a colheita de partículas, abra o método de colheita manual xmipp3 e selecione os micrografos obtidos anteriormente como os micrografos de entrada. Clique em Executar.

Uma nova janela interativa aparecerá. Nesta janela, altere o tamanho do pixel para 150. O micrografo selecionado aparecerá em uma janela maior.

Escolha todas as partículas visíveis dentro de uma região. Quando todas as partículas tiverem sido escolhidas manualmente, clique em Ativar treinamento para iniciar o aprendizado. As demais regiões do micrografo serão automaticamente escolhidas.

Verifique as partículas colhidas. Para incluir uma partícula adicional, clique em uma partícula de interesse. Para remover quaisquer partículas incorretas, segure Shift e clique nas partículas conforme necessário.

Quando todas as partículas tiverem sido automaticamente colhidas, selecione os próximos quatro micrografos um de cada vez para criar um conjunto de treinamento representativo. As partículas em cada micrografo selecionado serão automaticamente colhidas, verificando cada micrografo para incluir ou remover partículas conforme necessário. Quando um conjunto de treinamento for adquirido, clique em Coordenadas para salvar as coordenadas de todas as partículas colhidas.

Depois de adquirir o conjunto de treinamento, abra a configuração automática xmipp3 para indicar a escolha manual anterior na corrida de coleta de partículas Xmipp e defina Micrografos para escolher o mesmo como supervisionado. Clique em Executar para gerar um conjunto de cerca de 100.000 coordenadas. Para aplicar a abordagem de consenso, abra a colheita de criolo de torres e defina os micrografos pré-processados como os micrografos de entrada no modelo de escolha à padrão.

Defina o limiar de confiança para 0,3 e o Tamanho da caixa para 150 e clique em Executar. O método também deve gerar cerca de 100.000 coordenadas. Em seguida, abra xmipp3 profundamente consenso e defina as coordenadas de entrada para incluir a saída do pináculo cryolo e xmipp3 auto-picking, o tipo de modelo Select para pré-treinado, e o treinamento Skip e pontuação diretamente com modelo pré-treinado para Yes, em seguida, clique em Executar.

No final da execução, clique em Analisar resultados. Na nova janela, clique no ícone dos olhos. Uma segunda nova janela se abrirá com uma lista de todas as partículas.

Os valores de pontuação Z na coluna darão uma visão da qualidade de cada partícula, pois um valor baixo é indicativo de uma má qualidade. Para ordenar as partículas da pontuação Z mais alta para a mais baixa, clique em Xmipp Z-score deep learning e selecione as partículas com uma pontuação Z superior a 0,75. Em seguida, clique em Coordenadas para criar um novo subconjunto com aproximadamente 50.000 coordenadas.

Para calcular a resolução localmente, abra xmipp3 MonoRes locais e defina o volume de entrada para a saída da última etapa de refinamento, o Que você gostaria de usar metade dos volumes para Sim, e a Faixa de Resolução de 1 a 10 angstroms. Quando os parâmetros tiverem sido definidos, clique em Executar. Quando a resolução for calculada, clique em Analisar resultados e selecione Mostrar resolução histograma e mostrar fatias coloridas.

A resolução nas diferentes partes do volume será mostrada. A maioria dos voxels das partes centrais das estruturas deve representar resoluções em torno de três angstroms, enquanto as piores resoluções serão observadas nas regiões externas das estruturas. Um histograma das resoluções por voxel com um pico em torno ou abaixo de três angstroms também será mostrado.

Para aplicar um aguçamento, abra o afiação local xmipp3 localdeblur e selecione a saída da última etapa de refinamento como Mapa de Entrada e defina o mapa de resolução para o mapa Desarmes. Após a execução do comando, clique duas vezes no conjunto de volumes gerados como saída na guia Resumo. Os volumes gerados em cada iteração podem ser verificados.

Também é recomendado abrir o volume com outras ferramentas, como a UCSF Quimera, para observar melhor as características do volume em 3D. Nesta figura, pode ser observada uma correlação de três angstroms, que está muito perto do limite de Nyquist. Como ilustrado, as fatias de volume 3D reconstruídas exibem um alto nível de detalhes e estruturas bem definidas.

Após análise local, a maioria dos voxels centrais alcançam uma resolução abaixo de três angstroms. As regiões externas das fatias de resolução local demonstram uma resolução menor, no entanto, o que é consistente com o borrão observado dentro dessas áreas. Após o pós-processamento, as frequências mais altas do volume do mapa 3D podem ser observadas, revelando mais detalhes e melhorando a representação.

Quando a resolução alcançada é alta o suficiente, até mesmo algumas das partes bioquímicas da estrutura podem ser observadas. Se a estrutura obtida tiver uma baixa resolução, e não for capaz de ser evoluída para uma melhor, pode-se observar um volume embaçado com uma baixa correlação de camada fourier, curva de resolução e histograma da estimativa local. Após a colheita, a classificação 2D pode ser verificada para avaliar a qualidade das partículas.

Por exemplo, nesta classificação, as partículas são ruidosas, não centraladas ou acopladas, indicando que a colheita estava incorreta. Outro ponto de verificação pode ser realizado durante a estimativa inicial de volume. Neste exemplo, uma estimativa ruim foi criada usando uma configuração incorreta para o método.

Uma vez que um mapa 3D com resolução suficiente é produzido, o próximo passo é propor um modelo atômico para o mapa. Isso pode ser feito dentro do Scipion usando os plugins de modelagem. Esta técnica pode ser usada para reconstruir com sucesso macromoléculas biológicas para avaliação de suas interações moleculares e função de conjunto biológico como base para o design de drogas.