Name: Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis após maturação in vitro. Este protocolo padronizado demonstra técnicas de criopreservação para preservação de biodiversidade e melhoramento genético em biotecnologia animal.

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Os autores não receberam nenhum financiamento específico para este trabalho. A professora Maria Grazia Cappai e a Dra.

O protocolo animal e os procedimentos implementados descritos abaixo estão de acordo com as diretrizes éticas vigentes na Universidade de Sassari, em conformidade com a Diretiva da União Europeia 86/609/CE e a recomendação da Comissão das Comunidades Europeias 2007/526/CE.
1. Preparação de mídia para manipulação de oócitos
<ol><li>Prepare o meio para o transporte de ovários coletados suplementando o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco com penicilina de 0,1 g/L e estreptomicina de 0,1 g/L (PBS).</li>
	<li>Prepare o meio para coleta e maturação de oócitos diluindo 9,5 g de Tissue Culture Medium (TCM) 199 em pó com 1 L de água Milli-Q suplementada com penicilina (0,1%) e estreptomicina (0,1%).<ol>
<li>Após a diluição, filtre 100 mL de médio e armazene-o a 4 °C como Stock Maturation Medium (SMM) a ser usado por uma semana.</li>
		<li>Prepare o meio de coleta (CM) suplementando os 900 mL restantes com HEPES de 25 mM, bicarbonato de 0,36 g/L e 0,1% (w/v) álcool polivinyl (PVA) (pH 7,3, osmolalidade 290 mOsm/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o meio de maturação com SMM suplementado com 0,021 g/L bicarbonato, 10% soro de ovelhas tratado a calor, 1 UI/mL FSH, 1 UI/mL LH, 100 μL de cisteamina e 8 mg/mL de piruvato. NOTA: O meio de maturação em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% de CO2 no ar) por pelo menos 4h antes do uso.</li>
	<li>Prepare o meio base (BM) para manipulação de oócito após a maturação in vitro, consistindo em PBS sem Ca++ e Mg++, suplementado com soro de bezerro fetal de 20% (FCS).</li>
</ol>2. Coleta e maturação de oócitos
<ol><li>Recuperar os oócitos de ovários juvenis (30-40 dias de idade, peso corporal de 6-10 kg) e ovários adultos.</li>
	<li>Transporte os ovários coletados do matadouro comercial para o laboratório dentro de 1-2 h na PBS a 27 °C.</li>
	<li>Depois de lavar em meio fresco PBS, corte os ovários em CM usando uma micro-lâmina para liberar o conteúdo do folículo.</li>
	<li>Sob um exame estereomicroscópio com ampliação de 60x, selecione complexos cumulus-oócitos (COCs) para maturação in vitro, escolhendo aqueles com 4-10 camadas de células de granulosa, oócito com um citoplasma uniforme, distribuição homogênea de gotículas lipídicas no citoplasma e com o diâmetro externo de cerca de 90 μm (média).</li>
	<li>Lave os COCs selecionados três vezes em CM e, finalmente, transfira-os em meio de maturação. NOTA: Para osócitos juvenis, para melhorar a sobrevida após a vitrificação, suplemente o meio de maturação com trehalose de 100 μM.</li>
	<li>Para maturação in vitro, transfira 30-35 COCs em 600 μL de meio de maturação em placas de Petri de quatro poços, cobertas com 300 μL de óleo mineral e incuba-los para 22 (oócitos adultos)/24 (oócitos juvenis) h em 5% CO2 no ar a 39 °C.</li>
	<li>Após a maturação in vitro, denude COCs de células cumulus por pipetação suavemente. Após o exame sob um estereótipo com ampliação de 60x, selecione apenas aqueles que mostram a extrusão no primeiro corpo polar e, portanto, no estágio metafase II (MII), para vitrificação.</li>
</ol>3. Procedimentos de coleta de sêmen, congelamento e descongelamento
<ol><li>Prepare o meio base para criopreservação de sêmen consistindo em extensor de carneiro (200 mM Tris; ácido cítrico de 70 mM; 55 mM de frutose; pH 7.2, osmolalidade 300 mOsm/kg) suplementado com gema de ovo 20% (v/v).</li>
	<li>Recolher o sêmen somente durante a estação de criação de ovinos (outubro a novembro).</li>
	<li>Obter ejaculações por vagina artificial de carneiros adultos (idades de 2 a 5 anos), mantidos em ambiente ao ar livre e alimentados com uma ração de manutenção de peso vivo. Mantenha os carneiros isolados em canetas separadas, mas com contato visual entre si.</li>
	<li>Repita a coleta de sêmen uma por semana durante toda a estação de reprodução para obter pelo menos 8 ejaculações de cada macho.</li>
	<li>Transporte as amostras de sêmen para o laboratório em temperatura ambiental dentro de 5 minutos após a coleta e processo imediato. Acumule as ejaculações de dois ou três carneiros e avalie a espectrofotometria da concentração de esperma.</li>
	<li>Após a piscina, diluir as ejaculações até 400 x 106 espermatozoides/mL com meio base para criopreservação de sêmen suplementada com 4% de glicerol. Em seguida, esfrie o sêmen diluído a 4 °C durante um período de 2h e equilibre-o por 20 minutos antes de congelar.</li>
	<li>Congele as amostras de sêmen em forma de pelotas (0,25 mL) em gelo seco e, em seguida, mergulhe-as em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Para descongelar, coloque a pelota em um falcão de vidro esterilizado e mergulhe-a em um banho de água por 20 s a 39 °C.</li>
</ol>4. Fertilização in vitro e cultura de embriões
<ol><li>Prepare os estoques para a constituição do fluido oviductal sintético (SOF).<ol>
<li>Preparar estoque A: 99,4 mL de água milliq; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g de KH2PO4; 0,182 g de MgSO4 ·7H2O; e 0,6 mL de Lactato de Sódio. Mantenha-se a 4 °C por até 3 meses.</li>
		<li>Preparar estoque B: 10 mL de água milliq; 0.210 g de NaHCO3; e 2-3 g de Phenol Red. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.</li>
		<li>Preparar estoque C: 10 mL de água milliq; e 0,051 g de piruvato de sódio. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.</li>
		<li>Preparar estoque D: 10 mL de água milliq; e 0,262 g de CaCl2 2H2O. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.</li>
		<li>Prepare 10 mL de SOF consistindo de 7.630 mL de água MilliQ, 1 mL de Estoque A, 1 mL de Estoque B, 0,07 mL de Estoque C e 0,7 mL de estoque D.</li>
		<li>Prepare o meio de fertilização in vitro (FIV): SOF suplementado com 2% de soro de ovelhas estrous tratados a calor, heparina de 10 μg/mL e hipoutarina de 1 μg/mL (osmolalidade 280-290 mOsm/kg). NOTA: O meio de FIV em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% DE CO2, 5% O2 e 90% N2) pelo menos 4 horas antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira alíquotas de sêmen congelada/descongelada em um tubo cônico de vidro esterilizado abaixo de 1,5 mL de meio de FIV aquecido e incuba-os por 15 min a 39 °C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 no ar.</li>
	<li>Após a incubação, os espermatozoides motil nadam em direção à porção apical da coluna líquida. Colete a camada superior e observe para avaliação de motilidade do esperma. NOTA: Os parâmetros de motilidade do esperma devem ser avaliados utilizando-se um sistema de análise de esperma assistido por computador (CASA) com as seguintes configurações: 25 quadros adquiridos para evitar a sobreposição de faixas de espermatozoides, contraste mínimo 10, velocidade mínima de 30 μm/s e motilidade progressiva > retidão de 80%. Este sistema tem uma configuração específica para avaliação de esperma de carneiro. Para cada amostra, 5 μL subsample de suspensão de esperma são carregados em uma câmara de análise pré-aquecida com uma profundidade de 10 μm. A motilidade do esperma é avaliada a 37 °C a 40x usando um microscópio de contraste de fase e um mínimo de 500 espermatozoides por subsampleção deve ser analisado em pelo menos quatro diferentes campos microscópicos. Foi avaliado o percentual de espermatozoides motile total e progressivo. Para a FIV, o percentual de espermatozoides motile progressivo deve ser de ≥ 30%.</li>
	<li>Diluir o espermatozoide derivado de motil derivado em 1 x 106 concentração final de espermatozoides/mL e co-incuba-los com oócitos MII em 300 μL de fiv médio coberto com óleo mineral em placas de Petri de quatro poços.</li>
	<li>Após 22 h de transferência os zigotes presuntivos em pratos petri de quatro poços contendo SOF suplementado com 0,4% de albumina de soro bovino e aminoácidos essenciais e não essenciais na concentração oviductal, conforme relatado por16 sob óleo mineral e cultural-los em condições padrão até o estágio blastocísta.</li>
	<li>Em 22-, 26-e 32-h pós-inseminação, regise o número de oócitos cerrados, mostrando dois blastomeres distintos, pelo exame sob um estereomicroscópio com ampliação de 60x.</li>
	<li>Observe os embriões diariamente a partir do quinto ao nono dia de cultura e os blastocistos recém-formados devem ser registrados pelo exame sob um estereoscópio com ampliação de 60x.</li>
</ol>5. Vitrificação e aquecimento de Oócitos
NOTA: Realize a vitrificação seguindo o método de volume essencial mínimo (MEV) utilizando criotops do dispositivo17.
<ol><li>Equilibre um grupo de cinco oócitos a 38,5 °C por 2 min em BM. O uso de BM garante baixa concentração de cálcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.</li>
	<li>Desidratar os oócitos com uma solução de equilíbrio de 3 minutos contendo 7,5% (v/v) sulfóxido de dimetil (DMSO) e 7,5% (v/v) glicol de etileno (EG) em BM.</li>
	<li>Transfira os oócitos para a solução de vitrificação contendo 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG e 0,5 M de trehalose em BM antes de carregá-los em um dispositivo criotop e ingô-los diretamente em nitrogênio líquido dentro de 30 s.</li>
	<li>Para aquecer a uma temperatura biológica, transfira o conteúdo de cada dispositivo de vitrificação de nitrogênio líquido para gotas de 200 μL de 1,25 M de trehalose em BM por 1 min a 38,5 °C, e mexa suavemente para facilitar a mistura.</li>
	<li>Para promover a remoção de crioprotetores intracelulares, transfira oócitos stepwise em 200 μL gotas de soluções de trehalose decrescentes (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose em BM) para 30 s a 38,5 °C antes de ser equilibrado por 10 min a 38,5 °C em BM.</li>
</ol>6. Avaliação da qualidade do oócito pós-aquecimento
<ol><li>Após o aquecimento, incubar os oócitos por 6h em PBS sem Ca++ e Mg++ mais 20% FCS (BM) em 5% de CO2 no ar a 38,5 °C. NOTA: A capacidade oócito de restaurar características biológicas e estruturais após a vitrificação é em relação às espécies e classes de oócitos usados.</li>
	<li>Uma vez que a capacidade oócito de recuperar danos criopreservadores é dependente do tempo, avalie a qualidade do oócito em diferentes pontos de tempo da cultura in vitro (0h, 2h, 4h, 6h) após o aquecimento, para definir a janela de tempo ideal para fertilização oócica. NOTA: No oócito de ovelhas adultas, o tempo ideal é 4h após o aquecimento; para oócito prepubertal, o tempo ideal é 2 h pós-aquecimento.</li>
</ol>7. Avaliação de sobrevivência de Oócito
<ol><li>Imediatamente após o aquecimento e para cada ponto de tempo da cultura pós-aquecimento, avalia morfologicamente osócitos usando um microscópio invertido com ampliação de 100x. NOTA: Os oócitos com alterações estruturais, como citoplasma fraco, dano zona pellucida e/ou membrana devem ser classificados como degenerados.</li>
	<li>Valide a avaliação da integridade da membrana usando uma coloração fluorescente dupla diferencial.</li>
	<li>Incubar os oócitos em 2 mL de BM contendo iodeto de propídio (PI; 10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) por 5 min em 5% CO2 no ar a 38,5 °C.</li>
	<li>Depois de lavar três vezes em BM fresco, observe os oócitos sob um microscópio fluorescente usando um filtro de excitação de 350 nm e emissão de 460 nm para Hoechst 33342 e um filtro de excitação de 535 nm e emissão de 617 nm para PI. NOTA: Oócitos com membrana intacta podem ser reconhecidos pela fluorescência azul do DNA colorido com Hoechst 33342. Oócito com membranas danificadas mostram uma fluorescência vermelha devido à coloração de DNA com PI.</li>
</ol>8. Avaliação da atividade mitocondrial e dos níveis intracelulares ROS por microscopia de varredura a laser confocal
<ol><li>Prepare a sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).<ol>
<li>Diluir o teor de 1 frasco (50 μg) com 1 mL de DMSO para obter uma solução de 1 mM. Mantenha o frasco diluído em nitrogênio líquido.</li>
		<li>Diluir a solução 1 mM com o DMSO para obter a solução de estoque de 100 μM e armazená-la a -80 °C no escuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a sonda diacetato de 2′,7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA).<ol>
<li>Diluir o H2DCF-DA em 0,1% de pyrrolidone polivinyl (PVA)/PBS para obter a primeira solução de 100 mM. Mantenha a solução a -80 °C no escuro .</li>
		<li>Diluir a primeira solução em PVA/PBS de 0,1% para obter a solução de estoque de 100 μM. Armazená-lo a -20 °C no escuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o meio de montagem (MM): para 10 mL de MM, adicione 5 mL de glicerol, 5 mL de PBS e 250 mgs de azida de sódio. Armazená-lo a -20 °C até usar.</li>
	<li>Incubar os oócitos por 30 min a 38,5 °C em BM com 500 nM MT-Red (solução de estoque: 100 μM em DMSO).</li>
	<li>Após a incubação com a sonda MT-Red, lave os oócitos três vezes em BM e incubar por 20 minutos na mesma mídia contendo 5 μM H2DCF-DA (solução de estoque: 100 μM em BM).</li>
	<li>Após a exposição às sondas, lave os oócitos em BM e fixe em 2,5% glutaraldeído/PBS por pelo menos 15 min.</li>
	<li>Após a fixação, lave os oócitos três vezes em BM e monte em lâminas de vidro em uma gota de 4 μL de MM com 1 mg/mL Hoechst 33342 usando almofadas de cera para evitar a compressão das amostras.</li>
	<li>Armazene slides a 4 °C no escuro até a avaliação.</li>
	<li>Realize a análise de seções imunolabelladas com um microscópio de varredura a laser confocal. O microscópio é equipado com lasers Ar/He/Ne, usando um objetivo de óleo de 40/60x. Analise as seções por excitação sequencial.</li>
	<li>Para avaliação mitocondrial, observe as amostras com um laser multifotônio para detectar MT-Red (exposição: 579 nm; emissão: 599 nm).</li>
	<li>Use um raio laser de íons de argônio a 488 nm e o filtro B-2 A (exposição de 495 nm e emissão de 519 nm) para apontar o diclorofluoresceína (DCF)18.</li>
	<li>Em cada oócito individual, meça as intensidades de fluorescência MT-Red e DCF no plano equatorial19.</li>
	<li>Manter parâmetros relacionados à intensidade da fluorescência em valores constantes durante todas as aquisições de imagem (energia laser 26%, Configurações sequenciais 1: PMT1 ganhar 649-PMT2 ganho 482; Configuração sequencial 2: PMT1 ganhar 625-PMT2 ganho 589; compensação 0; tamanho do pinhole: 68).</li>
	<li>Realize a análise quantitativa da intensidade da fluorescência utilizando o pacote de software de análise de imagem Leica LAS AF Lite, seguindo os procedimentos padronizados até20.</li>
	<li>Capture as imagens uma vez, movendo-se no eixo Z, até chegar ao plano equatorial.</li>
	<li>Para cada foto, transformar-se em escala cinza e desligar o canal 1 (relacionado ao azul Hoechst) foi desligado. Em seguida, desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) em uma área circunscrita, que fica ao redor do eixo meiotic. NOTA: O software pode ler automaticamente o valor médio do pixel no canal 2 (FITC), subtraindo o valor do plano de fundo a partir dele.</li>
	<li>Regissuas médias dos pixels e submeta-se para análise estatística.</li>
</ol>9. Análises Estatísticas
<ol><li>Analise as seguintes diferenças: taxas de sobrevivência em oócitos juvenis vs adultos, taxas de sobrevivência e competência de desenvolvimento no controle e oócitos juvenis tratados com trehalose, taxas de sobrevivência e ativação partenogenética e competência de desenvolvimento de oócitos adultos vitrificados com diferentes meios de concentração de cálcio, taxas de fertilização e produção de embriões em oócitos juvenis vitrificados com baixa ou alta concentração de cálcio, fenótipos mitocondrias ativos em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento e taxas de ativação partenogenética entre oócitos vitrificados adultos e juvenis usando o teste quadrado chi.</li>
	<li>Analise a taxa de decote e a saída de embriões em oócitos adultos vitrificados durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento, intensidade de fluorescência da atividade mitocondrial e níveis intracelulares ROS em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento pela ANOVA após análise para homogeneidade de variância pelo teste de Levene. Use um teste de tukey pós-hoc para destacar diferenças entre e entre grupos.</li>
	<li>Realizar análises estatísticas utilizando o programa de software estatístico e considerar uma probabilidade de P < 0,05 ser o nível mínimo de significância. Todos os resultados são expressos como ± S.E.M.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A criopreservação de oócito em animais domésticos pode permitir não apenas a conservação a longo prazo dos recursos genéticos femininos, mas também avançar no desenvolvimento de biotecnologias embrionárias. Assim, o desenvolvimento de um método padrão de vitrificação oócito beneficiaria tanto a pecuária quanto o setor de pesquisa. Neste protocolo, é apresentado um método completo para vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e pode representar um ponto de partida sólido para o desenvolvimento de um sistema eficiente de...

O armazenamento a longo prazo dos gametas femininos pode oferecer uma ampla gama de aplicações, como melhorar a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuir para preservar a biodiversidade através do programa de conservação de espécies de animais selvagens ex-situ, e impulsionar pesquisas e aplicações em biotecnologia in vitro graças à disponibilidade de oócitos armazenados a serem incorporados em programas de produção de embriões in vitro ou transplante nuclear1,2,3. A vitrificação de oócitos juvenis também aumentaria o ganho genético, encurtando o intervalo de geração nos programas de reprodução4. A vitrificação por resfriamento ultrarrápido e aquecimento de oócitos é atualmente considerada uma abordagem padrão para oócitos de pecuária criopreservação5. Em ruminantes, antes da vitrificação, os oócitos são geralmente amadurecidos in vitro, após a recuperação de folículos obtidos de ovários derivados do matadouro2. Ovários adultos, e especialmente pré-púbertos4,6, podem de fato fornecer um número praticamente ilimitado de oócitos para serem criopreservados.
No gado, após a vitrificação e oocito vitrificação e aquecimento, os rendimentos do blastocisto em >10% têm sido comumente relatados por vários laboratórios durante a última década3. No entanto, em pequenos ruminantes a vitrificação de oócitos ainda é considerada relativamente nova para os oócitos juvenis e adultos, e um método padrão para vitrificação de oócitos de ovelhas permanece a ser estabelecido2,5. Apesar dos avanços recentes, o oócito vitrificado e aquecido apresenta de fato várias alterações funcionais e estruturais que limitam seu potencial de desenvolvimento7,8,9. Assim, poucos artigos relataram o desenvolvimento de blastocistos em 10% ou mais em oócitos de ovelhas vitrificadas/aquecidas2. Várias abordagens têm sido investigadas para reduzir as alterações acima mencionadas: otimização da composição das soluções de vitrificação e descongelamento10,11; experimentando o uso de diferentes dispositivos criográficos8,12,13; e a aplicação de tratamentos específicos durante a maturação in vitro (IVM)4,14,15 e/ou durante o tempo de recuperação após o aquecimento6.
Aqui descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diclorofluorescina diacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>Albumina fração bovina V, livre de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimida H 33342 tricloridrato (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td> Microscópio confocal de varredura a laser <td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td> Medical <td>Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisteamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) Frutose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Trealose desidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Fosfato Tampolado Salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gema de ovo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hipoutarina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-cistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-Valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Contagem Makler</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Médio 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Soro de bezerro recém-nascido inativado por calor (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Álcool polivinílico (87-90% hidrolisado, peso médio mol 30.000-70.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Soro de ovelha</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Xarope de solução de dl-lactato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de classe de espermatozóides</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software estatístico Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificação de oócitos maduros in vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

Na pecuária, sistemas de produção de embriões in vitro podem ser desenvolvidos e sustentados graças ao grande número de ovários e oócitos que podem ser facilmente obtidos de um matadouro. Ovários adultos sempre carregam vários folículos antrais, enquanto em doadores pré-pubertal o número máximo de oócitos está disponível às 4 semanas de idade, quando os ovários carregam um número máximo de folículos antral. Assim, cordeiros de 4 semanas são considerados bons doadores, mesmo que a competência de desenvolvimento dos oócitos pré-púricionais seja menor em comparação com sua contraparte adulta. 
Pesquisas básicas e aplicações comerciais seriam impulsionadas pela possibilidade de criopreservar oócitos vitrificados obtidos com sucesso tanto de doadores adultos quanto pré-púrias. A vitrificação do oócito coletado de doadores pré-púrias também permitiria encurtar o intervalo de geração e, assim, aumentar o ganho genético em programas de reprodução. No entanto, a perda do potencial de desenvolvimento após a criopreservação torna os oócitos mamíferos provavelmente um dos tipos de células mais difíceis de criopreservar. Entre as técnicas de criopreservação disponíveis, a vitrificação é amplamente aplicada aos oócitos animais e humanos. Apesar dos recentes avanços na técnica, exposições a altas concentrações de agentes crioprotetores, bem como lesões arrepiantes e estresse osmótico ainda induzem várias alterações estruturais e moleculares e reduzem o potencial de desenvolvimento dos oócitos mamíferos. Aqui, descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e incubação pós-aquecimento. Os oócitos vitrificados na fase MII podem de fato ser fertilizados após o aquecimento, mas eles precisam de tempo extra antes da fertilização para restaurar os danos devido aos procedimentos criopreservadores e aumentar seu potencial de desenvolvimento. Assim, as condições e o tempo da cultura pós-aquecimento são passos cruciais para a restauração do potencial de desenvolvimento do oócito, especialmente quando o oócito é coletado de doadores juvenis.

A criotolerância do oócito de doadores juvenis é menor em comparação com as adultas. O primeiro efeito observado é uma menor taxa de sobrevivência pós-aquecimento em comparação com os oócitos adultos (Figura 1A; χ2 teste P&lt;0,001). Os oócitos juvenis apresentaram menor integridade da membrana após o aquecimento(Figura 1B). O uso de trehalose no meio de maturação destinava-se a verificar se esse açúcar poderia reduzir os crioinjuutos em oócitos juven...

O protocolo visa fornecer um método padrão para a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis. Inclui todos os passos desde a preparação dos meios de amadurecimento in vitro até a cultura pós-aquecimento. Os oócitos são vitrificados na fase MII usando o Cryotop para garantir o volume essencial mínimo.

Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

A manutenção da viabilidade potencial oócida após o armazenamento a longo prazo representa uma ferramenta de grande oportunidade, pois melhoraria a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuiria para preservar a biodiversidade através da conservação de espécies de animais selvagens e aumentaria a pesquisa em biotecnologia. A vitrificação de oócitos juvenis foi muito menor no intervalo de geração em programas de reprodução. A vitrifação pelo resfriamento e aquecimento de ultraarrapidas é considerada uma abordagem padrão na preservação do oócito do gado.No entanto, em ovelhas este procedimento ainda é considerado relativamente novo e falta um método padrão. Neste vídeo, descrevemos um protocolo para vitrificação de oócito de ovelha, coletado de doadores juvenis e adultos, e in vitro amadurecido antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde a maturação in vitro, vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.Após a recuperação do complexo de oócitos cumulus, onde amadureceu in vitro por 24 horas em estática uma condição que inclui para oócito juvenil, a suplementação com cem micromolar de trehalose em meio de maturação. Após a maturação in vitro, os oócitos foram desnudados de células Cumulus mecanicamente por tubos suavemente e examinados sob microscópio estéreo, com ampliação de 60x. A seleção dos oócitos para apresentar nos procedimentos de vitrificação representa o primeiro passo importante para garantir a aplicação bem sucedida deste procedimento.Somente aqueles com o citoplasma uniforme, com distribuição homogênea de gotículas lipídicas, integridade de toda Emma larga e contínua pivô no espaço, zona compacta pellucida o diâmetro externo de cerca de 19 micrômetros e mostrando a extrusão do primeiro corpo polar, e assim no M2, o estágio deve ser selecionado. A vitrificação foi realizada utilizando-se o método de volume essencial mínimo, com um dispositivo Cryotops. Após a seleção, um grupo de cinco oócitos juvenis foram condicionados a 38,5 graus Celsius em média base por dois minutos.Os oócitos foram então desidratados por três minutos de exposição a uma solução de calibração. O carregamento do oócito no dispositivo de vitrificação utilizado é um passo importante e crítico. O criotop usa uma tira de polipropileno presa a um suporte.Neste método, os oócitos na solução de vitrificação, menos de 0 ponto mililitro são rapidamente carregados com um capilar de vidro em cima da tira de filme. Em seguida, a solução deve ser removida, deixando para trás uma camada fina o suficiente para cobrir as células a serem criopreservadas. Antes de ser carregado no dispositivo Cryotop e diretamente mergulhado em nitrogênio líquido dentro de 30 segundos.Para temperatura biológica interior quente, o conteúdo de cada dispositivo de vitrificação foi transferido do nitrogênio líquido para 200 gotas de microliter de solução de trehalose decrescente. Os oócitos foram transferidos o conjunto foi, arrastando os oócitos com uma pipeta fina e de vidro, para promover a remoção de crioprotetores intracelulares. Finalmente, os oócitos foram pré-criados em um meio base em incubadora em 5% de dióxido de carbono.Imediatamente após o aquecimento, e para cada ponto de tempo da cultura pós-aquecimento, os oócitos foram avaliados morfologicamente usando um microscópio invertido com ampliação de 100x. A tolerância criogenada de oócitos de doadores juvenis é menor em comparação com as alteradas com menor integridade da membrana após o aquecimento. O uso de trehalose no meio de maturação induzido em oócitos juvenis maior integridade da membrana, aumentando as taxas de sobrevivência após a vitrificação.No entanto, as taxas de decote, fertilização e desenvolvimento de oócitos juvenis não foram aumentadas pela suplementação de trehalose. O uso de mídia com concentração de cálcio igual a 2,2 miligramas de dizlitos para a vitrificação de oócitos juvenis, deve maiores taxas de fertilização em comparação com oócitos vitrificados com concentração de cálcio, mas não foram encontradas diferenças que permitam a produção. Comparando a cultura pós-aquecimento em diferentes durações, mostramos que após quatro horas de oócito cultural coletado de dois mais velhos são capazes de recuperar as ligações energéticas e a configuração microtubular, e restaurar a competência de desenvolvimento com maior desperdício de decotes e blastócitos.A atividade mitocondrial foi maior em oócitos juvenis vitrificados após quatro horas de cultura pós-aquecimento, em comparação com outros pontos de tempo. A parting de distribuição mitocondrial também mudou durante seis horas de cultura pós-aquecimento. Além disso, os níveis intracelulares de espécies de oxigênio reativas foram significativamente menores em oócitos juvenis em duas horas de cultura pós-aquecimento em comparação com 0, 4 e 6 horas.No entanto, e em contraste com o encontrado em outros oócitos, as taxas de ativação partenogentica espontânea aumentaram durante a cultura pós-aquecimento em oócitos juvenis. Uma das principais vantagens do método proposto é que ele inclui todas as etapas desde a coleta de oócito até a maturação in vitro, vitrificação e aquecimento. Além disso, inclui um período de cultura pós-aquecimento para permitir a recuperação de oócitos dos danos incorridos durante o procedimento de vitrificação.Escolher o momento ideal para fertilização é desafiador, podendo impactar no resultado do programa de vitrificação. Deve-se considerar também que, ao contrário do congelamento lento, a vitrificação é uma técnica manual e, portanto, é dependente do operador. Por essa razão, um grande desafio é a necessidade de técnicos e pesquisadores qualificados que levem em consideração o efeito operador na avaliação do resultado do programa de vitrificação.Outros estudos do nosso laboratório permitirão a tentativa de padronizar o procedimento de vitrificação e seleção de oócitos, e em melhor composição da mídia para as necessidades do oócito juvenil. Um desrespeito ao uso da cultura e do caráter e antioxidante oferecemos oportunidades promissoras.

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.

Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo

Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

Este manuscrito descreve um protocolo para a vitrificação de volume mínimo de oócitos imaturos de gatos com mídias de laboratório sobre suportes comerciais. Abrange cada passo desde o isolamento oócito desde gônias ex vivo até vitrificação e aquecimento.

Vitrificação de Volume Mínimo de Oócitos Felinos Imaturos

Descrevemos os procedimentos para o isolamento dos oócitos em crescimento dos folículos ovarianos nos estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a criação de um sistema de cultura in vitro que possa apoiar o crescimento e a diferenciação até o estágio totalmente crescido.

Estratégia de Cultura In Vitro para Oócitos do Folículo Antral Primitivo em Bovinos

A criopreservação oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas. Estratégias clínicas e laboratoriais adequadas garantem a máxima eficácia, eficiência e segurança dos tratamentos de preservação da fertilidade.

Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

Um protocolo para a vitrificação de tecido ovariano, como um método alternativo de criopreservação ao protocolo de congelamento lento amplamente utilizado, é apresentado.

Vitrificação do tecido do córtex ovariano para atingir um estado vítreo de agregação

Aqui, apresentamos o protocolo Spatula Montevideo para vitrificação de embriões pré-implantacionais de camundongos e ovelhas, consistindo em uma espátula caseira e utilizando soluções caseiras. Os embriões são rapidamente equilibrados em duas soluções crioprotetoras de concentração crescente, carregadas na espátula, imersas em nitrogênio líquido e, finalmente, seladas com um canudo de 0,5 mL.

Espátula Montevidéu Dispositivo para vitrificação de embriões de mamíferos

Este protocolo descreve métodos padronizados para isolar e processar fluido folicular, células somáticas e oócitos imaturos de procedimentos de fertilização in vitro, permitindo análises moleculares e celulares de alta qualidade. Essas abordagens apóiam a pesquisa translacional em fertilidade, envelhecimento reprodutivo e disfunção ovariana usando materiais normalmente descartados em cuidados clínicos.

Coleta de fluido folicular humano, células somáticas foliculares e oócitos imaturos de indivíduos submetidos à fertilização in vitro

Descrevemos métodos de manipulação de oócitos imaturos de Xenopus laevis, maturação in vitro de oócitos em óvulos e injeção intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite a degradação de algumas proteínas maternas e a superexpressão de genes de interesse na fertilização e, portanto, é valioso para estudar papéis de fatores específicos no desenvolvimento embrionário inicial.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Aprenda a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis após maturação in vitro. Este protocolo padronizado demonstra técnicas de criopreservação para preservação de biodiversidade e melhoramento genético em biotecnologia animal.

Vitrificação de Oócitos Maduros In Vitro coletados de ovários adultos e prepubertais em ovelhas

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