Name: Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a gerar organoides retinianos a partir de células-tronco pluripotentes humanas com protocolo otimizado para precursores de fotorreceptores. Este método oferece plataforma confiável para modelagem de doenças retinianas e terapias celulares.

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Agradecemos aos membros do laboratório 502 por seus apoios técnicos e comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (Z200014) e pelo Programa Nacional de P&D da China (2017YFA0105300).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional do Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. As hESCs H9 foram obtidas do WiCell Research Institute e geneticamente modificadas para a linhagem celular marcada com tdTomato.
1. Geração de ROs humanas
<ol><li>Cultive os hESCs em condições livres de alimentadores.<ol><li>Revestir um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de 0,1 mg/mL de reagente A (Tabela de Materiais) a 37 °C por pelo menos meia hora seguindo as instruções do fabricante. Descongelar uma alíquota de 1x106 hESCs. NOTA: Preparar 3 mL de reagente B pré-aquecido (Tabela de Materiais) e transferir as células criopreservadas (1 mL) para 3 mL de meio fresco. Não pipete as hESCs para células únicas.</li>
		<li>Centrifugar a 200 x g durante 5 min e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Semeia as células na placa revestida com A do reagente com 2 mL de reagente B e troque 2 mL de reagente B diariamente. Células de passagem quando atingem aproximadamente 80% de confluência (geralmente em torno de 4 dias).</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 0<ol><li>Dissociar as hESCs de uma suspensão unicelular utilizando o meio I (Tabela 1). Preparar o meio I misturando o seguinte: 20% (v/v) de reposição sérica KnockOut (KSR), solução de aminoácidos não essenciais MEM a 0,1 mM (NEAA), piruvato de 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/mL de COCO, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina (PS), 0,1 mM β-mercaptoetanol e meio essencial mínimo de Glasgow Eagle (GMEM). NOTA: Antes do início da dissociação, preparar o meio I e transferir 12 mL do meio I com 20 μM Y-27632 para uma placa de Petri de 10 cm, 500 μL de reagente C (Tabela de Materiais) contendo 0,05 mg/mL de reagente D (Tabela de Materiais) e 20 μM Y-27632 em um tubo de 1,5 mL. Execute as etapas acima no escuro, pois o componente IWR1e no meio I é sensível à luz.</li>
		<li>Lave as hESCs com o tampão salino tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido 1x da Dulbecco.</li>
		<li>Adicionar o reagente preparado de 500 μL (no tubo de 1,5 ml) e incubar as hESCs durante 3,5 min a 37 °C e 5% de CO2.</li>
		<li>Retire as células agitando o lado e o fundo da placa por alguns segundos e adicione 500 μL de meio preparado I da placa de Petri na placa hESC. NOTA: Prepare um tubo de 1,5 mL com 900 μL de 1x DPBS e use um hemocitômetro para contagem celular.</li>
		<li>Colha as células em um novo tubo de 1,5 mL e pipete a suspensão celular para cima e para baixo e, em seguida, retire 100 μL do tubo e, em seguida, adicione ao tubo com 900 μL de DPBS para contagem de células.</li>
		<li>Dispersar a suspensão celular esquerda de 900 μL e, em seguida, diluir as células com o meio preparado I na placa de Petri para 9 x 104 células/mL. NOTA: O volume total do meio é de 12 mL; 1,08 x 106 células são necessárias no total.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços não aderente, com fundo em V (Tabela de Materiais). NOTA: Use uma pipeta multicanal para encurtar o tempo e garantir que cada poço contenha um número de célula equivalente. Agite a placa de Petri de cada vez antes de remover as porções de 100 μL. É importante que as células sejam uniformemente distribuídas.</li>
		<li>Gire levemente a placa de 96 poços em um agitador de baixa velocidade por 5 minutos e, em seguida, incube a 37 °C e 5% de CO2. NOTA: Mantenha a placa no escuro. Defina o dia como dia 0.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2<ol><li>Adicione 1% de reagente A (Tabela de Materiais). Preparar o reagente A (concentração proteica de 10 mg/mL) adicionando 133,4 μL de reagente A em 2 mL de meio I. NOTA: Manter o reagente A a 4 °C durante a noite antes da utilização para obter uma fusão completa e uniforme. Observe as informações do produto e pesquise o número de catálogo e o número de lote no site oficial da empresa para ter a concentração de proteína do reagente A, pois cada frasco de reagente A está em uma concentração de proteína diferente. Se a concentração de proteína for baixa, um aumento do volume de reagente A seria útil.</li>
		<li>Adicionar 20 μL de reagente A preparado a cada poço e pipetar duas vezes no centro para espalhar as células mortas. NOTA: Mantenha o reagente A e a placa de 96 poços em condições frias e complete todas as etapas no gelo. Coloque o prato no escuro.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2-12<ol><li>Limpar o fundo da placa de 96 poços e incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 6. No dia 6, mude metade do meio removendo 58 μL do meio de cada poço e adicionando 60 μL de meio I. NOTA: Use uma pipeta multicanal para concluir a meia mudança média. Conduza esta etapa com cuidado para garantir que nenhuma pelota de célula seja removida do poço. Aspirar o meio em uma placa de Petri limpa de 10 cm. Se houver pellets de células dentro, adicione-os de volta à placa de 96 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Dias 12-18<ol><li>Alterar o médio para o médio II (Tabela 1) no dia 12. Preparar o meio II utilizando o reagente A a 1% (v/v) misturando o seguinte: 10% de soro fetal bovino (FBS), NEAA de 0,1 mM, piruvato de 1 mM, penicilina de 100 U/mL, estreptomicina de 100 μg/mL, β-mercaptoetanol de 100 mM, dicloridrato SAG de 100 nM e GMEM. Armazene-o em condições frias e escuras.</li>
		<li>Colha os pellets de células em um tubo cônico de 15 mL da placa de 96 poços e deixe que os pellets se depositem naturalmente por 5 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Remova o meio e os pellets suavemente sob a superfície para evitar bolhas.</li>
		<li>Remova o sobrenadante enquanto cuida dos organoides. Transferir os agregados celulares para uma placa de suspensão de 10 cm contendo 18 mL de meio preparado II com o reagente A. NOTA: Não adicione o meio preparado II ao prato de 10 cm de antecedência, uma vez que o reagente A deve estar a 4 °C.</li>
		<li>Incubar a 37 °C e 5% de CO2 até ao dia 18.</li>
	</ol></li>
	<li>A partir do dia 18<ol><li>Alterar o médio para o médio III (Tabela 1). Preparar o meio III em condições escuras misturando o seguinte: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM de ácido retinóico (AR), 100 μM de taurina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 1:1 mistura de meio águia modificado (DMEM)/mistura de nutrientes F-12 da Dulbecco.</li>
		<li>No dia 18, quando uma vesícula óptica semitransparente é gerada, corte os organoides usando uma faca microcirúrgica. NOTA: Deixe o organoide, geralmente em quatro pedaços, em uma placa de Petri com meio II. Cada peça deve crescer em um copo óptico intacto nas semanas seguintes.</li>
		<li>Agregar todos os pellets ao centro do prato. Colha as células em um tubo de falcão cônico de 15 mL e permita a sedimentação natural. Em seguida, remova suavemente o sobrenadante. NOTA: Devido aos seus tamanhos, os organoides podem ser agregados no centro girando a placa de Petri em uma direção por 90° em um plano horizontal algumas vezes.</li>
		<li>Suspender e dispersar os pellets em duas placas de Petri de 10 cm, com 18 mL de meio III por prato, e transferir suavemente os pratos para a incubadora para evitar a agregação celular. Continuar a cultura em meio III a 37 °C e 5% de CO2 e mudar o meio semanalmente. A CRX expressa após o dia 45 e até o dia 120, foi possível detectar o segmento externo do fotorreceptor.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisando ROs humanas
<ol><li>Análise FACS<ol><li>Monte três organoides derivados de CRX-tdTomate e três H9 ES dos pratos usando as pontas cortadas de 1 mL. Lave os organoides com 1 mL de DPBS pré-aquecido (temperatura ambiente).</li>
		<li>Preparar o tampão de digestão misturando solução de tripsina-EDTA a 0,25% com 0,05 mg/ml de reagente D.</li>
		<li>Dissociar os organoides em células únicas utilizando o tampão de digestão preparado durante 8 minutos a 37 °C. Em seguida, adicione o mesmo volume de DPBS com FBS a 10% e 0,05 mg/mL de reagente D para inativar a reação.</li>
		<li>Suspenda e espalhe levemente as células e, em seguida, filtre usando um filtro celular de 100 μm e use um sistema de Classificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) na linha de laser de excitação de 561 nm e filtro 780/60 para analisar os sinais positivos CRX-tdTomato. NOTA: CRX expressa inicialmente no dia 45 e aumenta com a maturação dos organoides. Dez mil células são usadas para cada teste, para cada ponto de tempo, pelo menos três repetições são concluídas.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da intensidade de fluorescência das ROs<ol><li>Prepare os organoides viáveis aleatoriamente para imagens. NOTA: Defina os parâmetros e use os mesmos filtros e parâmetros para todos os monitores de intensidade de fluorescência.</li>
		<li>Capture imagens e analise a intensidade média de fluorescência usando um software adequado (por exemplo, ImageJ).</li>
		<li>Importe as imagens e, em seguida, converta para 8 bits usando a | de Imagem Digite.</li>
		<li>Ajuste o limite usando os parâmetros padrão por Image | Ajustar | Limiar.</li>
		<li>Determine a área medida e, em seguida, avalie o valor cinza usando Analisar | Medida. NOTA: Os valores médios no painel de resultados são a intensidade média de fluorescência da área medida.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

A diferenciação organoide retiniana é um método desejável para a geração de amplas células funcionais da retina. A RO é um composto de diferentes células da retina, como células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, geradas por células-tronco pluripotentes em direção à retina neural 4,5,8,9. Embora as ROs confluentes possam ser colhidas, é demorado, o que pode exigir longos período...

As células-tronco pluripotentes (PSCs) são caracterizadas por sua auto-renovação e capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas. Assim, os organoides derivados de PSCs tornaram-se um recurso importante na pesquisa em medicina regenerativa. A degeneração da retina é caracterizada pela perda de fotorreceptores (bastonetes e cones) e epitélio pigmentar da retina. A substituição das células da retina pode ser um tratamento encorajador para esta doença. No entanto, não é viável obter retinas humanas para pesquisa e terapia de doenças. Portanto, os organoides da retina (ROs) derivados de PSCs, que recapitulam de forma eficaz e bem-sucedida as células nativas da retina em várias camadas, são benéficos para a pesquisa básica e translacional 1,2,3. Nossa pesquisa se concentra na diferenciação de RO para fornecer células suficientes e de qualidade para estudar a degeneração da retina4.
Métodos para diferenciar ROs estão continuamente surgindo, com diferenciação de suspensão tridimensional (3D) pioneira pelo laboratório Sasai em 20125. Introduzimos a etiqueta CRX-tdTomato nas células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para rastrear especificamente as células precursoras dos fotorreceptores e modificamos o método com a adição de COCO, um antagonista multifuncional das vias Wnt, TGF-β e BMP6. Demonstrou-se que o COCO melhora eficientemente a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores 6,7.
Em conjunto, modificando o método clássico de diferenciação, desenvolvemos um protocolo acessível para colher abundantes precursores e cones de fotorreceptores de ROs humanas para análise da doença retiniana associada aos fotorreceptores através de investigações laboratoriais e para posterior aplicação/transplante clínico.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN Família de domínios de antagonistas BMP</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS), Qualificado para Células-Tronco Embrionárias Humanas</td><td>Indústria Biológica</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Substituição de Soro - Multi-Espécies</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td> <td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Caneta Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-plate</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>Agregação de células em 1.2.7</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Reagente A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel em 1.1.1</td></tr><tr><td>Reagente B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>mTeSR- E8, PSCs meio basal em 1.1.2</td></tr><tr><td>Reagente C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express em 1.2</td></tr><tr><td>Reagente D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I, em 1.2</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento 1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 Suplemento (100X), Líquido, flexível em medum III</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>dissociação de organoides em 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt Antagonista I, IWR-1-endo - Calbiochem</td><td>Sigma</td><td>681669</td><td>inibidor Wnt</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

indução dirigida de organoides da retina a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

O transplante de células da retina é uma abordagem terapêutica promissora, que poderia restaurar a arquitetura da retina e estabilizar ou mesmo melhorar as capacidades visuais da retina degenerada. No entanto, o progresso na terapia de reposição celular atualmente enfrenta os desafios de exigir uma fonte pronta para uso de retinas humanas padronizadas e de alta qualidade. Portanto, um protocolo fácil e estável é necessário para os experimentos. Aqui, desenvolvemos um protocolo otimizado, baseado em um método de auto-organização com o uso de moléculas exógenas e reagente A, bem como excisão manual para gerar os organoides tridimensionais da retina humana (RO). As RO derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (PSCs) expressam marcadores específicos para fotorreceptores. Com a adição de COCO, um antagonista multifuncional, a eficiência de diferenciação de precursores e cones fotorreceptores é significativamente aumentada. O uso eficiente deste sistema, que tem os benefícios de linhagens celulares e células primárias, e sem os problemas de fornecimento associados a este último, poderia produzir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Assim, a diferenciação de PSCs para RO fornece uma plataforma ótima e biorrelevante para modelagem de doenças, triagem de medicamentos e transplante de células.

A ilustração esquemática retrata o protocolo de diferenciação para melhorar as células precursoras com COCO (Figura 1). De PSC a ROs, inúmeros detalhes podem causar variações de resultados. Recomenda-se registrar cada etapa e até mesmo o número de catálogo e o número de lote de cada meio para acompanhar todo o procedimento.
Aqui, fornecemos imagens de campo brilhante para os dias 6, 12, 18 e 45 (Figura 2). No dia 6, os organoides gera...

Usando um método de auto-organização, desenvolvemos um protocolo com a adição de COCO que poderia aumentar significativamente a geração de fotorreceptores.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Este é um modelo para a doença da retina e emula a retina in vivo. Até certo ponto, poderia substituir os experimentos com animais. O protocolo é otimizado para a qualidade e quantidade dos precursores fotorreceptores nos organoides da retina, e o fotorreceptor é a chave para várias condições irreversíveis de cegueira.Comece por cultivar as células estaminais embrionárias humanas, ou hESCs, em condições livres de alimentadores. Para fazer isso, cubra um poço de uma placa de seis poços com um mililitro de 100 microgramas por mililitro de reagente A e incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos meia hora. Descongele uma alíquota de um milhão de hESCs e centrifuja-a a 200 xg por cinco minutos.Após a remoção do sobrenadante, semeie as células na placa previamente revestida, juntamente com dois mililitros de reagente B.Passe as células depois de atingir aproximadamente 80% de confluência em torno de quatro dias. Depois de atingir a confluência, lave as células com DPBS pré-aquecido e transfira-as para 500 microlitros de reagente recém-preparado. Em seguida, incube as células por 3,5 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Retire as células agitando o lado e o fundo da placa por alguns segundos e adicione 500 microlitros de um meio preparado. Colha as células separadas em um novo tubo de 1,5 mililitro e pipete a suspensão celular para cima e para baixo. Para contagem de células, adicione 100 microlitros de suspensão celular a 900 microlitros de DPBS.Diluir os 900 microlitros da suspensão celular restante com um meio na placa de Petri para atingir nove vezes 10 para a quarta célula de potência por mililitro. Adicione 100 microlitros de suspensão celular diluída a cada poço de uma placa de 96 poços não aderente, com fundo em V. Gire levemente a placa em um agitador de baixa velocidade por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o segundo dia.No segundo dia, adicione 20 microlitros de 1% de reagente A a cada poço da placa de 96 poços e pipete duas vezes no centro para espalhar as células mortas. Limpe o fundo da placa antes de incubá-la a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o sexto dia. No sexto dia, substitua 58 microlitros do meio por 60 microlitros de meio fresco e continue a incubação.No dia 12, colha os pellets de células da placa de 96 poços em um tubo cônico de 15 mililitros e permita que os pellets se depositem naturalmente por cinco minutos à temperatura ambiente. Quando os pellets se assentarem, retire o sobrenadante sem perturbar os organoides e transfira os agregados celulares para um prato de suspensão de 10 centímetros contendo 18 mililitros de meio dois com o reagente A.Incube o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o dia 18. No dia 18, confirme a geração de uma vesícula óptica semitransparente no prato e corte os organoides gerados usando uma faca microcirúrgica.Adicione todos os pellets cortados ao centro do prato. Em seguida, colha as células em um tubo de Falcão cônico de 15 mililitros. Quando as células se assentarem, remova suavemente o sobrenadante e ressuspenda os pellets em duas placas de Petri de 10 centímetros com 18 mililitros de meio, três por prato.Transfira suavemente os pratos para a incubadora para evitar a agregação celular. Continue cultivando as células, mudando o meio semanalmente. Analise a expressão de CRX após o dia 45 até o dia 120.Nesta análise representativa, vários estágios da geração da retina humana são exibidos. No sexto dia, os organoides apareceram como um agregado de conexões densas dentro de uma borda brilhante com um diâmetro de cerca de 600 micrômetros. No dia 12, ocorreu a geração inicial das estruturas ópticas semelhantes a vesículas.Os organoides sem arquitetura adequada semelhante a uma vesícula foram descartados antes da cultura em uma placa de Petri no dia 18. No dia 30 da cultura, a arquitetura semelhante a uma vesícula era mais óbvia, e as ROs inferiores podiam ser facilmente distinguidas e removidas. A partir do dia 45, os organoides expressaram vários marcadores de precursores fotorreceptores, como CRX, RCVRN e OTX2.Ao clivar os organoides superiores da retina, a eficiência de diferenciação é significativamente melhorada e mais de 100 organoides superiores de 96 placas podem ser colhidos.

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Medicina

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

O presente protocolo descreve um sistema otimizado de indução de retina neural 3D que reduz a adesão e fusão de organoides da retina com alta repetibilidade e eficiência.

Gerando Retina Neural a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo apresenta um método para geração de organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes humanas.

Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este protocolo combina limpeza óptica e imunomarcação para imagens confocais de volume total de organoides retinianos de montagem total. Ele preserva a estrutura 3D, permitindo a visualização detalhada das principais vias neuronais, melhorando o estudo da maturação da retina, organização espacial e suas potenciais aplicações na modelagem de doenças e medicina personalizada.

Visualização de organoides retinianos de montagem completa com resolução celular

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

O isolamento de células-tronco cancerosas (CSCs) diretamente a partir de tecidos humanos é requisito para a sua caracterização biológica. Este manuscrito descreve uma metodologia para o isolamento de CSCs próstata de tecidos humanos, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

Aprenda a gerar organoides retinianos a partir de células-tronco pluripotentes humanas com protocolo otimizado para precursores de fotorreceptores. Este método oferece plataforma confiável para modelagem de doenças retinianas e terapias celulares.

Indução Dirigida de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

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