Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Pessoal, meu nome é Wang Yangdong, e sou do Laboratório de Bioengenharia Molecular Dr. Kiryl Piatkevich na Universidade de Westlake. Hoje, vou mostrar o procedimento para imagens de atividades neuronais de hipocampo em camundongos, in vivo. Ligue a máquina de solda e aqueça-a até a temperatura necessária.

Ajuste a posição da cânula de imagem e da cânula de injeção usando mãos amigas como mostrado na figura. Usando a seringa com a agulha, aplique uma pequena quantidade de fluxo apropriado nos pontos de conexão entre a imagem e a cânula de injeção por cinco segundos e, em seguida, remova a gota. Monte a lata de solda e aplique-a no ponto de conexão tratado com o fluxo.

Evite o excesso de estanho de solda, pois exigirá um crânio maior desnecessário para fazer durante a cirurgia. Espere a lata de solda esfriar. Normalmente, leva vários segundos.

Confirme se a cânula de injeção não está bloqueada inserindo a cânula fictícia de ambas as direções. Aplique adesivo óptico de cura UV na parte inferior da cânula de imagem usando um palito ou agulha de seringa de calibre 26. Use uma pinça fina para colocar cuidadosamente um copo de cobertura do tamanho correspondente à cânula de imagem.

Cure o adesivo por pelo menos uma hora por iluminação UV a partir de uma lâmpada UV portátil padrão. Anestesiar o camundongo com isoflurano de acordo com o procedimento aprovado pela IACUC. Coloque o mouse em uma estrutura estereotaxa sobre uma almofada de aquecimento de cirurgia.

Segure a cabeça com barras de ouvido. Empurre ligeiramente a cabeça em todas as direções para garantir que a cabeça esteja segura. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos do animal sequem durante a cirurgia.

Use um aparador ou creme depilatório para remover a pele da parte de trás do pescoço até os olhos. Esterilize o local cirúrgico com betadina seguido de 70% de etanol três vezes antes de fazer uma incisão. Remova a pele sobre a parte superior do crânio, começando com o corte horizontal ao redor da base da cabeça, seguido por dois cortes na direção rostral, quase atingindo as pálpebras.

Em seguida, dois cortes oblíquos que convergem na linha média. Com dois cotonetes estéreis, retraia o tecido de conexão, bem como a musculatura da parte de trás do pescoço até as bordas do crânio. Aplique uma gota de solução de lidocaína na superfície do periósteo por dois minutos para evitar dor excessiva.

Raspe suavemente toda a área exposta do crânio com um bisturi para criar uma superfície seca e áspera. Coloque a ponta da agulha sobre a Lambda para ver se a coordenada AP é zero para confirmar se a posição da cabeça é vertical, bem como se a coordenada ML é zero, para confirmar se a cabeça está posicionada horizontalmente. Caso não, ajuste os botões correspondentes na estação estereotaxic até que as coordenadas AP e ML estejam dentro de 0,1 milímetros.

Mova a ponta da agulha para encontrar os pontos correspondentes para craniotomia e marque suas posições no crânio, usando um marcador fino. Desenhe um círculo baseado em quatro pontos marcados, bem como o contorno da área da cânula de injeção no lado da cânula do círculo. Use uma broca pneumática à velocidade de 10.000 balas por minuto para perfurar suavemente ao longo do contorno marcado no crânio.

Perfurar o crânio até que uma camada muito fina de osso seja deixada, que geralmente começa a se mexer sob um toque suave no centro. Aplique uma gota de PBS estéril no centro da craniotomia. Levante a aba óssea do crânio com fórceps inclinados muito finos ou duas agulhas de calibre 26 que se aproximam dos lados opostos.

Aplique PBS seguido de aspirações suaves, através de uma agulha de calibre 26 várias vezes para limpar a superfície da dura. Aplique sucção suave para ablatar o córtex, bem como o Corpus Callosum acima do hipocampo. O córtex é muitas vezes mais amarelo que o Corpus Callosum.

E o Corpus Callosum é geralmente mais largo que o hipocampo. Além disso, o Corpus Callosum é realmente fácil de distinguir por fibras neuronais indo nas direções vertical e horizontal quando observado a partir do topo. O sangramento neste momento afetará a visibilidade do tecido cerebral na craniotomia.

Aplique PBS, seguido de sucção suave, enquanto você está aspirando o córtex para se livrar do sangue, Corpus Callosum pode ser reconhecido pela direção das fibras brancas como esquematicamente mostrado no diagrama. Remova as fibras de Corpus Callosum camada por camada, aplicando sucção suave em um movimento circular. A PBS é constantemente aplicada para se livrar do sangue acumulado acima do tecido cerebral exposto.

Insira suavemente o implante na craniotomia. Pressione firmemente em cima do implante com a agulha em forma de L para posicionar a janela óptica do implante o mais perto possível da superfície exposta do hipocampo. Aplique repetidamente PBS na cicatriz ao redor do implante, seguida de sucção para remover o sangue o máximo possível durante a inserção do implante.

Aplique uma fina camada de vedação rápida entre o implante e o crânio para evitar que o cimento dental penetre sob o crânio. Uma vez que a vedação rápida seja curada, aplique super ligação uniformemente na superfície do crânio, na superfície da vedação rápida e na superfície do implante. Uma vez que o super vínculo é curado, aplique resina base de dentadura acima da super ligação, bem como a pele em torno da incisão feita no início da cirurgia.

Depois que a resina da base de dentadura for curada, coloque a placa da cabeça sobre a resina ao redor do implante e faça-a se concentrar com a cânula de imagem. Aplique mais resina de base de dentadura ao redor e acima da placa da cabeça para corrigir sua posição. Deixe curar por vários minutos.

Evite construir uma camada espessa de cimento ao redor da cânula para garantir um melhor acesso à janela de imagem é a lente objetiva. Diluir a resina da base de dentadura para diminuir sua viscosidade, permitindo assim que ela preencha as cavidades que são difíceis de alcançar com um aplicador. Coloque suavemente uma fita de borracha isolada acima da janela para proteger a janela de uma possível contaminação da banda animal.

Adicione a solução de estoque de corante Fast Green à solução de vírus diluí-la ao titer desejado na proporção de um a nove, em um tubo PCR. Retire 600 nano litros da solução do vírus, remova a cânula falsa e insira a cânula interna conecte-a à seringa de injeção na cânula guia. Infundir o vírus à velocidade de 15 nano litros por minuto, por 10 minutos no total.

Mantenha a cânula interna conectada por 10 minutos para permitir que o vírus se espalhe sob a janela. Remova suavemente a cânula interna da cânula guia e recapitule-a com a cânula falsa. Induzir o rato com 4% de isoflurane por alguns minutos.

Conserte a placa da cabeça no garfo da cabeça e, em seguida, fixe o garfo da cabeça na esteira. Use uma lente objetiva de baixa ampliação para encontrar o melhor para filtrar a visualização para imagens funcionais. Em seguida, mude para uma lente objetiva mais alta para registrar as atividades neuronais na resolução de células únicas.

Para a imagem de cálcio, a fluorescente verde estava entusiasmada com um LED de 470 nanômetros comercialmente disponível usando um sentido padrão de filtro GFP. Para obter traços fluorescentes, as regiões de interesses correspondentes à massa celular neuronal foram segmentadas manualmente e analisadas pelo software ImageJ. Para imagens de tensão usando uma lente de 40 X foram realizadas gravações de tensão óptica no canal infravermelho próximo a 830 taxas de aquisição de Hertz.

O registro de atividade neural espontânea durou continuamente até 25.000 quadros. Aqui, descrevemos um método para imagens de longo prazo do hipocampo como uma região A1 no comportamento de camundongos. O método é baseado na implantação crônica.

Agora, a janela de imagem personalizada, que também permite a administração direcionada de vírus ou drogas diretamente aos neurônios de interesse. Acreditamos que o protocolo descrito facilitará os estudos que visam investigar a atividade neuronal com alta resolução temporal espacial no hipocampo de comportamento de camundongos usando configurações simples e acessíveis de imagem de 1 fóton.