Name: Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprenda a fabricar e analisar microtecidos musculares esqueléticos humanos 3D usando a plataforma MyoTACTIC. Este método permite avaliação repetida da força contrátil e transientes de cálcio para estudos de biologia muscular e modelagem de doenças.

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Gostaríamos de agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli e Sadegh Davoudi por contribuir para a invenção da plataforma de cultura MioTACTIC e estabelecer os métodos de fabricação e análise aqui descritos. A HL recebeu financiamento de um Programa de Treinamento do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) em Bolsa de Engenharia e Empreendedorismo de Órgãos e Empreendedorismo e de bolsas de pós-graduação da Universidade de Toronto Wildcat. PmG é a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Reparação Endógena e recebeu apoio para este estudo do Instituto de Medicina Regenerativa de Ontário, da Rede de Células-Tronco e da Medicina por Design, um Programa de Excelência em Primeira Pesquisa do Canadá. Diagramas esquemáticos foram criados com BioRender.com.

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<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
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<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
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<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
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<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
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<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Este manuscrito descreve métodos para fabricar e analisar um modelo de cultura 3D hMMT que pode ser aplicado a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A plataforma MyoTACTIC é amigável ao custo, fácil de fabricar, e requer um número relativamente pequeno de células para produzir microtissues musculares esqueléticas. os hMMTs formados dentro da plataforma de cultura MioTACTIC são compostos por miótubos alinhados, multinucleados e estriados, e respondem a estímul...

O músculo esquelético é um dos tecidos mais abundantes no corpo humano e suporta funções fundamentais do corpo, como locomoção, homeostase de calor e metabolismo1. Historicamente, modelos animais e sistemas bidimensionais (2D) de cultura celular têm sido utilizados para estudar processos biológicos e patogênese de doenças, bem como para testar compostos farmacológicos no tratamento de doenças musculares esqueléticas2,3. Embora os modelos animais tenham melhorado muito nosso conhecimento sobre músculo esquelético em saúde e em doenças, seu impacto translacional tem sido dificultado por altos custos, considerações éticas e diferenças entre espécies2,4. Ao recorrer a sistemas baseados em células humanas para estudar músculo esquelético, os sistemas de cultura celular 2D são favoráveis devido à sua simplicidade. No entanto, há uma limitação. Esse formato muitas vezes não consegue recapitular as interações de células células e células-matriz extracelulares que ocorrem naturalmente dentro do corpo5,6. Ao longo dos últimos anos, modelos de músculos esqueléticos tridimensionais (3D) surgiram como uma alternativa poderosa aos modelos animais inteiros e sistemas convencionais de cultura 2D, permitindo a modelagem de processos fisiologicamente e patologicamente relevantes ex vivo7,8. De fato, uma infinidade de estudos têm relatado estratégias para modelar o músculo esquelético humano em um formato de cultura 3D bioartificial1. Uma limitação para muitos desses estudos é que a força ativa é quantificada após a remoção dos tecidos musculares das plataformas culturais e o apego a um transdutor de força, que é destrutivo e, portanto, limitado a servir como um ensaio de ponto final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Outros projetaram sistemas culturais que permitem métodos não invasivos de medição da força ativa, mas nem todos são favoráveis a aplicações de teste de moléculas de alto conteúdo7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Este protocolo descreve um método detalhado para fabricar microtissues musculares humanas (hMMTs) na plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) do músculo esquelético (MyoTACTIC); um dispositivo de placa de 96 poços que suporta a produção em massa de microtissues musculares esqueléticas3D 30. O método de fabricação de placas mioTACTIC permite a geração de uma placa de cultura de polidimimetilaxitano (PDMS) de 96 poços e todas as características do poço correspondentes em uma única etapa de fundição, em que cada poço requer um número relativamente pequeno de células para formação de microtissue. Microtissues formados dentro do MioTACTIC contêm miótubos alinhados, estriados e multinucleados que são reprodutíveis do bem ao bem do dispositivo, e após a maturação, podem responder a estímulos químicos e elétricos no situ30. Aqui, a técnica de fabricação de um dispositivo de placa de cultura MyoTACTIC PDMS a partir de uma réplica de poliuretano (PU), um método otimizado para implementar células progenitoras miogênicas imortais para fabricar hMMTs, e a avaliação funcional das propriedades de geração de força hMMT e manuseio de cálcio são delineadas e discutidas.

<table><tbody><tr><td>Solução salina a 0,9%, Sterile</td><td>House Brand</td><td>1010</td><td>Alíquotas de 10 mL da solução são feitas e armazenadas a 4&deg; C</td></tr><tr><td>25G Agulha</td><td>BD, Medstore, Universidade de Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-Aminocapróico, &ge; 99% (titulação), Pó</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Uma solução estoque de 50 mg / mL é gerada pela dissolução de 5 mg de pó de ácido 6-aminocapróico em 100 mL de água destilada autoclavada. A solução é filtrada a vácuo e alíquotas de 10 mL são armazenadas a 4&deg; C</td></tr><tr><td>6.35 mm ID Tubing</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Myoblast Cell Line</td><td>Institut de Myologie (Paris, França)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerador de Forma de Onda Arbitrária</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Membrana de Basement (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Armazenado como alíquotas de 50 &micro; L ou 100 &micro; L a -80&deg; C</td></tr><tr><td>Câmara de Vácuo de Bancada</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>Cabo BNC para Clipe</td><td></td><td></td> de Jacaré <td>Encomendado da Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Inclui placas de cultura, pipetas sorológicas, etc</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido Sigma</td><td>- Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Pó, Sem Cálcio, Sem Magnésio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Este é um DMEM de alta glicose com L-glutamina e piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen de Plasma Bovino</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Alíquotas variando de 7 - 10 mg de pó de fibrinogênio são feitas e armazenadas a -20&deg; </td></tr><tr><td>Filtro de Seringa C Filtropur, Tamanho do Poro 0.22um</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cavalo</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Recombinante Humana</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>A solução estoque é 100X e feita dissolvendo 1 mg de insulina recombinante humana em 1 mL de DMEM e 1 &micro; L de NaOH 10N. A solução é filtrada e armazenada como alíquotas de 1 mL a 4&graus; Software</td></tr> de <tr><td>aquisição de imagem</td> C <td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio - Montagem em câmera</td><td>Labcam Labcam</td><td>para iPhone</td><td>Encomendado da Amazon</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Descartáveis de Plástico, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Descartáveis de Plástico, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Plurônico F-127, Pó, BioReagente</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>Uma solução estoque de ácido plurônico a 5% é feita dissolvendo 5 g de pó de ácido plurônico em 100 mL de água destilada gelada, autoclavada. A solução é filtrada a vácuo e alíquotas de 10 mL são armazenadas a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184)</td><td>Os</td> kits <td>Dow 4019862</td><td>também estão disponíveis na Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td></tr><tr><td>Molde Negativo de Poliuretano</td><td>em Agente</td> de Liberação Interna <td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Vácuo de Palhetas Rotativas</td><td></td> Mann Release Technologies 200 <td></td> Bisturi A65401906 <td></td>Edwards</tr><tr><td></td><td>Almedic, Medstore, Universidade de Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Barbear de Borda Única</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Célula Muscular Esquelética Basal <td></td></tr><tr><td> Medium</td><td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>30 mL aliquotes são gerados e armazenados a 4&deg;C.</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células musculares esqueléticas (pronto para uso)</td> <td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>Alíquotas de 42 mL são geradas e armazenadas a 4 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td> <td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Vácuo Seca de Serviço Padrão</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Saco de Esterilização</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Thimble</td><td>Igege</td><td></td><td>Encomendado da Amazon</td></tr><tr><td>Trombina de plasma humano</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>100 unidades de trombina são dissolvidas em 1 mL de uma solução de BSA a 0,1%. 10 &micro; As alíquotas L são preparadas e armazenadas a - 20 graus C.</td></tr><tr><td>Fio de cobre revestido de estanho</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>Encomendado da Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td> <td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Vácuo 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Modelos tridimensionais (3D) in vitro de músculo esquelético são um avanço valioso na pesquisa biomédica, pois oferecem a oportunidade de estudar a reforma muscular esquelética e funcionar em um formato escalável que é favorável a manipulações experimentais. Os sistemas de cultura muscular 3D são desejáveis, pois permitem que os cientistas estudem ex vivo muscular esquelético no contexto das células humanas. Modelos in vitro 3D imitam de perto aspectos da estrutura tecidual nativa do músculo esquelético adulto. No entanto, sua aplicação universal é limitada pela disponibilidade de plataformas simples de fabricar, custos e fáceis de usar, e produzem quantidades relativamente altas de tecidos musculares esqueléticos humanos. Além disso, uma vez que o músculo esquelético desempenha um importante papel funcional que é prejudicado ao longo do tempo em muitos estados da doença, uma plataforma experimental para estudos de microtissue é mais prática quando medidas minimamente invasivas de cálcio transitório e força contratil podem ser conduzidas diretamente dentro da própria plataforma. Neste protocolo, descreve-se a fabricação de uma plataforma de 96 poços conhecida como "MioTACTIC", e a produção em massa de microtissues musculares esqueléticos 3D (hMMTs). Além disso, são relatados os métodos para uma aplicação minimamente invasiva de estimulação elétrica que permite medições repetidas da força muscular esquelética e do manuseio de cálcio de cada microtissue ao longo do tempo.

Descritos aqui são métodos para lançar uma plataforma de cultura mioTACTIC baseada em PDMS de 96 poços a partir de um molde pu, para fabricar matrizes de tecidos de réplica hMMT, e para analisar dois aspectos da função hMMT dentro da geração de força de dispositivo de cultura e manuseio de cálcio. A Figura 1 oferece uma visão geral esquemática da preparação dos poços de cultura MioTACTIC antes da semeadura do HMMT. PDMS é um polímero à base de silicone amplamente utilizado, que pode ser faci...

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para produzir matrizes de microtissues musculares esqueléticos humanos 3D e minimamente invasivos a jusante em ensaios de função situ, incluindo força contraítil e análises de manuseio de cálcio.

Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Nosso protocolo descreve métodos detalhados para fabricar e analisar uma cultura microtissue muscular esquelética humana 3D. Microtissues musculares podem ser aplicados a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A principal vantagem dessa técnica é que permite a avaliação in situ da força contratil e dos transitórios de cálcio.Por causa disso, você pode realizar estudos longitudinais da função do tecido muscular. Demonstrando o procedimento estarão Brennen Musgrave e Heta Lad, estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Duas a três horas antes da semeadura celular, coloque uma porção de placa tática de seis bem suave em um prato de cultura celular de 10 centímetros.Prepare bem cada cultura miotactica individual adicionando 100 microliters de uma solução F-127 plurônica de 5%. Use a tampa para cobrir os poços, e aplique um filme de parafina para selar o prato. Centrifugar o prato a 1.550 vezes G por um minuto em uma centrífuga equipada com um adaptador spinner de placa.Armazene o prato de cultura a quatro graus Celsius até que as células estejam prontas para semeadura. Em seguida, descongele lentamente 150 alíquotas de microliter de extrato de membrana do porão, e 110 alíquotas de microliter de trombina no gelo na capa da cultura. Trabalhando na capa de cultura celular, adicione 700 microliters de solução salina de 0,9% a um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo sete miligramas de fibrinogênio em pó.Coloque o tubo em uma incubadora de cultura celular Celsius de 37 graus por três a cinco minutos sem vórtice. Remova e gire o tubo suavemente, em seguida, gire a solução dissolvida em uma micro centrífuga antes de devolvê-lo ao capô da cultura. Filtre a solução de fibrinogênio usando uma seringa de um mililitro equipada com um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.Em seguida, transfira a solução de fibrinogênio dissolvida para gelo ao lado do extrato de membrana do porão e alíquotas de trombina. Prepare e pré-aqueça a mídia de crescimento tecidual a 37 graus Celsius, que será introduzida nos poços de cultura após a semeadura dos tecidos. Remova as placas de cultura celular da incubadora e aspire os meios de cultura.Em seguida, lave as células uma vez adicionando cinco mililitros de DPBS em cada placa de cultura. Aspire o DPBS e desprende as células adicionando um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA em cada prato de cultura. Coloque a placa na incubadora de cultura celular por três minutos, segure a trippsina adicionando três mililitros de meio de lavagem ao prato de cultura, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de tamanho apropriado.Pelota as células por centrifugação a 400 vezes G por 10 minutos. Aspire a mídia cuidadosamente sem danificar a pelota celular, em seguida, suspenda novamente as células em um mililitro do meio de lavagem. Conte as células usando um hemótmetro e um corante azul trypan sob microscopia de campo brilhante.Para semear seis tecidos, prepare células suficientes e matriz extracelular para oito tecidos, contabilizando assim perdas e formação de bolhas. Transfira 1,2 milhão de células para um novo tubo cônico e, em seguida, aumente o volume para 10 milímetros com meio de lavagem. Pelota as células por centrifugação a 400 vezes G por 10 minutos.Prepare 150 microliters de mistura ECM em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e armazene a mistura no gelo até o uso. Aspire a mídia do tubo cônico contendo as células, tomando cuidado para evitar a pelota celular. Filme vigorosamente a extremidade do tubo com um dedo enluvado até que a pelota apareça como um chorume celular.Transfira 120 microliters da solução ECM para o tubo contendo o chorume celular, e cuidadosamente pipeta para cima e para baixo para suspender completamente as células dentro do ECM para gerar uma única suspensão celular. Evite criar bolhas e coloque a suspensão ECM da célula no gelo até usar. Coloque o prato refrigerado de 10 centímetros contendo os poços miotáticos em cima de uma bolsa de gelo dentro do capô de cultura celular, e aspire a solução plurônica F-127 de cada poço.Permita que a solução plurônica residual F-127 seja liberada do PDMS poroso, e acomode-se no fundo do poço, deixando os poços sentarem por cinco minutos no gelo, depois aspirar novamente. Pipete a célula suspensão ECM cuidadosamente para re-suspender as células, em seguida, transferir 105 microliters da suspensão para um tubo fresco, pré-refrigerado 1.5 mililitro, agarrando-o perto do topo. Adicione 0,84 microliters de 100 unidades por solução de estoque de trombina mililitro aos 105 microliters da suspensão ECM celular.Pipeta rapidamente e completamente para misturar, evitando a introdução de bolhas. Adicione 15 microliters da mistura ECM da célula a cada poço sem pressionar a pipeta na parte inferior do poço. Com dois movimentos leves, espalhe a suspensão da célula atrás de cada poste no poço.Coloque a tampa na placa de cultura de 10 centímetros e transfira-a para uma incubadora de cultura de tecido de 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos. Adicione 200 microliters de mídia de crescimento de tecido pré-aquecido a cada poço miotactico depois que a mistura de ECM celular tiver polimerizado. Substitua a tampa do prato de 10 centímetros e mantenha-a na incubadora até a diferenciação.Durante um período de cultura de 14 dias, os myoblasts mostraram os aspectos do tecido nativo auto-organizando-se na tática suave bem para formar um microtissue 3D com miótubos estriados multinucleados. Myotubes têm estrias de sarcomere, que foram visualizadas por imunostendante para actinina alfa sarcomeric. Para alcançar miotubes bem alinhados, erros técnicos como a formação de bolhas durante a pipetação ou o revestimento plurônico prejudicial durante a aspiração devem ser evitados.Um deslocamento representativo do poste de placa de poço miotático em resposta à estimulação elétrica de baixa e alta frequência, é mostrado aqui, indicando que os mofátuos respondem a diferentes estímulos elétricos e contraem em conformidade. A quantificação do deslocamento pós-deslocamento permite a conversão à força contratil absoluta dos HMMTs. Transitoriedade de cálcio em HMMTs feitas a partir de míbios transduzidos por GCaMP6 também foram analisados em resposta à estimulação de baixa e alta frequência.A quantificação da intensidade fluorescente pode ser usada como medida para as propriedades de manuseio de cálcio dos HMMTs. A maioria das pessoas que realizam essa semeadura tecidual pela primeira vez, lutam para adicionar a matriz extracelular celular aos poços, e com a formação de bolhas. Recomendamos praticar a técnica em alguns poços de cultura microtissue sobressalentes com uma solução viscosa muito simples antes da primeira tentativa com células.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Myo-mecânico Análise do músculo esquelético isolado

Este protocolo descreve o uso de braços de suporte de silicone em micro-como as superfícies de cultura maleáveis ​​para a medição da contractilidade de células do músculo in vitro. Contração celular provoca flexão cantilever, que pode ser medido, registrado, e convertido em leituras de força, proporcionando um sistema não invasivo e escalável para medir a função contrátil in vitro.

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil In Vitro

Este protocolo descreve um método robusto, simples e reprodutível de isolamento e cultivo de células progenitoras a partir de mioblastos de músculo esquelético de adultos e idosos. Os músculos usados ​​aqui incluem músculos do pé e da perna. Esta abordagem permite o isolamento de uma população enriquecida de mioblastos primários para estudos funcionais.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Medição da função contrátil de músculo esquelético de roedores é uma ferramenta útil que pode ser usada para controlar a progressão da doença, bem como a eficácia da intervenção terapêutica. Descrevemos aqui a avaliação não-invasiva, na vivo dos músculos levantadores que podem ser repetidos ao longo do tempo no mouse mesmo.

Avaliação não-invasiva da função de músculos levantadores em ratos

Este relatório técnico descreve uma variação da técnica modificada de Bergström para a biópsia do musculus tibialis anterior que limita o dano da fibra.

Coleta de Biópsias Musculares Esqueléticas do Compartimento Superior do Musculus Tibialis Anterior para Avaliação Mecânica

A quantificação da força máxima do extensor do joelho é imprescindível para entender adaptações funcionais ao envelhecimento, doença, lesão e reabilitação. Apresentamos um novo método para medir repetidamente o torque isométrico de extensão do joelho in vivo.

Medição in vivo da função muscular extensor do joelho em camundongos

Neste protocolo é descrito um método de cultivo in vitro e análise funcional para células-tronco musculares, que preserva a maioria de suas interações com seu nicho endógeno.

Ensaio de cultura de myofibra única para a avaliação da funcionalidade de células-tronco musculares adultas Ex Vivo

Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.

Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D

Descrevemos um protocolo para obtenção de fibras enzimaticamente dissociadas de diferentes comprimentos e tipos de seis músculos de camundongos adultos: três deles já descritos (flexor curto dos dedos, extensor longo dos dedos, sóleo) e três deles dissociados com sucesso pela primeira vez (extensor longo do hálux, fibular longo, fibular dos dígitos).

Fibras musculares esqueléticas curtas, intermediárias e longas intactas obtidas por dissociação enzimática de seis músculos dos membros posteriores de camundongos: além do flexor curto dos dedos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Este protocolo usa microtomografia computadorizada para permitir a quantificação econômica da massa magra, incluindo músculo esquelético e tecido visceral, tecido adiposo e tecido esquelético em pequenos animais. Ele distingue entre tecido magro e adiposo, o que oferece vantagens significativas para a pesquisa biomédica, particularmente na pesquisa translacional em pequenos animais.

Quantificação não invasiva do músculo esquelético em pequenos animais por meio de microtomografia computadorizada

Aprenda a fabricar e analisar microtecidos musculares esqueléticos humanos 3D usando a plataforma MyoTACTIC. Este método permite avaliação repetida da força contrátil e transientes de cálcio para estudos de biologia muscular e modelagem de doenças.

Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas

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