Name: Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a avaliar o status de polimerização de actina em tecidos cerebrais de roedores e humanos usando um ensaio fluorométrico com faloidina. Este método rápido e de alta vazão permite quantificar diretamente a actina filamentosa em amostras ex vivo.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Neurológica da Nova Zelândia (1835-PG), pelo Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia (#16-597) e pelo Departamento de Anatomia da Universidade de Otago, Nova Zelândia. Estamos em dívida com o Banco de Tecidos Neurológicos do HCB-IDIBAPS BioBank (Espanha) por tecidos cerebrais humanos. Agradecemos a Jiaxian Zhang por sua ajuda na gravação e edição do vídeo.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as normas do Comitê de Ética da Universidade de Otago no Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Protocolo de Ética Nº. AUP95/18 e AUP80/17) e legislatura neozelandesa. Os tecidos cerebrais humanos foram obtidos do Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank em Barcelona, Espanha. Todos os protocolos de coleta de tecidos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Clínic, em Barcelona, e o consentimento informado foi obtido das famílias.
1. Preparação de tampões e reagentes
<ol><li>Prepare os seguintes buffers para a homogeneização do tecido cerebral e a preparação de fração enriquecida de terminais sinápticos: Tampão de homogeneização: 5 mM HEPES, pH 7.4 suplementado com 0,32 M de sacarose Tampão de resuspensão: 5 mM Tris, pH 7.4 suplementado com sacarose de 0,32 M Tampão de lavagem: 5 mM Tris, pH 8.1 1,2 M de sacarose 1,0 M de sacarose 0,85 M de sacarose</li>
	<li>Adicione mistura caseira ou comercial de inibidores de protease e fosfatase. NOTA: Usamos a versão sem EDTA do mix completo do Inibidor protease (1 comprimido por tampão de 10 mL) e coquetel inibidor de fosfatase IV (1:100; volume: volume).</li>
	<li>Prepare os seguintes buffers e reagentes para a fixação, permeabilização e vinculação da falooidina: Tampão krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3,10 mM de glicose, 20 mM HEPES, pH 7.4 1 M KCl Glutaraldeído 25% (solução de estoque) Tampão krebs contendo 0,1 % Triton X-100 e 1 mg/mL NaBH4 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin em DMSO Tampão krebs contendo 0,32 M de sacarose 50 μM latrunculin A em DMSO (solução de estoque) 1 M KCl (solução de estoque) ATENÇÃO: A falooidina é tóxica (LD50 = 2 mg/kg) e deve ser tratada com cuidado. A inalação de glutaraldeído é tóxica e deve ser manuseada em um capô de fumaça.</li>
	<li>Armazene os buffers a 4 °C e a faloideína e latrunculin A a -20 °C para armazenamento a longo prazo. NOTA: O armazenamento a longo prazo de buffers não é recomendado. O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. Homogeneização do tecido cerebral
<ol><li>Homogeneize o tecido cerebral de rato criopreservado ou recém-dissecado em 10 volumes de tampão de homogeneização em um tubo de vidroPotter-Elvehjem e pilão no gelo. NOTA: A homogeneização ideal é alcançada por 15-20 golpes do pilão à mão para tecidos cerebrais. A homogeneização bem sucedida pode ser confirmada pelo fluxo suave da suspensão através do tubo de vidro. O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Determine a concentração de proteína no homogeneizar usando um ensaio de Bradford31. NOTA: Ensaios caseiros ou comerciais alternativos para estimativa de proteínas também podem ser usados.</li>
	<li>Diluir amostras homogeneizadas no tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL. NOTA: Em alguns de nossos experimentos, incubamos homogeneizadores com 2 μM latrunculin A ou DMSO (controles) a 37 °C por 1 h. Para isso, os homogeneizadores são resuspended em 48 μL de buffer Krebs, e 2 μL de 50 μM latrunculin A ou 2 μL de DMSO é adicionado. Além disso, para a imunoblotação, uma pequena quantidade de amostra (10 μg) é coletada após a incubação.</li>
	<li>Fixar as amostras homogeneizais (seção 5).</li>
</ol>3. Preparação de terminais nervosos isolados
<ol><li>Preparação de sinástomos NOTA: Protocolos alternativos32,33 para sináttoso também podem ser usados.<ol>
<li>Centrífuga cerebral homogeneiza a 1.200 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Descarte a pelota, que é a fração nuclear bruta.</li>
		<li>Mais centrífuga o supernascido (S1) obtido na etapa 3.1.1 a 12.000 x g para 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Remova o supernatante (S2), que é a fração citosolica solúvel.</li>
		<li>Resuspend a pelota (P2) obtida na etapa 3.1.3, que é a fração sintásica bruta no tampão de resuspensão. NOTA: O volume do tampão de ressuspensão depende da quantidade de tecido inicial e da quantidade de pelotas obtida. Por exemplo, quando começa com 150-300 mg de tecidos cerebrais, a pelota obtida pode ser resuspended em 200 μL de tampão de resuspensão.</li>
		<li>Carregue os sinapstos brutos resuspendados em um gradiente de sacarose descontínuo feito de volumes iguais de 0,85-1.0-1,2 M de sacarose. NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada uma da solução de sacarose (para tecido de 150-300 mgs). Isso pode ser alterado de acordo com quantidades maiores de tecido. Gradientes descontínuos podem ser feitos usando uma seringa 25G pressionada contra a parede interna do tubo ultracentrífuga e camadas suaves das camadas de sacarose.</li>
		<li>Centrifugar a 85.000 x g por 2 h a 4 °C. NOTA: Devido à alta velocidade da centrifugação, é necessário um ultracentrifuge capaz de criar um vácuo para reduzir o aquecimento.</li>
		<li>Colete a fração sinapstosômica na interface entre 1,0 e 1,2 M de sacarose usando uma ponta de tubulação de 200 μL.</li>
		<li>Lave a fração sinaptosômica com tampão de lavagem gelado por centrifugação a 18.000 x g por 10 minutos a 4 °C. NOTA: Para a lavagem, a fração sinaptosômica obtida na interface de 1,0 e 1,2 M de sacarose é coletada em um tubo fresco de 1,5 mL, e um volume igual de tampão de lavagem é adicionado, garantindo a remoção de alta sacarose do meio.</li>
		<li>Lave a pelota sinaptosômica novamente com tampão de homogeneização gelada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Resuspense os sinapstosos no tampão de homogeneização no gelo. NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.</li>
		<li>Determine a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.</li>
		<li>Resuspenda os sinapstosmos em tampão krebs a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados por KCl; ver seção 4). NOTA: Para a resuspensão, a fração sinapstosômica é primeiramente girada em 12.000 x g por 5 min a 4 °C e o supernascido (tampão) é removido. A pelota sinaptosômica é então resuspendida no tampão Krebs por pipetação suave usando uma ponta de tubulação de 200 μL.</li>
		<li>Prossiga com a despolarização (seção 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de sináticos NOTA: Protocolos alternativos34,35 para sináptos também podem ser usados.<ol>
<li>Passe o cérebro homogeneizar através de um filtro de rede pré-molhado de 100 μm de tamanho de poro em um suporte de filtro usando uma seringa de 1 mL. NOTA: A pré-motação de todos os filtros é importante para evitar a perda da amostra e deve ser feita usando tampão de homogeneização. Para isso, o tampão de homogeneização é passado através dos filtros no suporte do filtro usando uma seringa de 1 mL até que o buffer flua.</li>
		<li>Colete o filtrado (F1) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.</li>
		<li>Repita o processo (etapas 3.2.1 e 3.2.2) para a fração F1 para obter o segundo filtrado (F2).</li>
		<li>Passe f2 filtrado através de um filtro líquido de 5 μm tamanho de poros.</li>
		<li>Colete o filtrado (F3) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL no gelo.</li>
		<li>Centrífuga filtra F3 a 1.500 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend a pelota (sináptogoso) em tampão de Krebs no gelo a uma concentração de 2-3 mg de proteína/mL em um volume de 50 μL (47,5 μL se os sináceos devem ser despolarizados pela KCl; ver seção 4). NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.</li>
		<li>Estime a concentração de proteínas usando um ensaio de Bradford.</li>
		<li>Prossiga com a despolarização (seção 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Despolarização mediada por KCl de terminais sinápticos isolados
<ol><li>Equilibre os sináceos/sináptosmos a 37 °C por 5-10 min.</li>
	<li>Estimule os sinápstosmos/sináptorias adicionando KCl para aumentar k extracelular+ para 50 mM para 30 s a 37 °C e adicionar o mesmo volume de tampão Krebs ao respectivo conjunto de controle não estimulado. NOTA: Por exemplo, adicione 2,5 μL de 1 M KCl aos sinápstoses resuspentados em 47,5 μL de buffer Krebs; e adicionar 2,5 μL de tampão Krebs ao respectivo sinaptosomo de controle não estimulado. Para experimentos em que um grande número de amostras estão envolvidas, proceda com no máximo 2 amostras por vez para que o tempo de despolarização não exceda os 30 s.</li>
	<li>Finalce a estimulação adicionando glutaraldeído (seção 5).</li>
</ol>5. Fixação e mancha de faloideína de amostras
<ol><li>Adicione glutaraldeído a amostras homogeneizas/sinapstosômicas/sinapstoneurosomais a uma concentração final de 2,5% para 2-3 min à temperatura ambiente. NOTA: Adicionamos 6 μL de solução de glutaraldeído de 25% para que a concentração final de glutaraldeído nas amostras de 50 μL (homogeneizados/sinápitos/sinapontorosos) fosse de cerca de 2,5%. A fixação é crítica e deve ser rápida e, portanto, imediatamente após a adição de glutaraldeído, a amostra deve ser vigorosamente vórticada.</li>
	<li>Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernatante. NOTA: Descarte o supernatante em uma capa de fumaça, pois o glutaraldeído é tóxico.</li>
	<li>Permeabilize a pelota por resuspensão em 100 μL de tampão Krebs contendo 0,1% Triton X-100 e 1 mg/mL NaHB4 para 2-3 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Sedimente as amostras a 20.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o tampão de permeabilização.</li>
	<li>Lave a pelota com 200 μL de tampão Krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspend e colora a pelota com 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondente a 500 μU) em 100 μL de tampão Krebs por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente. NOTA: Outras variedades de análogos fluorescentes de faloideína estão disponíveis comercialmente e podem ser substituídas para o ensaio. A concentração de faloidina e o volume total de amostra de incubação podem ter que ser modificados de acordo com a quantidade e o tipo de tecido/amostra que está sendo testado e as condições ideais devem ser padronizadas em conformidade.</li>
	<li>Centrifugar as amostras manchadas a 20.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova a falooidina desvinculada (supernante).</li>
	<li>Lave a amostra com 200 μL de tampão krebs por centrifugação a 20.000 x g por 5 min.</li>
	<li>Resuspend em 200 μL de tampão Krebs contendo 0,32 M de sacarose. NOTA: O protocolo pode ser brevemente pausado aqui.</li>
</ol>6. Análise fluorométrica e dispersão de luz
<ol><li>Dispense alexa fluor 647 amostras manchadas de phalloidina em uma placa preta de 96 poços.</li>
	<li>Meça a intensidade da fluorescência em um comprimento de onda de excitação de 645 nm e um comprimento de onda de emissão de 670 nm em um leitor de placas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira as amostras da placa preta de 96 poços para a placa transparente de 96 poços usando pontas de tubulação de 200 μL.</li>
	<li>Meça a dispersão de luz em 540 nm para corrigir quaisquer perdas que possam ter ocorrido durante as etapas anteriores de fixação, permeabilização e coloração. NOTA: Variações no material biológico retido nas amostras manchadas podem ser mais proeminentes para quantidades menores de material inicial (ver Discussão).</li>
	<li>Inclua um conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin no buffer Krebs em diferentes concentrações (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x e 1x correspondente a 25, 50, 125, 175, 250, 375 e 500 μU) para cada lote do ensaio como curva padrão. NOTA: Esta é uma etapa opcional e não afeta os resultados do ensaio especialmente quando os níveis de F-actin estão sendo expressos de forma relativa (Seção 7). O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>7. Análise de dados
<ol><li>A quantidade de F-actin nas amostras é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência da faloideina ligada. Expresse em termos absolutos de unidades de faloideína encadernadas calculadas a partir da curva linear do padrão de faloideina marcada. NOTA: Como exemplo, ver Figuras 2A-B, 3A, 4A-B e Figura Suplementar 2.</li>
	<li>Expresse níveis de F-actin como uma fração das amostras de controle. NOTA: Como exemplo, consulte figuras 5A-B.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio aqui descrito, essencialmente adaptado de um estudo anterior30 com modificações, emprega uma falotoxina, phalloidina marcada com um rótulo fluorescente. Os análogos fluorescentes de faloidina são considerados o padrão-ouro para filamentos de actina de coloração em tecidos fixos47,48,49. Na verdade, são as ferramentas mais antigas para identificar especificamente os filamentosact...

A actina de proteína citoesquelél está envolvida em múltiplas funções celulares, incluindo suporte estrutural, transporte celular, motilidade celular e divisão. A actina ocorre em equilíbrio em duas formas: actina globular monomérica (G-actin) e ato de fisordenada polimerizada (F-actin). Mudanças rápidas no status de polimerização da actina (interconversão entre suas formas G e F) resultam em rápida montagem de filamentos e desmontagem e fundamentam suas funções regulatórias na fisiologia celular. Actin forma o principal componente da estrutura citoesquelético neuronal e influencia uma ampla gama de funções neuronais1,2. Note-se que o citoesqueleto actin forma parte integrante da plataforma estrutural dos terminais sinápticos. Como tal, é um dos principais determinantes da morfogênese sináptica e da fisiologia e desempenha um papel fundamental no controle do tamanho, número e morfologia das sinapses3,4,5. Em particular, a polimerização dinâmica de actina-despomerização é um determinante fundamental da remodelagem sináptica associada à plasticidade sináptica subjacente aos processos de memória e aprendizagem. De fato, tanto as funções pressiná-iânfmáticas (como a liberação neurotransmissor6,7,8,9,10) quanto as funções postsintálicas (remodelagem dinâmica relacionada à plasticidade11,12,13,14) dependem criticamente de mudanças dinâmicas no status de polimerização do citoesqueleto actin.
Em condições fisiológicas, os níveis de F-actin são dinamicamente e firmemente regulados através de uma via multimodal envolvendo modificação pós-transacional4,15,16, bem como proteínas de ligação de actina (ABPs)4,17. Os ABPs podem influenciar a dinâmica da actina em vários níveis (como iniciar ou inibir a polimerização, induzir ramificações de filamentos, cortar filamentos em peças menores, promover a despomerização e proteger contra a despomerização), e estão em turno sob um rigoroso controle modulatório sensível a vários sinais extra e intracelular18,19,20. Tais verificações regulatórias em vários níveis ditam uma regulação rigorosa da dinâmica da actina no citoesqueleto sináptico, afinando aspectos pré e postinopticos da fisiologia neuronal, tanto nos estados basais quanto induzidos pela atividade.
Dado os importantes papéis da actina na fisiologia neuronal, não é de surpreender que vários estudos tenham fornecido evidências de alterações na dinâmica da actina como eventos patogênicos críticos ligados a uma ampla gama de distúrbios neurológicos, incluindo neurodegeneração, doenças psicológicas e doenças neurodesenvolvimentares3,21,22,23,24,25,26,27. Apesar da riqueza de dados de pesquisa que apontam para papéis-chave da actina na fisiologia neuronal e na fisiopatologia, no entanto, lacunas significativas ainda permanecem na compreensão da dinâmica da actina, particularmente no citoesqueleto sináptico. Mais estudos de pesquisa são necessários para ter uma melhor compreensão da actina neuronal e suas alterações em condições patológicas. Uma das principais áreas de foco nesse contexto é a avaliação do status de polimerização de actina. Existem kits comerciais baseados em manchas ocidentais (G-Actin/F-Actin in vivo assay bioquímico kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) e ensaios caseiros para avaliação dos níveis de F-actin6. No entanto, como estes requerem isolamento bioquímico de F-actin e G-actin e porque sua quantificação subsequente é baseada em protocolos de imunobloquetação, eles podem ser demorados. Aqui relatamos um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência adaptado de um estudo anterior30 com modificações que podem ser usadas para avaliar tanto os níveis basais de F-actin, como mudanças dinâmicas em sua montagem-desmontagem. Notavelmente, modificamos eficientemente o protocolo original que requer amostras adequadas para um cuvette de 1 mL para o formato atual de placa de 96 poços. O protocolo modificado reduziu significativamente a quantidade de tecido/amostra necessária para o ensaio. Além disso, fornecemos evidências de que o protocolo é adequado não apenas para homogeneizadores de tecido cerebral, mas também frações subcelulares, como terminais sinápticos isolados (sinápttos e sinápticos). Por fim, o ensaio pode ser empregado para tecidos cerebrais de roedores recém-dissecados e amostras cerebrais humanas pós-morte armazenadas a longo prazo. Note-se que, embora o ensaio seja apresentado em um contexto neuronal, ele pode ser adequadamente estendido a outros tipos de células e processos fisiológicos associados a eles.

<table><tbody><tr><td>Tubo de policarbonato de parede espessa de 3,5 mL, de topo aberto</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>Para centrifugação gradiente (preparação de sinaptossomo)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>F-actina ligante específico</td></tr><tr><td>Anticorpo contra &nbsp; b-actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Para avaliação dos níveis totais de actina por imunotransferência</td></tr><tr><td>Anticorpo contra GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Para avaliação dos níveis de GAPDH por immunoblotting</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford based protein estimation</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, Inibidor de Protease sem EDTA Coquetel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>Para inibição da atividade da protease endógena durante a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene</td><td></td><td>Corning 3596</td><td>Para medições de espalhamento de luz</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Solvente para faloidina e latrunculina A</td></tr><tr><td>Scanner de mesa fluorescente (Odyssey Infrared Scanner)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Para detecção de sinais imunorreativos em immunoblots</td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído (25% em água) Fixador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td> Grau II</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Ingrediente tampão para preparação de amostras e componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>Latrunculina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Despolimerizador de filamentos de actina</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>Microplacas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de membrana Mitex 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Preparação de sinaptoneurossomas</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Placa preta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Para medições fluorométricas</td></tr><tr><td>Filtro de rede de nylon 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Preparação de sinaptoneurossomos</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de fosfatase IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Para inibição da atividade da fosfatase endógena durante a preparação da amostra</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Componente tampão Krebs e para despolarização dos terminais sinápticos</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico ((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>Borohidreto de sódio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Componente do tampão de permeabilização</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>Componente tampão Krebs</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td>Componente tampão BSPSL900 Krebs</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>Para medições fluorométricas</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Ingrediente tampão para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Porta-filtro Swimnex</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Preparação de sinaptoneurossomos</td></tr><tr><td>Moedor de tecidos 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Para homogeneização de tecidos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Componente do tampão de permeabilização</td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Ingrediente tampão para preparação de amostras</td></tr></tbody></table>

um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

Actin, o principal componente do citoesqueleto, desempenha um papel crítico na manutenção da estrutura e função neuronal. Nos estados fisiológicos, a actina ocorre em equilíbrio em suas duas formas: globular monomérica (G-actin) e fisordenos polimerizados (F- actina). Nos terminais sinápticos, o citoesqueleto de actin forma a base para funções críticas pré e pós-sináptica. Além disso, mudanças dinâmicas no status de polimerização da actina (interconversão entre formas globulares e relacionáveis de actina) estão intimamente ligadas a alterações relacionadas à plasticidade na estrutura e função sináptica. Informamos aqui uma metodologia baseada em fluorescência modificada para avaliar o status de polimerização da actina em condições ex vivo. O ensaio emprega fábulina fluorescentemente rotulada, uma falotoxina que se liga especificamente aos filamentos de actina (F-actin), fornecendo uma medida direta de ato de fiomatos polimerizados. Como prova de princípio, fornecemos evidências para a adequação do ensaio tanto em roedores quanto em homogeneizações de tecido cerebral humano pós-morte. Utilizando latrunculin A (uma droga que despomeriza filamentos de actina), confirmamos a utilidade do ensaio no monitoramento de alterações nos níveis de F-actin. Além disso, estendemos o ensaio a frações bioquímicas de terminais sinápticos isolados em que confirmamos o aumento da polimerização da actina após a estimulação por despolarização com alto K+extracelular .

Linearidade do ensaio para avaliação dos níveis de F-actin Primeiro, foi verificada uma curva padrão para o aumento linear da fluorescência de Alexa Fluor 647 Phalloidin e repetida para cada conjunto de experimentos(Figura 1). Para investigar a faixa linear do ensaio, foram processadas diferentes quantidades de homogeneizadores cerebrais de roedores(Figuras 2A e 2B) e indivíduos humanos pós-morte(Figura 3A e ...

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin é o principal componente do citoesqueleto e regula criticamente vários aspectos da morfologia celular e fisiologia, inclusive em neurônios. A actina ocorre em equilíbrio entre suas duas formas, g-actina globular monomérica ou f-actina de fisordenos polimérica. O status de polimerização da actina é rigorosamente regulado em vários níveis, tanto por proteínas de ligação de actina, bem como por sua própria regulação pós-translacional.Nos contatos sinápticos interneuronais, alterações dinâmicas nos níveis F-actin são um evento regulatório fundamental, controlando a sinalização e a plasticidade nos terminais pré e pós-sinápticos. Não surpreende que a disfunção da actina esteja ligada a vários estados neuropatológicos. Avanços recentes levaram a uma riqueza de conhecimento de actina na fisiologia neuronal e fisiopatologia.Por mais que muito ainda seja desconhecido e precisa ser focado. Nesse sentido, os análogos fluorescentes da falooidina provaram ser uma ferramenta importante na pesquisa actin. Esta follotoxina se liga especificamente à actina filamentosa, podendo, portanto, ser usada como medida direta das quantidades de F-actin, e sua alteração em estados fiofofosiológicos.Este estudo apresenta um ensaio fluorométrico rápido e eficiente para avaliação do status de polimerização de actina em amostras biológicas ex-vivas, como homogeneizadores por atacado e terminais sinápticos bioquimicamente isolados de tecidos cerebrais. Note-se que o ensaio pode ser aplicado a outros tipos de células e tecidos e seu fenômeno fisiológico associado. Para as receitas dos buffers utilizados neste estudo, consulte o texto detalhado.Amostras de tecido cerebral de ratos ou seres humanos foram homogeneizadas em um tubo de vidro Potter-Elvehjem e pilão no gelo em 10 volumes de tampão de homogeneização. Para a preparação sinásmica, o homogeneado foi girado primeiro em uma velocidade lenta e, em seguida, em uma velocidade mais alta para obter fração mitocondrial sintárquico bruta. Sinapstosmos enriquecidos desta fração bruta foram obtidos após um gradiente de sacarose descontínua.Para a preparação sinaptoneurosomal, os homogeneizadores foram transmitidos sequencialmente através de dois 100 mícrons e um filtro de 5 mícrons. A estimativa de proteína foi realizada utilizando-se reagente de Bradford e as amostras foram diluídas no tampão krebs a uma concentração de dois a três miligramas por proteína mL em um volume final de 50 microliters. A estimulação de terminais sinápticos isolados, seja sinásticos ou sinápticos, foi realizada por um breve aumento de 30 segundos no potássio extracelular a 37 graus.Para isso, um cloreto de potássio molar foi adicionado às amostras a uma concentração final de 15 mililitros. Os homogeneizados são fragmentos sinápticos não estimulados e despolarizados foram fixados com 2,5% de glutaraldeído, com a adição do volume necessário de solução de estoque de glutaraldeído de 25%. As amostras foram incubadas por dois, três minutos em temperatura ambiente.Fixativo foi removido por centrifugação a 20.000 G por cinco minutos. As amostras foram então procedendo para permeabilização por resuspensão no tampão krebs contendo 0,1%Triton X-100 e 1 mg por mL de borohidride de sódio por dois a três minutos à temperatura ambiente. O tampão de permeabilização foi removido novamente por centrifugação e a pelota foi superficialmente lavada com tampão Krebs e resuspended em tampão Krebs contendo 1X Alexa Fluor 647 phalloidin, correspondendo a 500 micro unidades de fhalloidina.A ligação foi permitida por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. O excesso de falooidina foi removido das amostras por centrifugação a 20.000 G por cinco minutos, e as pelotas foram superficialmente lavadas com tampão krebs, e resuspended novamente em tampão Krebs contendo 0,32 sacarose molar para manter a flutuação de sinapstosomos ou sinaptoneuros. Amostras fluorescentes ligadas à faloideina foram distribuídas em uma placa 96 bem preta para leitura fluorométrica em um leitor de placas.Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram fixados em 645 nanômetros e 670 nanômetros, respectivamente. Para cada conjunto de experimentos incluímos diferentes quantidades de Alexa Fluor 647 phalloidin no buffer Krebs contendo 0,32 sacarose molar. Para explicar quaisquer perdas de amostras durante as etapas de lavagem, as amostras foram transferidas do preto para a placa transparente 96.A captura das amostras foi então examinada em 440 nanômetros. A retenção de faloideína fluorescente é diretamente proporcional à quantidade de filamentos de actina ou níveis de F-actin nas amostras. A linearidade da ligação com a faloideina foi observada na faixa de 50 a 200 proteínas microgramas.Como prova de princípio, também testamos a eficácia de nosso ensaio em modelos de despolimerização F-actin usando interrupção farmacológica de filamentos de actina por Latrunculin A, bem como estimulação da formação de F-actin por estimulação mediada de KCl de terminais sinápticos isolados. A emissão de fluorescência da faloideina ligada pode ser expressa como qualquer unidade de faloideina ligada gerada a partir da curva linear padrão e são relativas às amostras de controle. Para a Figura 4, os níveis de F-actin são expressos como micro unidades de faloideina vinculada.Por outro lado, para a Figura 5 F-actin níveis nos fragmentos sinápticos despolarizados são expressos em relação ao controle de amostras não despolarizadas. Descrevemos um ensaio robusto, eficiente e de alto rendimento para análise de filamentos de actina, ou F-actin, e suas alterações em estados fisiológicos e fisiofósicos adequados para um formato de placa de 96 poços. O ensaio é muito mais rápido do que os protocolos alternativos existentes e pode servir como uma ferramenta essencial em estudos relacionados à actina, sozinho ou em combinação com os ensaios baseados em imunohistoquímica existentes e manchas ocidentais.

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Este vídeo demonstra o procedimento para coloração fluorescente de neurônios corticais de ratos para microscopia. Ele tem como alvo a F-actina e as proteínas dendríticas para analisar a integridade estrutural e calcular a densidade da F-actina, que é crucial para estudar a função e a saúde neuronal.

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Nós apresentamos uma análise (HCA) instrumento de alto conteúdo open source utilizando imagens de fluorescência vida automatizado (FLIM) para ensaiar interações proteína usando Förster transferência de energia de ressonância (FRET) leituras base. Aquisição de dados para este instrumento openFLIM-HCA é controlada por software escrito em μManager e análise de dados é realizado em FLIMfit.

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Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.

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Descrevemos como micro e photomanipulation técnicas tais como o FRAP e photoactivation permitem a determinação de parâmetros de motilidade e a spatiotemporal dinâmica de proteínas dentro de migração de células. Leituras experimentais incluem subcellular dinâmica e volume de negócios de reguladores da motilidade ou o citoesqueleto de actina subjacente.

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Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

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