Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

Em combinação com imagens de cálcio de células vivas, a técnica aguda de fatia de tecido pancreas permite o estudo de ondas intercelulares e conectividade funcional multicelular com alta resolução por longos períodos de tempo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, preserva a arquitetura tecidual e reduz o estresse enzimático e mecânico limitado, mantendo um alto rendimento de tecido. Ao detectar alterações funcionais e morfológicas durante a progressão da doença, essa técnica ajuda a entender as doenças relacionadas ao pâncreas, como o diabetes.

Essa técnica de fatia de tecido pode ser aplicada aos tecidos cerebrais, pituitários e adrenal com ênfase na preservação do contato intercelular, interações paracrinas e arquitetura tecidual. Para se preparar para a injeção de agarose no pâncreas do rato, encha uma seringa de cinco mililitros com 40 graus Celsius de líquido agarose e equipe a seringa com uma agulha calibre 30. Depois de cobrir cuidadosamente a agulha com uma tampa, coloque a agulha da seringa para baixo, com todo o volume de agarose abaixo da superfície da água, em um banho de água de 40 graus Celsius.

Bubble uma garrafa de solução extracelular com carbogênio, continuamente no gelo, a 1,5 mililitros por minuto a pressão barométrica e temperatura ambiente para garantir a oxigenação e um pH de 7,4. Para realizar a injeção de agarose coloque um rato adulto eutanizado sob um microscópio estéreo e acesse o abdômen do rato através da laparotomia. Mova suavemente o intestino para o lado esquerdo para expor o ducto biliar comum e use fórceps para levantar ligeiramente a extremidade duodenal do duto para localizar a papila de Vater.

Use um hemostat para fixar o ducto biliar na papila duodenal para evitar o vazamento da agarose do duto no duodeno e use um pequeno fórceps afiados para alcançar sob o ducto biliar comum para quebrar a membrana que liga o ducto ao tecido pancreático. Depois de limpar o máximo de gordura e tecido conjuntivo possível do duto, coloque o duto perpendicularmente sobre as pontas de um par de fórceps maiores, e pressionando firmemente sobre o êmbolo da seringa, injete a agarose líquida viscosa na extremidade proximal do ducto biliar comum por 20 a 30 segundos. Quando o tecido ficar esbranquiçado e ligeiramente distendido remova a seringa e despeje lentamente 20 mililitros da solução extracelular gelada borbulhante no pâncreas para resfriar o tecido e endurecer a agarose.

Para adquirir fatias de tecido pancreático use fórceps e tesouras finas e duras para transferir suavemente o pâncreas injetado agarose em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de solução extracelular gelada. Gire o prato para enxaguar o tecido e transfira o pâncreas para um segundo prato de solução extracelular gelada. Use as fórceps e a tesoura para cortar a seção de pâncreas esbranquiçado e bem injetado em até seis pedaços de 0,1 a 0,2 centímetros cúbicos e remova qualquer tecido conjuntivo e gorduroso restante dos pedaços de tecido.

Coloque os blocos limpos em uma placa de Petri de fundo não pegajoso de 35 milímetros contendo aproximadamente cinco mililitros de 40 graus Celsius de líquido surgido e coloque imediatamente a placa de Petri no gelo. Quando a agarose endurecer, segure a placa de Petri de cabeça para baixo sobre a tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros e use metade de uma lâmina de barbear para cortar cuidadosamente a margem entre a parede lateral da placa de Petri e a agarose para remover a agarose da placa. Use a lâmina de barbear para cortar cubos individuais, cada um contendo um bloco de tecido de agarose, da agarose livre e use cola cianoacrilato para anexar os blocos à placa de amostra de um vibratome.

Encha a câmara de corte do vibratome com 150 mililitros de solução extracelular gelada continuamente borbulhada com carbogen. Fixar a placa de amostra no vibratome e montar uma nova lâmina de barbear. Cerque a câmara com gelo e adicione dois cubos de gelo de volume de 10 mililitros feitos com solução extracelular suplementada com seis milimões de glicose.

Coloque o cortador em 0,05 a 1 milímetro por segundo e 70 hertz, depois comece a cortar para adquirir 140 mícrons de fatias de agarose de espessura com uma área de superfície de 20 a 100 milímetros quadrados. Use uma escova de tinta fina para transferir cuidadosamente cada fatia em uma placa de Petri de 100 milímetros recheada com 40 milímetros de tampão HEPES suplementado com glicose de seis milímetros. Para a preparação de corante de cálcio, dissolva 50 microgramas de corante indicador de cálcio permeável celular, 7,5 microlitros de DMSO e 2,5 microlitros do poloxamer, e 6,667 mililitros de HBS em um tubo de tampa de parafuso de 15 mililitros.

Use uma pipeta para misturar completamente a solução por 20 segundos antes de submergir o tubo em uma câmara de banho ultrassônico e vórtice, cada um por 30 segundos. Em seguida, alíquota de 3.333 mililitros da solução de corante indicador de cálcio resultante em uma placa de Petri de 5 mililitros por 10 fatias de tecido a serem rotuladas. Para o carregamento de corante, use um pincel fino e macio para transferir até 10 fatias de tecido para cada prato de solução de corante e coloque os pratos em um agitador orbital por 50 minutos à temperatura ambiente e 40 revoluções por minuto protegidas da luz.

Ao final da incubação, transfira até 20 fatias manchadas em pratos individuais de 60 mililitros de Petri recheados com HBS sem corante. Para a imagem de cálcio por microscopia confocal selecione uma ampliação de 20 ou 25 vezes e defina o modo de aquisição para imagens de lapso de tempo, o pinhole para 100 a 200 mícrons, e a excitação e emissão para o fluorohore usado no experimento. Monte a câmara de gravação e o sistema de perfusão no estágio controlado pela temperatura do microscópio e posicione a entrada e a saída nas bordas distantes da câmara de gravação.

Defina as taxas de entrada e saída para um a dois mililitros por minuto. Coloque a temperatura do sistema de profusão a 37 graus Celsius e inicie a profusão com a solução não estimulante. Para registrar a dinâmica do cálcio do tecido coloque uma única fatia de tecido na câmara de gravação e imobilize o tecido com um peso de platina em forma de U com uma malha de nylon tenso.

Use a opção de campo brilhante para localizar a estrutura de interesse e usar imagens vivas para posicionar as estruturas estudadas no campo de visão. Para otimizar a relação sinal-ruído, ajuste a potência do laser, a amplificação do detector e a média de binning de linha, mantendo a potência do laser mínima. Ajuste o plano focal para 15 mícrons abaixo da superfície de corte para evitar o registro de células potencialmente danificadas e adquirir as imagens.

Definir a frequência de amostragem para um a dois hertz para permitir a detecção inicial de oscilações individuais e registrar uma imagem de alta resolução. Se disponível, use um gráfico on-line para obter feedback instantâneo sobre a resposta de preparação, sobre iluminação, fotobleaching e deriva mecânica. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, salve os dados para análise posterior.

Aqui, um exemplo de uma fatia de tecido ideal pode ser observado no qual o corante indicador de cálcio permeável celular foi carregado com sucesso na fatia de tecido pancreático. Em contraste, essas fatias de tecido não são ideais para imagens devido a uma penetração de corante mal sucedida, falta de células de ilhotas ou uma abundância de tecido necrosado na superfície das amostras. Imagens de alta resolução de uma fatia de tecido pancreático podem ser usadas para delinear regiões distintas do tecido pancreático, como as ilhotas de Langerhans, tecido acinar ou o ducto pancreático.

Estímulos podem ser usados para discriminar funcionalmente entre diferentes células ilhotas ou entre células ilhotas e não-ilhotas. Por exemplo, as células beta normalmente respondem a uma estimulação de glicose de pulso quadrado, exibindo um aumento transitório no cálcio intracelular seguido por uma oscilação rápida de cálcio em um platô sustentado. Em contraste, as células não beta respondem com oscilações mais rápidas e irregulares.

Um atraso no aparecimento do aumento do cálcio intracelular após a estimulação, bem como a heterogeneidade e atrasos entre as células individuais também podem ser medidos. Os mesmos parâmetros podem ser usados para descrever a fase de desativação. Aqui pode ser observada uma apresentação esquemática da duração, frequência e percentual de oscilação intracelular de cálcio.

Quando a imagem em taxas de aquisição superiores a 10 hertz, ondas de cálcio que se espalham repetidamente pela ilhota podem ser claramente reconhecidas. Fixar o ducto biliar comum o mais próximo possível do duodeno para evitar que acidentalmente ocluam o ramo que está entrando no pâncreas. Além disso, não pare de deprimir o êmbolo durante a injeção porque a agarose vai imediatamente endurecer na agulha.

A técnica de fatia de tecido pancreático agudo do rato também pode ser usada com o método de fixação para estudar correntes de canais de íons e acessar citose, bem como estudos de imunohistoquímica e estudos de secretários.