Name: Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a preparar amostras de pequenas moléculas para difração de elétrons microcristal (MicroED) usando carbamazepina como modelo. Este protocolo permite determinar estruturas atômicas a partir de nanocristais em menos de 30 minutos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O laboratório Gonen é apoiado por fundos do Howard Hughes Medical Institute. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health P41GM136508.

1. Preparação de amostras de pequenas moléculas
<ol><li>Transfira uma pequena quantidade (0,01 - 1 mg) de pó, líquido ou sólidos para um pequeno frasco ou tubo.</li>
	<li>Para amostras já em pó, sele o tubo usando a tampa até que a amostra seja necessária. Secar as amostras líquidas em pós antes das tentativas do método 1 (passo 3) ou 2 (passo 4). NOTA: As amostras dissolvidas em líquido podem utilizar o método 3 (5.X) abaixo</li>
</ol>2. Preparação de grades de ETM
NOTA: Alguns TEMs com sistemas de carregador automático exigem que as grades sejam cortadas e colocadas em um antes de carregar na coluna TEM. O clipping envolve a fixação física da grade de TEM de 3 mm em um anel de metal que o carregador automático pode manipular. Esta etapa e as etapas subsequentes podem ser executadas usando grades TEM normais ou grades TEM que foram cortadas. Para esses experimentos, muitas vezes é mais fácil manipular as grades se elas tiverem sido cortadas antes do tempo.
<ol><li>Embrulhe filme plástico em torno de uma extremidade de uma lâmina de tampa de vidro.</li>
	<li>Coloque as grades de TEM sobre o filme na parte superior da tampa com o lado de carbono voltado para cima. Identifique os dois lados da grade sob uma luz. O lado de cobre brilha e parece metálico, enquanto o lado de carbono aparece de cor marrom (Figura 1C,D). Para grades cortadas, o lado de carbono deve estar voltado para a face plana do anel de clipe.</li>
	<li>Coloque a lâmina com grades na câmara de descarga de brilho. Descarga de brilho da tampa por aproximadamente 30 s usando a configuração negativa em 15 pA. Guarde as grades na tampa dentro de uma placa de Petri de vidro forrada com papel filtro antes de adicionar amostra às grades.</li>
</ol>3. Aplicação de amostra em grades criando um pó fino homogêneo (Método 1)
<ol><li>Remova uma grade de MET descarregada com brilho da placa de Petri coberta usando uma pinça. Coloque a grade em um papel de filtro circular com o lado de carbono voltado para cima.</li>
	<li>Usando uma espátula pequena, remova uma colher muito pequena de pó (aproximadamente 0,1 mg) e coloque-a em uma pequena tampa de vidro quadrada ao lado da grade de MET no papel de filtro. Coloque outra pequena lâmina de vidro quadrada ou tampa em cima do pó.</li>
	<li>Com os dedos, esfregue suavemente as duas lâminas de vidro juntas para fazer um pó fino.</li>
	<li>Incline as lamínulas e posicione-as logo acima da grade do ETM no papel filtro e continue a esfregar as lamínulas juntas, apenas alguns centímetros acima da grade do ETM descarregado com brilho (Figura 1).</li>
	<li>Observe para ver se o pó está caindo em direção à grade. Descubra o pó finamente moído removendo uma das duas lamínulas de vidro. Escove suavemente o pó fino da lamínula usando um pedaço de papel de filtro na grade de ETM (Figura 1).</li>
</ol>4. Aplicação da amostra às grelhas através da aplicação do método de "agitação" (método 2)
<ol><li>Pegue uma grade usando uma pinça e solte-a no frasco ou tubo de amostra de pó. Feche o frasco para injetáveis utilizando a tampa de plástico para garantir que nenhum material escapará quando agitado.</li>
	<li>Agarrando o frasco na mão, agite o frasco para injetáveis de tal forma que o pó e a grelha se movam durante aproximadamente 10 a 30 s.</li>
	<li>Esvazie o conteúdo do frasco para injetáveis num papel de filtro circular. Agarrando a grade em uma borda, toque suavemente na borda da grade no papel de filtro para remover qualquer excesso de material da grade. NOTA: Dependendo do tipo de frasco e tamanho, pode-se também usar pinças para remover a grade de ETM sem esvaziar o conteúdo.</li>
</ol>5. Aplicação de amostra a grelhas utilizando o método de evaporação (método 3)
<ol><li>Coloque uma grade (cortada ou não) no centro de um pedaço circular de papel filtro com o lado de carbono voltado para cima e o lado de cobre voltado para baixo.</li>
	<li>Usando uma seringa estanque ao gás de 10 μL, aplique uma pequena gota (aproximadamente 1 - 3 μL) de composto dissolvido no lado de carbono da grade.</li>
	<li>Mova suavemente o papel de filtro com grades para uma câmara de dessecação a vácuo. Tampe a câmara e ligue o vácuo. Deixe as grades sob vácuo para secar por até um dia.</li>
	<li>Desligue o vácuo e deixe a câmara ventilar por 5 min. A ventilação da câmara evita que as grades se movam ou voem para longe quando ela é descoberta.</li>
</ol>6. Congelamento e carregamento de grades no ETM
<ol><li>Pegue a borda da grade de ETM usando um conjunto de pinças, garantindo que as pontas não furem nenhum dos quadrados da grade. Levante a grade de 1 a 2 cm acima do papel filtro e incline a grade a 90° em relação ao papel abaixo. Bata suavemente na pinça enquanto mantém a grade firmemente pinçada para remover qualquer pó solto.</li>
	<li>Congele a grade movendo a ponta da pinça com a grade diretamente em um recipiente de nitrogênio líquido manualmente. Este recipiente é tipicamente a estação de carregamento de rede para o TEM, mas pode ser qualquer recipiente seguro, como uma garrafa térmica segura de nitrogênio líquido, é aceitável para transferência ou armazenamento. O nitrogênio líquido é de -196 °C.</li>
	<li>Espere até que a grade e a pinça parem de ferver antes de novas manipulações.</li>
	<li>Sob nitrogênio líquido ou em vapores de nitrogênio, coloque a grade no porta-amostras com o lado do carbono orientado de tal forma que a amostra será atingida pelo feixe antes do filme de suporte de carbono.</li>
	<li>Coloque o porta-amostras no MET garantindo que a grade seja mantida sempre a temperaturas de nitrogênio líquido.<ol><li>Para sistemas de carregador automático, coloque as grades cortadas em um em um recipiente refrigerado por nitrogênio líquido. Este é transferido para um contêiner de transporte que permite que a robótica do carregador automático aceite o, mantendo as amostras seguras para o transporte entre o carregador automático e a coluna.</li>
		<li>Para configurações de TEM de entrada lateral, fixe a grade a um suporte de TEM de entrada lateral comercial. Estes suportes têm um recipiente de preparação de amostra que é preenchido com azoto líquido para permitir a transferência da grelha para o suporte sem aquecer a amostra. O suporte de entrada lateral é inserido no MET diretamente com a amostra presa na extremidade.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Coleta de dados MicroED
<ol><li>Localização e triagem de nanocristais<ol><li>Abra as válvulas da coluna TEM. Ajuste a ampliação usando os painéis manuais para a menor ampliação possível. Encontre o feixe ajustando o botão de intensidade nos painéis de mão de modo que uma área redonda e brilhante seja visível na tela fluorescente.</li>
		<li>Pegue um atlas de grade inteira em uma ampliação baixa (50 - 300x) usando um software apropriado14,15,16 (Figura 2). Certifique-se de que o microscópio esteja bem alinhado para imagens de baixa e alta ampliação antes de coletar dados MicroED de alta resolução.</li>
		<li>Identificar quadrados de grade sem carbono quebrado e ter um material/grãos pretos ou escuros visíveis no filme (Figura 2). Navegue pela grade, seja fisicamente usando o joystick nos painéis de mão, ou virtualmente no Atlas coletado, a fim de procurar quadrados de grade que não estejam quebrados e contenham microcristais.</li>
		<li>Adicione o centro de cada um desses quadrados a uma lista de locais de grade para investigação. Esses locais podem ser adicionados a um notebook, na interface do usuário do microscópio ou em um software de automação de microscópio.</li>
		<li>Aumente a ampliação para 500-1.300x e ajuste a altura eucêntrica em cada local de grade armazenado e atualize o valor Z salvo para as posições anotadas em 7.1.4.</li>
		<li>Pesquise na tela fluorescente ou em uma câmera rápida nesta ampliação mais alta para pequenos pontos pretos / grãos na grade. Uma boa amostra com frequência tem bordas afiadas em alta magnificação, sugerindo ordem cristalina.</li>
		<li>Mova um cristal potencial localizado para o centro da tela e aumente a ampliação de tal forma que o MET entre no modo de alta ampliação. NOTA: Isso é conhecido como modo de alta ampliação, Zoom2 ou SA em diferentes instrumentos e normalmente corresponde a ampliações de 3.000x ou superiores.</li>
		<li>Insira uma abertura de área selecionada. Mude a abertura para um tamanho maior ou menor para garantir que a área selecionada seja apenas maior que o cristal (Figura 3).</li>
		<li>Mude para o modo de difração pressionando o botão de difração nos painéis manuais de TEM, garantindo que a tela fluorescente seja inserida. Ajuste o comprimento da câmera usando o botão de ampliação de forma que a borda tenha pelo menos 1 Å de resolução. NOTA: A calibração dos comprimentos de difração deve ser realizada por um engenheiro de serviço usando uma grade de waffle de ouro ou espécime conhecido antes de tentar experimentos MicroED.</li>
		<li>Ajuste o foco de difração de forma que o ponto central seja o mais nítido e pequeno possível. Usando os botões de deslocamento de difração, mova o feixe central para o centro da tela fluorescente</li>
		<li>Insira a parada do feixe e certifique-se de que o feixe esteja atrás dele. Levante a tela fluorescente. Faça uma exposição curta (aproximadamente 1 s) na câmera (Figura 4).</li>
		<li>Inspecione o padrão de difração correspondente. Um bom candidato para coletar um conjunto de dados completo terá pontos nítidos que são regularmente organizados em colunas e linhas, e a difração se estenderá para além de 2 Å, de preferência pelo menos até 1 Å (Figura 4). Salve as coordenadas de cristal na interface do usuário do TEM ou anote-as.</li>
		<li>Repita a triagem de difração para todos os cristais potenciais de interesse no quadrado da grade atual.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolha de dados<ol><li>Centralize um cristal blindado na tela em uma ampliação alta (> 1.000x). Ajuste a altura eucêntrica do cristal usando uma rotina automática ou manualmente.</li>
		<li>Insira a abertura de área selecionada que melhor se adapte ao tamanho e à forma do cristal, conforme determinado no ponto 7.1.8 (Figura 3). Incline o palco nas direções negativa e positiva até que a imagem seja ocluída pelas barras da grade (Figura 3). Observe esses ângulos para fins de coleta de dados.</li>
		<li>Determine o número de quadros que serão necessários para abranger a cunha angular total do conjunto de dados. É típico usar cunhas de 0,5 a 1,0° para cada quadro, com quadros sendo lidos a cada 1 a 5s, dependendo da sensibilidade da câmera. Por exemplo, uma cunha que se estende de -30° a +30°, girando a uma taxa constante de 1° s-1 com um quadro lido a cada 1s, exigiria 60 quadros totais.</li>
		<li>Considerando a faixa de inclinação total máxima de -72° a +72°, comece a girar o estágio a uma taxa constante de 1° s-1 e, em seguida, comece a ler os dados a cada 1s em uma câmera moderna com um modo de leitura do obturador rolante (Filme 1). Esse processo pode ser realizado manualmente ou por meio de softwares específicos para ETM.<ol><li>Defina a taxa de rotação especificando a % da velocidade máxima de inclinação e quando parar na interface do usuário do microscópio ou no software dedicado. Nesta investigação, isso foi medido como sendo 0,3° s-1 para cada % de velocidade máxima, mas precisará ser verificado independentemente para cada microscópio. NOTA: A inclinação e a coleta de dados da câmera são configuradas independentemente aqui, mas os programas de software14 podem coordenar isso para simplificar o processo.</li>
			<li>Descarte aproximadamente 1° de cada lado da cunha especificada na maioria dos casos como tempo morto, onde o estágio está aumentando ou diminuindo para a velocidade de rotação desejada.</li>
		</ol></li>
		<li>Salve dados em vários formatos como quadros individuais ou como uma pilha de imagens (Filme 1).</li>
		<li>Converta esses quadros de difração para um formato cristalográfico típico usando ferramentas MicroED - disponíveis aqui (https://cryoem.ucla.edu). Imagens de difração salvas em formato SMV são prontamente processadas usando software cristalográfico documentado17,18.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+determination+by+continuous-rotation+data+collection+in+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED.</a> Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).</li>
<li>Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+with+the+Falcon+III+direct+electron+detector%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">MicroED with the Falcon III direct electron detector.</a> IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).</li>
<li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+A+Foundations+and+Advances%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection and processing.</a> Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Martynowycz, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+the+human+adenosine+receptor+determined+from+a+single+nanocrystal+in+LCP%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP.</a> BioRxiv. , 316109(2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+continuous+rotation+MicroED+data+from+ion+beam-milled+crystals+of+any+size%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size.</a> Structure. 27 (3), 545-548 (2019).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+incorporation+into+protein+microcrystals+for+MicroED+by+on-grid+soaking%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking.</a> Structure. , (2020).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li>
<li>Jones, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CryoEM+method+MicroED+as+a+powerful+tool+for+small+molecule+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination.</a> ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).</li>
<li>Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+tryptophan+synthase+TrpB+for+selective+quaternary+carbon+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).</li>
<li>Gallagher-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-%C3%A5ngstr%C3%B6m+cryo-EM+structure+of+a+prion+protofibril+reveals+a+polar+clasp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).</li>
<li>Ting, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+scaffold+peptide+in+the+biosynthesis+of+amino+acid-derived+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products.</a> Science. 365 (6450), 280-284 (2019).</li>
<li>de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroED+data+collection+with+SerialEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">MicroED data collection with SerialEM.</a> Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+automated+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Software tools for automated transmission electron microscopy.</a> Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>de la Cruz, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+structures+from+fragmented+protein+crystals+with+the+cryoEM+method+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED.</a> Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).</li>
<li>Shi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+collection+of+MicroED+data+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The collection of MicroED data for macromolecular crystallography.</a> Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).</li>
<li>Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+catalase+determined+by+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of catalase determined by MicroED.</a> eLife. 3, 03600(2014).</li>
<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação da amostra é tipicamente um processo iterativo, onde as otimizações são feitas após sessões de triagem e coleta de dados. Para amostras de moléculas pequenas, muitas vezes é prudente tentar primeiro a preparação da grade sem descarga de brilho das grades, uma vez que muitos fármacos tendem a ser hidrofóbicos10,11. Se as grades tiverem poucos depósitos nanocristalinos, é uma boa ideia tentar novamente após a primeira descarga de brilho das grades. Pod...

A difração eletrônica de microcristais (MicroED) é um método de criomicroscopia eletrônica (crio-EM) para determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho submicrométrico 1,2. Os cristais são aplicados a grades de microscópio eletrônico de transmissão padrão (TEM) e congelados mergulhando em etano líquido ou nitrogênio líquido. As grades são então carregadas em um MET operando em temperaturas criogênicas. Os cristais são localizados na grade e peneirados para a qualidade inicial da difração. Os dados MicroED de rotação contínua são coletados de um subconjunto dos cristais peneirados, onde os dados são salvos usando uma câmera rápida como um filme3. Esses filmes são convertidos para um formato cristalográfico padrão e processados quase de forma idêntica como um experimento de cristalografia de raios X4.
O MicroED foi originalmente desenvolvido para investigar microcristais de proteína 1,2. Um gargalo na cristalografia de proteínas é o crescimento de cristais grandes e bem ordenados para experimentos tradicionais de difração de raios X síncrotron. Como os elétrons interagem com ordens de magnitude da matéria mais fortes que os raios X, as limitações do tamanho do cristal necessário para produzir difração detectável é consideravelmente menor5. Além disso, a razão entre eventos de espalhamento elástico e inelástico é mais favorável para elétrons, sugerindo que dados mais úteis podem ser coletados com uma menor exposição global5. Desenvolvimentos constantes têm permitido a coleta de dados de MicroED a partir dos microcristais mais desafiadores 6,7,8,9.
Recentemente, o MicroED tem se mostrado uma poderosa ferramenta para determinar as estruturas de fármacos de pequenas moléculas a partir de materiais aparentemente amorfos10,11,12,13. Esses pós podem vir diretamente de um frasco de reagente comprado, de uma coluna de purificação ou até mesmo do esmagamento de uma pílula em um pó fino10. Esses pós parecem amorfos a olho nu, mas podem ser inteiramente compostos de nanocristais ou simplesmente conter traços de depósitos nanocristalinos em uma fração amorfa não cristalina maior. A aplicação do material na grade é fácil, e as etapas subsequentes de identificação de cristais, triagem e coleta de dados podem até ser automatizadas em um futuro próximo14. Enquanto outros podem utilizar diferentes métodos para preparação de amostras e coleta de dados, aqui são detalhados os protocolos desenvolvidos e utilizados no laboratório de Gonen para a preparação de amostras de pequenas moléculas para MicroED e para a coleta de dados.

<table><tbody><tr><td>Tubos Eppendorf de 0,1-1,5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Qualquer frasco ou tubo serve.</td></tr><tr><td>Clipes de grade automática</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>grades recortadas não são necessárias para MicroED. Eles são necessários para TEMs Thermo-Fisher equipados com um sistema de carregamento automático.</td></tr><tr><td>Anéis C Autogrid</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapina</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td><td>Qualquer quantidade será suficiente para esses experimentos</td></tr><tr><td>Detector baseado em CMOS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>Usamos um CetaD 16M, mas qualquer detector com modo de obturador rotativo ou leitura suficientemente rápida é aceitável.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software Delphi</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software em sistemas Thermo-Fisher TEM que permite a rotação manual do estágio de amostra</td></tr><tr><td>Software EPU-D</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software comercial para aquisição de dados MicroED</td></tr><tr><td>Corrediças de cobertura de vidro</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Descarregador de brilho</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>High PrecisionPinças</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Qualquer pinça de alta precisão servirá</td></tr><tr><td>Vaso de nitrogênio líquido</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>Um vaso de espuma padrão para manuseio de amostras sob nitrogênio líquido - 800mL</td></tr><tr><td>SerialEM software</td><td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>Software livre distribuído pela D. Mastronarde. Grades TEM do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento</td></tr><tr><td>Grades de malha</td><td>Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 foram usadas aqui, mas qualquer grade de carbono fina funcionará. Para essas pequenas moléculas, sugerimos começar com carbono contínuo.</td></tr><tr><td>microscópio eletrônico de transmissão (TEM)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman papel de filtro circular</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90mm ou maior</td></tr></tbody></table>

difração de elétrons microcristal de pequenas moléculas

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Um protocolo detalhado para a preparação de amostras de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED) é descrito. O MicroED foi desenvolvido para resolver estruturas de proteínas e pequenas moléculas usando equipamentos de criomicroscopia eletrônica padrão (cryo-EM). Dessa forma, pequenas moléculas, peptídeos, proteínas solúveis e proteínas de membrana foram recentemente determinadas com altas resoluções. Protocolos são apresentados aqui para a preparação de grades de fármacos de pequenas moléculas usando o fármaco carbamazepina como exemplo. Protocolos para triagem e coleta de dados são apresentados. Etapas adicionais no processo geral, como integração de dados, determinação de estrutura e refinamento são apresentadas em outro lugar. Estima-se que o tempo necessário para preparar as grades de moléculas pequenas seja inferior a 30 min.

O MicroED é um método crioEM que aproveita as fortes interações entre elétrons e matéria, o que permite a investigação de cristais pequenosque desaparecem12,13. Após essas etapas, espera-se ter um filme de difração em formato cristalográfico coletado de microcristais (Filme 1). Aqui, a técnica é demonstrada com o uso da carbamazepina12. Os resultados mostram um conjunto de dados MicroED de rotação contínua a partir de um m...

Aqui, descrevemos os procedimentos desenvolvidos em nosso laboratório para a preparação de pós de cristais de pequenas moléculas para experimentos de difração eletrônica de microcristais (MicroED).

Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

Neste procedimento, mostramos como proceder de uma pequena molécula em pó para uma estrutura tridimensional em minutos. Esta é uma técnica transformadora para a comunidade química. Muitos compostos não crescem facilmente em grandes cristais.Com o MicroED, podemos determinar estruturas de resolução atômica a partir de cristais de tamanho nanométrico. Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Mike Martynowycz, que é professor da UCLA. Para começar, transfira uma pequena quantidade de pó, líquido ou sólidos para um pequeno frasco ou tubo.Para amostras já em pó, sele o tubo usando a tampa até que a amostra seja necessária. Da mesma forma, seque as amostras líquidas em pós. Embrulhe filme plástico em torno de uma extremidade de uma lâmina de tampa de vidro.Coloque as grades de MET sobre o filme na parte superior da lâmina da tampa com o lado de carbono de cor marrom voltado para cima. Em seguida, coloque a lâmina com grades na câmara de descarga de brilho e descarregue a lâmina de cobertura por aproximadamente 30 segundos usando a configuração negativa em 15 picoamperes. Guarde as grades na tampa dentro de uma placa de Petri de vidro forrada com papel filtro antes de adicionar a amostra às grades.Retire a grade de TEM de descarga de brilho da placa de Petri coberta usando uma pinça e coloque-a em um papel de filtro circular com o lado de carbono voltado para cima. Usando uma pequena espátula, retire uma colher muito pequena de pó e coloque-a em uma pequena tampa de vidro quadrada ao lado da grade de TEM no papel de filtro. Coloque outra pequena lâmina de vidro quadrada ou tampa deslizante em cima do pó.Com os dedos, esfregue suavemente as duas lâminas de vidro juntas para fazer um pó fino. Incline as lâminas da tampa e posicione-as logo acima da grade do MET no papel de filtro e continue a esfregar as lâminas da tampa juntas apenas alguns centímetros acima da grade do MET descarregada com brilho. Observe se o pó está caindo em direção à grade.Descubra o pó finamente moído removendo uma das duas lamínulas da tampa de vidro. Em seguida, escove suavemente o pó fino da tampa, deslize para a grade do TEM usando um pedaço de papel de filtro. Pegue a borda da grade de ETM usando um conjunto de pinças, garantindo que as pontas não furem nenhum dos quadrados da grade.Levante a grade de um a dois centímetros acima do papel de filtro e incline a grade a 90 graus em relação ao papel abaixo. Bata suavemente na pinça enquanto mantém a grade firmemente pinçada para remover qualquer pó solto. Congele a grade movendo a ponta da pinça com a grade diretamente em um recipiente de nitrogênio líquido à mão e espere até que a grade e a pinça parem de ferver.Sob nitrogênio líquido, coloque a grade no porta-amostras com o lado carbono orientado de tal forma que a amostra seja atingida pelo feixe antes do filme de suporte de carbono. Coloque o porta-amostras no MET garantindo que a grade seja sempre mantida em temperaturas de nitrogênio líquido. Para sistemas de carregadores automáticos, coloque as grades cortadas em um em um recipiente refrigerado por nitrogênio líquido, o que permite que a robótica do carregador automático aceite o, mantendo as amostras seguras para o transporte entre o carregador automático e a coluna.Abra as válvulas da coluna TEM e ajuste a ampliação usando os painéis manuais para a menor ampliação possível. Encontre o feixe ajustando o botão de intensidade nos painéis de mão de modo que uma área brilhante redonda seja visível na tela fluorescente. Faça um atlas de toda a grade em baixa ampliação usando o software apropriado, garantindo que o microscópio esteja bem alinhado para imagens de baixa e alta ampliação antes de coletar dados MicroED de alta resolução.Identifique quadrados de grade sem carbono quebrado e grãos pretos ou escuros visíveis no filme. Navegue pela grade fisicamente usando o joystick nos painéis de mão ou virtualmente no atlas coletado para procurar quadrados de grade que não estejam quebrados e contenham microcristais. Adicione o centro de cada um desses quadrados a uma lista de locais de grade para investigação, que pode ser adicionada a um notebook na interface do usuário do microscópio ou no software de automação do microscópio.Defina a ampliação entre 500 a 1300x. Ajuste a altura central em cada local de grade armazenado e atualize o valor z salvo para as posições anotadas. Pesquise na tela fluorescente ou em uma câmera plana por pequenos pontos pretos ou grãos na grade.Uma boa amostra geralmente terá bordas afiadas em alta ampliação, sugerindo cristal em ordem. Mova um cristal potencial localizado para o centro da tela e aumente a ampliação de tal forma que o MET entre no modo de alta ampliação. Insira uma abertura de área selecionada e altere a abertura para um tamanho maior ou menor para garantir que a área selecionada seja maior que o cristal.Mude para o modo de defração pressionando o botão de defração nos painéis manuais TEM, garantindo que a tela fluorescente seja inserida. Ajuste o comprimento da câmera usando o botão de ampliação de modo que a borda tenha pelo menos uma resolução angstrom. Ajuste o foco de difração de forma que o ponto central seja o mais nítido e pequeno possível.Usando os botões de deslocamento de difração, mova o feixe central para o centro da tela fluorescente. Insira a parada do feixe certificando-se de que o feixe está atrás dele. Levante a tela fluorescente e faça uma breve exposição na câmera.Inspecione o padrão de defração correspondente, certificando-se de que o padrão terá pontos pontiagudos que são regularmente dispostos em colunas e linhas. Salve as coordenadas de cristal na interface do usuário do MET ou anote-as e, em seguida, repita a triagem de difração para todos os cristais potenciais de interesse no quadrado da grade atual. Centralize o cristal peneirado em uma ampliação maior que 1000x e ajuste a altura cêntrica do cristal usando uma rotina automática ou manualmente.Insira a abertura de área selecionada que melhor se adapta ao tamanho e à forma do cristal. Incline o palco nas direções negativa e positiva até que a imagem seja ocluída pelas barras de grade. E observe esses ângulos para fins de coleta de dados, lendo os dados a cada um segundo em uma câmera moderna com um modo de leitura do obturador rolante.Defina a taxa de rotação especificando a porcentagem da velocidade máxima de inclinação e quando parar na interface do usuário do microscópio ou no software dedicado. Salve os dados em uma variedade de formatos, diz quadros individuais ou como uma pilha de imagens. Um filme de defração em formato cristalográfico coletado de microcristais mostra um conjunto de dados MicroED de rotação contínua a partir de um microcristal de carbamazepina identificado em uma grade de MET.Após a coleta, integração e solução da estrutura dos dados, uma estrutura de alta resolução é determinada e sua clareza depende da qualidade e completude dos dados. A aplicação da amostra à grade é fundamental para a aquisição de bons dados. Seguindo este método, os dados podem ser processados usando software cristalográfico padrão.Demonstrar que o MicroED é um método poderoso para pequenas moléculas abriu seu uso em todo o mundo para resolver novas estruturas de moléculas criticamente importantes.

microcrystal-electron-diffraction-of-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este documento apresenta um método detalhado para caracterizar a microestrutura dos materiais de granulação e nanocristalinos ultra-finas utilizando um microscópio electrónico de varrimento equipado com um sistema de difracção de electrões retroespalhamento padrão. ligas de metais e minerais apresentam microestruturas refinadas são analisados ​​usando esta técnica, mostrando a diversidade das suas possíveis aplicações.

Caracterização de Ultra-grão fino e nanocristalinos Materiais Usando Transmissão Kikuchi Diffraction

Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .

Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em&gt; Em Cellulo</em&gt; Difração

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Descrevemos um experimento projetado para sondar o dano eletrônico induzido em nanocristais de Buckminsterfulereno (C60) pela intensa, femtosecond pulsos de raios-x. O experimento encontrado que, surpreendentemente, ao invés de ser estocástico, raio-x induzida elétron dinâmica em C60 está altamente correlacionada, estendendo-se ao longo de centenas de células de unidade dentro do cristais1.

Medições de correlações eletrônicas de longo alcance durante experimentos de difração de femtossegundo realizados em nanocristais de Buckminsterfulereno

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

Nós descrevemos uma configuração de trajetória para realizar mapeamento de microdiffraction fluorescência e raio-x rápida radiografia bidimensional do único cristal ou pó amostras usando Laue (radiação policromática) ou difração (radiação monocromática). Os mapas resultantes fornecem informações sobre tensão, orientação, distribuição de fase e deformação plástica.

Síncrotron Microdiffraction de raio-x e imagem latente de fluorescência das amostras de rocha e minerais

Apresentado aqui é um protocolo para rotular proteínas de membrana em células de mamíferos e revestir a amostra com grafeno para microscopia eletrônica de transmissão de transmissão de fase líquida. A estabilidade das amostras contra os danos causados pela radiação também pode ser estudada com este protocolo.

Gabinete de grafeno de células mamíferas quimicamente fixas para microscopia eletrônica de fase líquida

Fornecemos um esboço geral de métodos quantitativos de microanálise para estimar as ocupações do local de impurezas e seus estados químicos, aproveitando fenômenos de canalização eletrônica sob condições de agitação de raios-elétron incidentes, que extraem informações confiáveis de espécies minoritárias, elementos de luz, vagas de oxigênio e outros defeitos point/line/planar.

Análise quantitativa do local atômico de defeitos funcionais/pontos em materiais cristalinos por Microanálise Aprimorada por Canalização eletrônica

A relação sinal-ruído dos dados é uma das considerações mais importantes na realização de medições de difração de raios-X a partir de microcristais. A linha de feixe VMXm fornece um ambiente de baixo ruído e micróbios para tais experimentos. Aqui, descrevemos métodos de preparação de amostras para montagem e resfriamento de microcristais para VMXm e outras linhas de cristalografia macromolecular microfocus.

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Esta contribuição descreve como configurar a cristalização de proteínas em dispositivos cristal sobre cristal e como executar a coleta automatizada de dados seriais à temperatura ambiente usando a plataforma de cristalização no chip.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Aprenda a preparar amostras de pequenas moléculas para difração de elétrons microcristal (MicroED) usando carbamazepina como modelo. Este protocolo permite determinar estruturas atômicas a partir de nanocristais em menos de 30 minutos.

Difração de Elétrons Microcristal de Pequenas Moléculas

Explorar mais vídeos