Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

Neste procedimento, mostramos como proceder de uma pequena molécula em pó para uma estrutura tridimensional em minutos. Esta é uma técnica transformadora para a comunidade química. Muitos compostos não crescem facilmente em grandes cristais.

Com o MicroED, podemos determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho nanométrico. Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Mike Martynowycz, que é professor da UCLA. Para começar, transfira uma pequena quantidade de pó, líquido ou sólidos para um pequeno frasco ou tubo.

Para amostras já em pó, sele o tubo usando a tampa até que a amostra seja necessária. Da mesma forma, seque as amostras líquidas em pós. Embrulhe filme plástico em torno de uma extremidade de uma lâmina de tampa de vidro.

Coloque as grades de MET sobre o filme na parte superior da lâmina da tampa com o lado de carbono de cor marrom voltado para cima. Em seguida, coloque a lâmina com grades na câmara de descarga de brilho e descarregue a lâmina de cobertura por aproximadamente 30 segundos usando a configuração negativa em 15 picoamperes. Guarde as grades na tampa dentro de uma placa de Petri de vidro forrada com papel filtro antes de adicionar a amostra às grades.

Retire a grade de TEM de descarga de brilho da placa de Petri coberta usando uma pinça e coloque-a em um papel de filtro circular com o lado de carbono voltado para cima. Usando uma pequena espátula, retire uma colher muito pequena de pó e coloque-a em uma pequena tampa de vidro quadrada ao lado da grade de TEM no papel de filtro. Coloque outra pequena lâmina de vidro quadrada ou tampa deslizante em cima do pó.

Com os dedos, esfregue suavemente as duas lâminas de vidro juntas para fazer um pó fino. Incline as lâminas da tampa e posicione-as logo acima da grade do MET no papel de filtro e continue a esfregar as lâminas da tampa juntas apenas alguns centímetros acima da grade do MET descarregada com brilho. Observe se o pó está caindo em direção à grade.

Descubra o pó finamente moído removendo uma das duas lamínulas da tampa de vidro. Em seguida, escove suavemente o pó fino da tampa, deslize para a grade do TEM usando um pedaço de papel de filtro. Pegue a borda da grade de ETM usando um conjunto de pinças, garantindo que as pontas não furem nenhum dos quadrados da grade.

Levante a grade de um a dois centímetros acima do papel de filtro e incline a grade a 90 graus em relação ao papel abaixo. Bata suavemente na pinça enquanto mantém a grade firmemente pinçada para remover qualquer pó solto. Congele a grade movendo a ponta da pinça com a grade diretamente em um recipiente de nitrogênio líquido à mão e espere até que a grade e a pinça parem de ferver.

Sob nitrogênio líquido, coloque a grade no porta-amostras com o lado carbono orientado de tal forma que a amostra seja atingida pelo feixe antes do filme de suporte de carbono. Coloque o porta-amostras no MET garantindo que a grade seja sempre mantida em temperaturas de nitrogênio líquido. Para sistemas de carregadores automáticos, coloque as grades cortadas em um em um recipiente refrigerado por nitrogênio líquido, o que permite que a robótica do carregador automático aceite o, mantendo as amostras seguras para o transporte entre o carregador automático e a coluna.

Abra as válvulas da coluna TEM e ajuste a ampliação usando os painéis manuais para a menor ampliação possível. Encontre o feixe ajustando o botão de intensidade nos painéis de mão de modo que uma área brilhante redonda seja visível na tela fluorescente. Faça um atlas de toda a grade em baixa ampliação usando o software apropriado, garantindo que o microscópio esteja bem alinhado para imagens de baixa e alta ampliação antes de coletar dados MicroED de alta resolução.

Identifique quadrados de grade sem carbono quebrado e grãos pretos ou escuros visíveis no filme. Navegue pela grade fisicamente usando o joystick nos painéis de mão ou virtualmente no atlas coletado para procurar quadrados de grade que não estejam quebrados e contenham microcristais. Adicione o centro de cada um desses quadrados a uma lista de locais de grade para investigação, que pode ser adicionada a um notebook na interface do usuário do microscópio ou no software de automação do microscópio.

Defina a ampliação entre 500 a 1300x. Ajuste a altura central em cada local de grade armazenado e atualize o valor z salvo para as posições anotadas. Pesquise na tela fluorescente ou em uma câmera plana por pequenos pontos pretos ou grãos na grade.

Uma boa amostra geralmente terá bordas afiadas em alta ampliação, sugerindo cristal em ordem. Mova um cristal potencial localizado para o centro da tela e aumente a ampliação de tal forma que o MET entre no modo de alta ampliação. Insira uma abertura de área selecionada e altere a abertura para um tamanho maior ou menor para garantir que a área selecionada seja maior que o cristal.

Mude para o modo de defração pressionando o botão de defração nos painéis manuais TEM, garantindo que a tela fluorescente seja inserida. Ajuste o comprimento da câmera usando o botão de ampliação de modo que a borda tenha pelo menos uma resolução angstrom. Ajuste o foco de difração de forma que o ponto central seja o mais nítido e pequeno possível.

Usando os botões de deslocamento de difração, mova o feixe central para o centro da tela fluorescente. Insira a parada do feixe certificando-se de que o feixe está atrás dele. Levante a tela fluorescente e faça uma breve exposição na câmera.

Inspecione o padrão de defração correspondente, certificando-se de que o padrão terá pontos pontiagudos que são regularmente dispostos em colunas e linhas. Salve as coordenadas de cristal na interface do usuário do MET ou anote-as e, em seguida, repita a triagem de difração para todos os cristais potenciais de interesse no quadrado da grade atual. Centralize o cristal peneirado em uma ampliação maior que 1000x e ajuste a altura cêntrica do cristal usando uma rotina automática ou manualmente.

Insira a abertura de área selecionada que melhor se adapta ao tamanho e à forma do cristal. Incline o palco nas direções negativa e positiva até que a imagem seja ocluída pelas barras de grade. E observe esses ângulos para fins de coleta de dados, lendo os dados a cada um segundo em uma câmera moderna com um modo de leitura do obturador rolante.

Defina a taxa de rotação especificando a porcentagem da velocidade máxima de inclinação e quando parar na interface do usuário do microscópio ou no software dedicado. Salve os dados em uma variedade de formatos, diz quadros individuais ou como uma pilha de imagens. Um filme de defração em formato cristalográfico coletado de microcristais mostra um conjunto de dados MicroED de rotação contínua a partir de um microcristal de carbamazepina identificado em uma grade de MET.

Após a coleta, integração e solução da estrutura dos dados, uma estrutura de alta resolução é determinada e sua clareza depende da qualidade e completude dos dados. A aplicação da amostra à grade é fundamental para a aquisição de bons dados. Seguindo este método, os dados podem ser processados usando software cristalográfico padrão.

Demonstrar que o MicroED é um método poderoso para pequenas moléculas abriu seu uso em todo o mundo para resolver novas estruturas de moléculas criticamente importantes.