Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Actin é o principal componente do citoesqueleto e regula criticamente vários aspectos da morfologia celular e fisiologia, inclusive em neurônios. A actina ocorre em equilíbrio entre suas duas formas, g-actina globular monomérica ou f-actina de fisordenos polimérica. O status de polimerização da actina é rigorosamente regulado em vários níveis, tanto por proteínas de ligação de actina, bem como por sua própria regulação pós-translacional.

Nos contatos sinápticos interneuronais, alterações dinâmicas nos níveis F-actin são um evento regulatório fundamental, controlando a sinalização e a plasticidade nos terminais pré e pós-sinápticos. Não surpreende que a disfunção da actina esteja ligada a vários estados neuropatológicos. Avanços recentes levaram a uma riqueza de conhecimento de actina na fisiologia neuronal e fisiopatologia.

Por mais que muito ainda seja desconhecido e precisa ser focado. Nesse sentido, os análogos fluorescentes da falooidina provaram ser uma ferramenta importante na pesquisa actin. Esta follotoxina se liga especificamente à actina filamentosa, podendo, portanto, ser usada como medida direta das quantidades de F-actin, e sua alteração em estados fiofofosiológicos.

Este estudo apresenta um ensaio fluorométrico rápido e eficiente para avaliação do status de polimerização de actina em amostras biológicas ex-vivas, como homogeneizadores por atacado e terminais sinápticos bioquimicamente isolados de tecidos cerebrais. Note-se que o ensaio pode ser aplicado a outros tipos de células e tecidos e seu fenômeno fisiológico associado. Para as receitas dos buffers utilizados neste estudo, consulte o texto detalhado.

Amostras de tecido cerebral de ratos ou seres humanos foram homogeneizadas em um tubo de vidro Potter-Elvehjem e pilão no gelo em 10 volumes de tampão de homogeneização. Para a preparação sinásmica, o homogeneado foi girado primeiro em uma velocidade lenta e, em seguida, em uma velocidade mais alta para obter fração mitocondrial sintárquico bruta. Sinapstosmos enriquecidos desta fração bruta foram obtidos após um gradiente de sacarose descontínua.

Para a preparação sinaptoneurosomal, os homogeneizadores foram transmitidos sequencialmente através de dois 100 mícrons e um filtro de 5 mícrons. A estimativa de proteína foi realizada utilizando-se reagente de Bradford e as amostras foram diluídas no tampão krebs a uma concentração de dois a três miligramas por proteína mL em um volume final de 50 microliters. A estimulação de terminais sinápticos isolados, seja sinásticos ou sinápticos, foi realizada por um breve aumento de 30 segundos no potássio extracelular a 37 graus.

Para isso, um cloreto de potássio molar foi adicionado às amostras a uma concentração final de 15 mililitros. Os homogeneizados são fragmentos sinápticos não estimulados e despolarizados foram fixados com 2,5% de glutaraldeído, com a adição do volume necessário de solução de estoque de glutaraldeído de 25%. As amostras foram incubadas por dois, três minutos em temperatura ambiente.

Fixativo foi removido por centrifugação a 20.000 G por cinco minutos. As amostras foram então procedendo para permeabilização por resuspensão no tampão krebs contendo 0,1%Triton X-100 e 1 mg por mL de borohidride de sódio por dois a três minutos à temperatura ambiente. O tampão de permeabilização foi removido novamente por centrifugação e a pelota foi superficialmente lavada com tampão Krebs e resuspended em tampão Krebs contendo 1X Alexa Fluor 647 phalloidin, correspondendo a 500 micro unidades de fhalloidina.

A ligação foi permitida por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. O excesso de falooidina foi removido das amostras por centrifugação a 20.000 G por cinco minutos, e as pelotas foram superficialmente lavadas com tampão krebs, e resuspended novamente em tampão Krebs contendo 0,32 sacarose molar para manter a flutuação de sinapstosomos ou sinaptoneuros. Amostras fluorescentes ligadas à faloideina foram distribuídas em uma placa 96 bem preta para leitura fluorométrica em um leitor de placas.

Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram fixados em 645 nanômetros e 670 nanômetros, respectivamente. Para cada conjunto de experimentos incluímos diferentes quantidades de Alexa Fluor 647 phalloidin no buffer Krebs contendo 0,32 sacarose molar. Para explicar quaisquer perdas de amostras durante as etapas de lavagem, as amostras foram transferidas do preto para a placa transparente 96.

A captura das amostras foi então examinada em 440 nanômetros. A retenção de faloideína fluorescente é diretamente proporcional à quantidade de filamentos de actina ou níveis de F-actin nas amostras. A linearidade da ligação com a faloideina foi observada na faixa de 50 a 200 proteínas microgramas.

Como prova de princípio, também testamos a eficácia de nosso ensaio em modelos de despolimerização F-actin usando interrupção farmacológica de filamentos de actina por Latrunculin A, bem como estimulação da formação de F-actin por estimulação mediada de KCl de terminais sinápticos isolados. A emissão de fluorescência da faloideina ligada pode ser expressa como qualquer unidade de faloideina ligada gerada a partir da curva linear padrão e são relativas às amostras de controle. Para a Figura 4, os níveis de F-actin são expressos como micro unidades de faloideina vinculada.

Por outro lado, para a Figura 5 F-actin níveis nos fragmentos sinápticos despolarizados são expressos em relação ao controle de amostras não despolarizadas. Descrevemos um ensaio robusto, eficiente e de alto rendimento para análise de filamentos de actina, ou F-actin, e suas alterações em estados fisiológicos e fisiofósicos adequados para um formato de placa de 96 poços. O ensaio é muito mais rápido do que os protocolos alternativos existentes e pode servir como uma ferramenta essencial em estudos relacionados à actina, sozinho ou em combinação com os ensaios baseados em imunohistoquímica existentes e manchas ocidentais.