Ativação 3D do cérebro inteiro e mapeamento de conectividade funcional em camundongos usando imagens de ultrassom funcional transcranário

O ultrassom funcional é uma nova modalidade de neuroimagem que permite o mapeamento do volume sanguíneo cerebral no cérebro de roedores vivos. Usando imagens de ondas de avião ultra rápidas, podemos medir respostas hemodinâmicas cerebrais inteiras com resolução temporária e sensibilidade especiais incomparáveis. Este protocolo explica como realizar imagens de ultrassom funcional transcrancial em camundongos, tanto para experimentos anestoetizados quanto acordados em animais.

Em comparação com outras técnicas de imagem funcional do cérebro, como a FMRI, o ultrassom funcional proporciona alta portabilidade, facilidade de uso e permite experimentos em indivíduos acordados e livremente em movimento, evitando viés de anestesia e permitindo estudos comportamentais. Até recentemente, a imagem de FUS só era usada em colaboração com o especialista em ultrassom. Agora, esta tecnologia está disponível para a ampla comunidade de neurociências, graças a scanners comercialmente disponíveis e software dedicado para imagens cerebrais pré-clínicas, tornando o FUS muito fácil de usar sem qualquer fundo no ultrassom.

Para uma sessão de imagem anestesiada, aplique pomada ocular nos olhos do rato para evitar qualquer dano na córnea e raspe a cabeça do rato usando um tremor. Aplique um pouco de creme depilatório e enxágue depois de alguns minutos. Repita isso até que o cabelo esteja completamente removido.

Insira pinos subcutâneos nos membros para gravação de eletrocardiograma e coloque gel de ultrassom centrifugado na cabeça. Para experimentos com camundongos acordados, uma cirurgia preliminar é necessária para fixação da cabeça. Coloque o mouse anestesiado e um quadro estereotático em uma almofada de aquecimento de 37 graus Celsius.

Aplique gel protetor para os olhos e administrou subcutâneamente a administração de lidocaína sob o couro cabeludo usando uma agulha de calibre 26, em seguida, espere alguns minutos. Faça uma incisão seguindo a sutura sagital de trás do osso occipital até o início do osso nasal, em seguida, use uma tesoura cirúrgica para extirer a pele sobre ambos os hemisférios. Limpe o crânio com uma solução de iodo de um por cento e remova qualquer periosteum restante.

Usando a placa da cabeça como modelo, marque dois orifícios no crânio para posicionar os parafusos de ancoragem. Posicione a placa da cabeça com os parafusos e use cimento dental para fixar os parafusos e a placa da cabeça na frente e atrás da estrutura para manter uma boa aderência do implante. Remova o animal da estrutura estereotática depois que o cimento estiver seco e reverta a anestesia através de injeção subcutânea de um miligrama por quilograma de atipamezole.

Administre meloxicam profilatática para dor pós-operatória. Coloque uma tampa impressa 3D magnética sobre a placa da cabeça para proteção e permita que o mouse se recupere por quatro a seis dias antes do início da habituação à gaiola doméstica móvel. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação em uma almofada de aquecimento por algumas horas, em seguida, devolva o rato para sua gaiola de origem com companheiros de lixo.

Nos dias quatro e cinco pós-recuperação, fixar repetidamente o mouse na gaiola doméstica móvel e aumentar gradualmente o tempo fixo da cabeça, começando de cinco minutos e até 30 minutos. Aplique um pouco de gel salino e ultrassom na janela de imagem para habituar o mouse. Repita este processo no sexto dia após a recuperação.

Inicie o software e crie uma sessão de experimentos. Vá para o menu da sonda de movimento para ajustar a posição da sonda de ultrassom usando o teclado de navegação. Inicie a aquisição da visualização ao vivo e ajuste a posição da sonda, se necessário, através de imagens em tempo real do volume sanguíneo cerebral animal, ou CBV.

Alinhe o cérebro no centro da imagem e, em seguida, otimize os parâmetros de imagem para capturar a maior relação sinal/ruído. Abra a opção Angio 3D do software de aquisição. No painel predefinido, ajuste os parâmetros de varredura da primeira fatia, última fatia e tamanho da etapa, a fim de escanear todo o cérebro e iniciar a aquisição.

Deixe o software de aquisição aberto e inicie o software para análise e visualização de dados e, em seguida, carregue a varredura Angio 3D. Navegue pelo volume de aquisição usando o painel de três visualizações e selecione a direção de varredura coronal, anteroposterior ou postural anterior. Vá ao painel de registro cerebral e carregue o modelo de referência do mouse para o processo de registro.

Registre a varredura no Allen Mouse Common Coordinates Framework usando os modos de registro totalmente automáticos ou manuais. Verifique o resultado olhando para a superposição da varredura Angio 3D e o modelo de referência, ou olhando para a superposição da digitalização e do Atlas de Referência Allen usando o painel gerenciador atlas. Salve o registro como um arquivo BPS.

No software de estúdio da ICO, certifique-se de que a varredura angiográfica e seu arquivo BPS estejam carregados. Vá para o painel de navegação cerebral. No painel do Atlas Manager, navegue pelo mouse Allen Brain Atlas com o navegador de árvore de crianças-mãe.

Encontre as regiões-alvo anatômicas e selecione-as para sobrepor-as ao scan nas três visualizações. Visualize as regiões-alvo no painel de três visualizações e escolha um plano de imagem que se sobreponha às regiões-alvo para o experimento, definindo manualmente dois marcadores na posição coronal que inclui a região de interesse. Clique no Sistema de Posicionamento cerebral, ou BPS, para extrair as coordenadas do motor resultantes que correspondem à posição da sonda para visualizar o plano alvo.

Verifique a visualização da imagem que é computada a partir da varredura angio. No software de varredura ICO, digite o painel de posicionamento do teste e clique em entrar nas coordenadas do BPS e, em seguida, aplique as coordenadas extraídas, fazendo com que a sonda se mova e se alinhe no plano de imagem alvo. Realize uma aquisição de visualização ao vivo e verifique se o plano de imagem atual corresponde à previsão.

Predefine a sequência de estimulação, incluindo tempo de estimulação, tempo de estimulação de juros e número de repetições. Execute uma sequência de FUS 3D definindo o tempo total de aquisição, o número de posições e o tempo morto entre as posições. Para estimular a estimulação automática sincronizada com o sistema de aquisição através da entrada TTL, selecione o trigonometria na opção antes de iniciar a aquisição.

Abra a aquisição no software de estúdio da ICO e insira no menu do mapa de ativação, em seguida, preencha o campo padrão de ativação com um horário de início e fim e computação do mapa de ativação. Ajuste os parâmetros de exibição para visualização e exporte o mapa de ativação como um arquivo H5 para análise off-line. Execute uma sequência de FUS 3D definindo o tempo total de aquisição, o número de posições de avião de imagem e o tempo morto entre as posições.

Salve a aquisição e carregue-a no software do estúdio da ICO. Se necessário, carregue o arquivo BPS e a Estrutura de Coordenação do Cérebro do Rato Allen. No Atlas Manager, selecione regiões do Atlas como regiões de interesse.

Digite o menu de condutividade funcional e selecione as regiões desejadas e o gerenciador de ROI. Visualize os resultados como matriz de conectividade ou mapa de correlação baseado em sementes, selecione e ajuste os filtros de largura de banda conforme desejado e exporte resultados de correlação para análise estatística. Este protocolo foi usado para quantificação 3D de variações hemodinâmicas cerebrais transcranicamente no cérebro do camundongo.

A estimulação do bigode foi selecionada como um exemplo de estimulação sensorial evocada resposta. A ativação significativa foi determinada com a resolução de um modelo linear geral, ou GLM, usando função de resposta hemodinâmica padrão do mouse. O tempo total de teste foi de 760 segundos, com uma linha de base de 60 segundos, uma estimulação de 80 segundos, e um tempo de recuperação de 60 segundos repetido cinco vezes.

Usando um curso de tempo voxel sábio do córtex somatosensorial primário contralateral, a região do campo do barril, ou S1BF, revelou um aumento de 15 a 20% do CBV em comparação com a linha de base. O mesmo paradigma foi aplicado em um mouse de comportamento fixo na gaiola doméstica móvel usando a predefinição acordada da varredura de ICO. O mapa de ativação após um experimento de estimulação de bigode múltiplo é mostrado aqui.

A ativação significativa foi determinada com a resolução de um GLM usando uma função de resposta hemodinâmica padrão do mouse. As correlações temporais normalizaram flutuações espontâneas de CBV de baixa frequência entre regiões cerebrais 3D em um camundongo anesthetizado de cetamina xilazina são mostrados aqui. A análise baseada em sementes e o hipocampo dorsal revelaram a condutividade interhemisférica significativa entre o hipocampo direito e esquerdo, bem como regiões hipocampais retrô mais profundas e cortesias piriformes.

Uma região de sementes selecionada no S1BF também resultou em um padrão de correlação simétrica. O ponto crítico para experimentos bem-sucedidos é a preparação animal, em particular o nível de anestesia para experimentos envolvendo animais anestesiados e a proteção de um crânio em experimentos em animais acordados. Se os EUA nos permitiram estudar funções cerebrais importantes em animais acordados que lidam com questões fundamentais sobre sono, aprendizagem ou comportamento, mas também a modulação farmacológica da conectividade funcional para a descoberta de drogas.