Triagem de fragmentos baseada em RMN em uma amostra mínima, mas no modo de automação máxima

Realizamos estudos de ressonância magnética nuclear. Isso nos permite determinar as estruturas de proteínas, RNA e DNA em solução. Essas biomoléculas são os constituintes, são os componentes de nossas células, e nossos protocolos que apresentamos aqui se preocupam com a triagem de pequenas moléculas e sua ligação a esses alvos.

A partir dessas moléculas, nossa química medicinal e biologia estrutural podem derivar novos fármacos que combatem doenças. A principal vantagem da nossa técnica é que temos controle total sobre a qualidade dos alvos moleculares, como as proteínas, e temos controle total sobre a qualidade dos fragmentos de pequenas moléculas e fármacos, e também podemos selecionar proteínas para ligação de uma ampla gama de afinidades, o que é uma vantagem em comparação com outras metodologias. Para preparar amostras de tela para medição de RMN, use um robô de preparação de amostras para distribuir 768 compostos em oito placas de 96 poços para obter 64 misturas contendo 12 fragmentos para uma concentração final de 4,2 milimolares por mistura.

Transfira o alvo biomolecular de interesse, diluído em um tampão de triagem apropriado, para o número apropriado de tubos trocadores de amostra de RMN de três milímetros com código de barras e use o robô para transferir 10 microlitros de cada mistura de ligante para cada tubo da biomolécula alvo. Em seguida, peça ao robô que misture bem as soluções. Para aquisição por RMN, carregar a amostra no espectrômetro.

Abra o software do espectrômetro e, em seguida, selecione o conjunto de parâmetros e as sequências de pulso para experimentos baseados em ligantes. Para todos os experimentos listados, selecione a escultura de excitação como a supressão de água. Para triagem de covid-19, selecione experimentos 1D e T2.

Selecione a largura espectral para 220 partes por milhão, a frequência de excitação para 140 partes por milhão e o tempo de análise entre uma a cinco horas. Para T2, o tempo de CPMG deve alternar entre 5 e 100 milissegundos. Registrar os experimentos T1r e T2.

Registre a diferença de transferência de saturação como um pseudo 2D. Para processar os dois espectros 1D únicos, use a função ProcStd do programa AU, com ou sem a opção relax. O WaterLOGSY é um único 1D que deve ser faseado com um negativo para o sinal do solvente.

Para analisar os dados de triagem de hidrogênio, siga as instruções para a ferramenta de triagem baseada em fragmentos para armazenar os dados de RMN de ressonância magnética biomolecular de campanhas de triagem, de modo que cada mistura de triagem tenha seu diretório no qual um subdiretório contém os diferentes experimentos medidos na amostra. Armazenar os espectros de referência, tendo todos os dados salvos das amostras sem o alvo biomolecular, mas com as misturas e o único composto em diretórios diferentes. Crie um caminho direto para o diretório que contém os dados adquiridos e selecione o diretório NMR no qual todas as misturas devem ter um diretório distinto.

Verifique se os arquivos CSV, tela de fragmento, documento XML e BAC também são copiados para o diretório NMR dos dados. Para usar a ferramenta de triagem baseada em fragmento para uma amostra filtrada, arraste o símbolo do projeto de triagem baseada em fragmento para o meio da janela de análise. O símbolo deve aparecer se os conjuntos de dados salvos anteriormente foram copiados para ele.

A janela de opções de triagem baseada em fragmentos deve ser aberta automaticamente. Selecione um arquivo CSV contendo os nomes das misturas, os nomes de cada fragmento e a divisão de cada fragmento nas misturas. Defina uma pasta de espectros de ligantes de referência com todos os espectros medidos dos fragmentos individuais e defina uma pasta de experimento em branco de referência, que geralmente contém os conjuntos de dados das misturas sem o alvo investigado.

Para definir os espectros investigados e as cores de exibição dos espectros, abra a guia Tipos de espectros e defina o tipo de especificação de acordo com os dados do processo. Na guia Exibir Layout, defina os espectros que serão comparados de acordo com os tipos de especificação. Em seguida, clique em OK para iniciar o projeto.

Enquanto os dados estão sendo processados, uma janela separada com a tabela resumindo todas as misturas de coquetéis e os ligantes de cada mistura será aberta. Clique duas vezes em uma célula para abrir os respectivos conjuntos de dados. Antes de atribuir ligantes, certifique-se de que os picos de referência correspondam entre si e tenham o mesmo deslocamento químico.

Se forem observadas diferenças, abra a guia Processo e use a opção de processamento serial para corrigi-las. Para a primeira análise das misturas de flúor-19, abra a guia Analisar e selecione a função integrar. Certifique-se de que uma região de integração clara para o sinal de covid-19 correspondente seja definida para cada fragmento na mistura.

Salve as regiões de integração de exportação para exportar o arquivo de integração para uso futuro e salve todos os arquivos de integração usados no diretório de instalação apropriado. Para dados de covid-19, abra um conjunto de dados com ou sem o destino investigado e, na guia Analisar, clique em Integrar e Ler Regiões de Integração de Importação para carregar o arquivo de integração correspondente no espectro atual. Em seguida, clique em Salvar e retornar para localizar uma lista das regiões integradas na guia Integrais e copie essas informações em uma planilha para análise downstream.

A estrutura molecular ou constituição dos ligantes na biblioteca de fragmentos é analisada usando software de confiança molecular como demonstrado, e os resultados são apresentados como uma saída gráfica. Uma cor laranja indica que o fragmento exibe uma inconsistência na estrutura ou concentração. Poços de cor verde indicam que o fragmento é consistente.

Nesta análise representativa, 103 fragmentos contendo um ou vários grupos de flúor da biblioteca interna foram divididos em cinco misturas de 20 a 21 fragmentos por mistura. Experimentos de relaxamento transversal com flúor-19 foram medidos para cada mistura que aplicou trens de pulso CPMG. Limiares são úteis para definir ligante, ligante fraco ou não-ligante na mistura, como observado nestes espectros típicos de tirosina quinase A e RNA da proteína tiamina.

Nesta análise representativa, o hit um mostrou uma diminuição de T2 de cerca de 50% e um desvio químico maior ou igual a seis hertz. O WaterLOGSY não apresentou uma mudança significativa no sinal para ser considerado positivo. No entanto, como dois dos três experimentos foram positivos, esse fragmento foi contado como um acerto.

Para o acertado dois, o T2 apresentou diminuição de aproximadamente 80% na intensidade do sinal. Uma clara mudança de sinal também foi observada para o WaterLOGSY. A mudança química não foi suficiente neste experimento, mas como os dois critérios anteriores foram positivos, ainda foi contado como um acerto.

O objetivo final de tais métodos é desenvolver novas drogas ou inibidores de alta afinidade de, por exemplo, enzimas, e nisso, a química medicinal assume e sintetiza essas novas moléculas, mas a biologia estrutural, as técnicas que você aplica aqui podem guiar a química medicinal e tornar essa abordagem muito mais rápida.