Name: Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a quantificar espécies reativas de oxigênio em neutrófilos infectados com Escherichia coli usando sondas fluorescentes e leitura em tempo real. Este método auxilia pesquisadores a estudar mecanismos bactericidas durante interações hospedeiro-patógeno.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31670845, 31870832, 32000811) e pelo Programa de Distinto Professor da Província de Liaoning (LJH2018-35).

O sangue periférico dos voluntários aplicado nesta pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do primeiro Hospital da Universidade Médica da China (#2020-2020-237-2).
1. Preparação de reagentes e meio de cultura
<ol><li>Prepare o tampão de lise de glóbulos vermelhos adicionando 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3, 37,2 mgs de Na2EDTA em 1 L de água dupla destilada e ajuste o pH para 7,2-7.4. Remova as bactérias por filtragem usando filtros de 0,22 μm.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura experimental para neutrófilos adicionando 5% de soro bovino fetal ao meio RPMI 1640 e armazene a 4 °C. Equilibre-se à temperatura ambiente antes de usar. NOTA: Use o meio RPMI 1640 sem vermelho fenol.</li>
	<li>Prepare o soro fisco tampão de fosfato (PBS) adicionando 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4·2H2O e 0,2 g de KH2PO4 em 1 L de água dupla destilada em um frasco de vidro 1 L. Ajuste o pH para 7,2-7.4. Autoclave-o por 15 min a 121 °C.</li>
	<li>Prepare a solução de rifampicina dissolvendo 0,5 g de pó de rifampicina em 10 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) para produzir uma solução de rifampicina de 50 mg/mL.</li>
	<li>Prepare a solução de ágar LB adicionando 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 15 g de ágar em pó em 1 L de água dupla destilada e autoclave a mistura. Encha as placas de Petri à metade do volume, derramando solução de ágar LB quente contendo 100 μg/mL rifampicina. Armazene a placa sólida resfriada a 4 °C.</li>
	<li>Prepare o caldo de infusão do coração cerebral (BHI) apropriado para cepas bacterianas, dissolvendo 37 g de pó BHI em 1 L de água dupla destilada. Ajuste o pH para 7.2 e autoclave-o.</li>
	<li>Dissolva a sonda fluorescente dihidroedicium (DHE) em solvente DMSO para produzir uma solução de estoque de 10 mM. Misture delicadamente antes de usar. NOTA: Aliquot a solução de ações imediatamente em frascos à prova de luz. O prazo de validade da solução de ações é de 6 meses a -20 °C.</li>
</ol>2. Preparação da cepa de bactérias E44
NOTA: E44 é uma cepa mutante de meningite E. coli com resistência à rifampicina.
<ol><li>Mergulhe a colônia criopreservada E44 com uma ponta de pipeta estéril, inocular a cepa E44 na placa de ágar LB contendo 100 μg/mL rifampicina por linhas de desenho. Coloque a placa de cabeça para baixo na incubadora a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Um dia antes do experimento, escolha uma colônia E44 da placa com uma ponta de pipeta estéril e coloque-a em 5 mL de caldo BHI contendo 100 μg/mL rifampicina em um frasco de 50 mL. Incubar a cultura bacteriana a 37 °C com 90 rpm por 17 h em um shaker de incubação.</li>
</ol>3. Isolamento de neutrófilos do sangue periférico humano
<ol><li>Retire 5 mL de amostra de sangue de voluntários por via intravenosa para o tubo de coleta de sangue de vácuo contendo EDTA para anticoagulação.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue periférico a 500 x g por 5 min. As amostras de sangue são divididas em três camadas por centrifugação, que de baixo para cima são a camada de glóbulos vermelhos (RBC), a camada de glóbulos brancos (WBC) e a camada plasmática, sequencialmente.</li>
	<li>Aspire a camada de glóbulos brancos com uma tubulação em um novo tubo com tampão de lise RBC 3x. Misture bem a mistura e coloque em temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min. Aspire completamente o supernatante e descarte.<ol>
<li>Repita o procedimento de lise com tampão de lise RBC 1-2 vezes, até que o precipitado fique branco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as células reutilizando o precipitado com 2 mL de PBS. Em seguida, centrífuga a 300 x g por 5 minutos para deixar as células se acalmarem até o fundo do tubo.</li>
	<li>Rotule os neutrófilos com microesferas CD16 reutilizando o sedimento com 50 μL de tampão de classificação de células magnéticas pré-cozidos. Em seguida, misture com 50 μL de microesferas CD16 humanas completamente. Incubar a mistura a 4 °C por 30 min. NOTA: As soluções devem ser pré-resfriadas para evitar o corte de anticorpos na superfície celular e rotulagem não específica. A maioria dos adultos tem cerca de 4.000 a 10.000 glóbulos brancos por microliter de sangue, entre os quais, os neutrófilos representam aproximadamente 50-70%. Por estimativa, as contagens de glóbulos brancos totais em 5 mL de sangue periférico humano são geralmente até 2-5 x 107.</li>
	<li>Lave as células adicionando 2 mL de tampão de classificação de células magnéticas e centrífuga a 4 °C, 300 x g por 10 min. Descarte o supernatante completamente e resuspenque o precipitado com 500 μL de tampão de classificação.</li>
	<li>Monte a coluna magnética e a prateleira de separação. Mova o separador para a prateleira com a coluna magnética e enxágue a coluna com 3 mL de tampão de classificação.</li>
	<li>Solte a suspensão celular na coluna para permitir que os neutrófilos rotulados pelas contas magnéticas se conectem à coluna magnética.</li>
	<li>Lave as células não rotuladas adicionando 3 mL de tampão de classificação de células magnéticas 3 vezes, certificando-se de que o reservatório da coluna está vazio cada vez.</li>
	<li>Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de tampão de classificação de células magnéticas à coluna. Empurre as células magnéticas rotuladas usando um êmbolo. NOTA: Para melhorar a pureza dos neutrófilos, as etapas de classificação podem ser repetidas usando uma nova coluna.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min, descartar o supernasal completamente e resuspensar o precipitado com 1 mL de meio de cultura. Determine o número da célula com um contador celular e prepare as células para mais experimentos.</li>
</ol>4. Medição de ROS
<ol><li>Centrifugar os neutrófilos isolados a 300 x g por 5 min, resuspensar o precipitado e ajustar a concentração celular para 2 x 106/mL com meio de cultura contendo 5 μM SONDA de fluorescência DHE.</li>
	<li>Incubar os neutrófilos a 37 °C por 30 minutos para carregar a sonda DHE e, em seguida, alocar a suspensão celular para uma microplata de poliestireno preto de 96 poços com 200 μL por poço.</li>
	<li>Ligue o leitor de microplacão e abra o software de detecção. Escolha o formato opaco da placa de 96 poços e determine a área de leitura.<ol>
<li>Ajuste a fluorescência (Ex/Em = 518/605 nm) no modo cinético a cada 5 minutos para 60 min a 37 °C. Certifique-se de agitar a placa por 3 s antes de cada leitura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire a microplaca da incubadora, adicione o E44 cultivado (MOI=100) ou phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) a cada poço contendo neutrófilos pré-carregados com 3 réplicas. Use o PMA como um controle positivo.</li>
	<li>Coloque a placa no leitor de microplacão e inicie o ensaio imediatamente.</li>
</ol>

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<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
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<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram não interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Os neutrófilos agem como o componente mais abundante dos glóbulos brancos na circulação sanguínea humana. São importantes células efeitos no sistema imunológico humano inato, que constrói a primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos11. A geração de ROS representa um dos principais mecanismos bactericidas de neutrófilos após a fagocitose11. Estudos recentes mostraram que uma estrutura semelhante a uma rede liberada por um neutrófilo chamado armadilha extracelular...

Meningite bacteriana neonatal é uma doença infecciosa pediátrica comum. Escherichia coli (E. coli) com uma cápsula K1 é o patógeno Gram-negativo mais comum que causa meningite bacteriana neonatal, representando cerca de 80% da incidência total1,2,3. Apesar dos avanços na quimioterapia antimicrobiana e no cuidado de apoio, a meningite bacteriana ainda é uma das condições mais devastadoras com alta morbidade e mortalidade4.
A ocorrência de meningite bacteriana neonatal geralmente começa com a bacteremia causada pela entrada de bactérias patogênicas na circulação periférica das lesões locais dos recém-nascidos, seguida pela penetração através da barreira hemoencefálica (BBB) no cérebro, resultando na inflamação das meninges4. O surgimento da bacteremia depende da interação entre bactérias e células imunes hospedeiras, incluindo neutrófilos e macrófagos, etc. Os neutrófilos, que respondem por ~50-70% dos glóbulos brancos, são a primeira linha de defesa contra infecções bacterianas5,6. Durante a invasão de bactérias, os neutrófilos ativados são recrutados para os locais infecciosos e liberam espécies reativas de oxigênio (ROS), incluindo o ânion de superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidróxil e oxigênio singlet7. O ROS sofre reações redox com a membrana celular, moléculas de ácido nucleico e proteínas da bactéria, resultando na lesão e morte da bactéria invasora8. A mitocôndria é o principal local da produção de ROS em células eucarióticas, e várias oxidases (por exemplo, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) complexo oxidase, sistema lipoxygenase, proteína quinase C e sistema ciclooxygenase) mediam a produção de ROS9,10. A medição em tempo real da produção de ROS, representando o principal mecanismo antimicrobiano em neutrófilos, é um método útil para estudar a defesa hospedeira durante a interação bactérias-hospedeiras.
Neste protocolo, a produção de ROS dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada com uma sonda ROS fluorescente DHE, detectada por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em outras células mamíferas durante a interação patógeno-hospedeiro.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de polipropileno de 15 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células Autuomated</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Carbinete de Segurança Biológica</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Infusão de coração cerebral</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Microesferas, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td> <td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de separação MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de separação QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 meio</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>agitador termostático</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de bacteremia e penetração bacteriana através da barreira hemencefálica são passos indispensáveis para o desenvolvimento da meningite E. coli. As espécies reativas de oxigênio (ROS) representam os principais mecanismos bactericidas dos neutrófilos para destruir os patógenos invadidos. Neste protocolo, a produção de ROS intracelular dependente do tempo em neutrófilos infectados com meningite E. coli foi quantificada por sondas ROS fluorescentes detectadas por um leitor de microplaca de fluorescência em tempo real. Este método também pode ser aplicado à avaliação da produção de ROS em células de mamíferos durante interações patógenos-hospedeiros.

Utilizando o protocolo descrito neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano e carregados com sonda de fluorescência DHE para detectar as alterações dos níveis de ROS em resposta à infecção pelo E44. Aqui, fornecemos dados representativos que demonstram a produção ROS evocada pela cepa E44 determinada por um leitor de microplapes em tempo real. Adicionando cepas E44 a um MOI de 100, os níveis de ROS aumentaram imediatamente e mostraram uma tendência contínua de alta com uma maneira dependente d...

Escherichia coli é a principal causa de meningite bacteriana gram-negativa neonatal. Durante a infecção bacteriana, espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos desempenham um papel bactericida importante. Aqui introduzimos um método para detectar as espécies reativas de oxigênio em neutrófilos em resposta à meningite E. coli.

Quantificação em tempo real de espécies de oxigênio reativo em neutrófilos infectados com meningite escherichia coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli é a bactéria gram-negativa mais comum que causa meningite neonatal. A ocorrência de meningite bacteriana neonatal começa puramente com a bacteremia e, em seguida, as bactérias no sangue penetram através da barreira cerebral sanguínea para causar meningite. Neutrófilos são a primeira linha de defesa contra as infecções bacterianas.Durante a invasão bacteriana, os neutrófilos ativos liberam ROS. A ROS representa os principais mecanismos bactericidais das células hospedeiras para destruir os patógenos invasores. Medir a produção de ROS em neutrófilos é um método útil para iniciar a defesa do hospedeiro durante a interação bactérias-hospedeiros.Pegue uma única colônia bacteriana da placa com uma pipeta estéril e coloque-a em um meio de infusão cérebro-coração de cinco mililitros contendo Rifampicina em um frasco côncavo. Incubar a cultura bacteriana em 37 centígrados, com 90 RPM por 17 horas no shaker de incubação. Centrifugar as amostras de sangue periférico a 2000 RPM por cinco minutos.Após centrífuga, as amostras de sangue são divididas em três camadas. De baixo para cima, a camada de glóbulos vermelhos, a camada de glóbulos brancos e a camada de plasma. Aspire a camada de glóbulos brancos em um novo tubo com uma pipeta estéril.Adicione três vezes o tampão de lise de glóbulos vermelhos. Misture bem a mistura e coloque em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrifugar o tubo a 2000 RPM por cinco minutos.Aspire completamente o supernatante e descarte. Repita o procedimento de lise de glóbulos vermelhos por uma ou duas vezes, até que os sedimentos se adoeçam. Lave as células suspendendo o sedimento com dois mililitros pbs.Em seguida, centrifugar o tubo a 1000 RPM por cinco minutos. Resuspense o sedimento com 15 microliter precode-cell sorting buffer para 15 milhões de células. Adicione 15 microesferas magnéticas microfeitiças e misture bem.Incubar a mistura a quatro centígrados por 30 minutos. Em condições normais, o ser humano adulto tem cerca de 4 a 10.000 glóbulos brancos por sangue microliter. Assim, o custo total de glóbulos brancos em cinco mililitros de sangue periférico humano, quase menos de 50 milhões.E 50 contas magnéticas de microliter em 15 tampão magnético microliter é suficiente. A porcentagem normal dos neutrófilos é de 50 a 70% do total de glóbulos brancos. Assim, cerca de 10 milhões de neutrófilos podem ser obtidos a partir de cinco mililitros de sangue.Lave as células adicionando dois amortecedores magnéticos mililitros, por 10 milhões de células ao tubo, e centrífuga a quatro centícaros, 1.200 RPM por 10 minutos. Monte a coluna magnética e a prateleira de separação. Descarte o supernascer completamente, e resuspenque os sedimentos com 500 tampão de triagem magnética microliter para até 100 milhões de células.Enxágüe a coluna com três mililitros de tampão magnético. Aplique a suspensão celular na coluna para permitir que os neutrófilos rotulados pelas contas magnéticas, anexadas à coluna. Lavei as células específicas não específicas adicionando três mililitros tampão por três vezes, uma vez que o reservatório da coluna está vazio cada vez.Remova a coluna do separador magnético e coloque-a em um novo tubo. Adicione um tampão magnético de cinco mililitros na coluna. Empurre as células magnéticas rotuladas usando um êmbolo.Centrifugar o tubo a 1.200 RPM por cinco minutos. Aspire completamente o supernaente, e resuspense o sedimento com um meio de cultura mililitro. Determine o número do celular com um contador.Ajustou a concentração celular para 2 milhões por mililitro no meio de cultura contendo sonda de fluorescência DHE. Coloque os neutrófilos na incubadora por 30 minutos para carregar a sonda DHE. Aloque a suspensão celular para uma microplacão preta de 96 poços com 200 microliter por poço.Ligue o leitor de microplacões. Defina a temperatura para 37 centígrados, escolha o modo de leitura da fluorescência, o tipo de leitura cinética, defina o comprimento de onda da fluorescência. Escolha o formato da placa.Determine a área de leitura. Meça a intensidade da fluorescência a cada cinco minutos por uma hora. Agite a placa por três segundos antes de cada leitura.Retire a microplaca da incubadora. Adicione cepas PMA ou E44 com três repetições. Coloque a placa no leitor de microplacões, pressione o botão iniciar para iniciar o ensaio imediatamente.Usando o esboço do protocolo neste artigo, os neutrófilos foram isolados do sangue periférico humano, e carregados com sonda de fluorescência DHE. Adicionando PMA, ROS intracelular em neutrófilos, mostrou um aumento significativo de 20 para 40 minutos, e atingiu o pico em 60 minutos. Mas eu acho que a produção de E44 ocorre imediatamente e aumenta o tempo dependente.A expressão de ROS causada pela cepa E44 é semelhante à causada pelo PMA. A detecção da produção de ROS em neutrófilos pode contribuir para o estudo mais aprofundado dos mecanismos bacteriocidas dos neutrófilos. Neste protocolo, fornecemos uma maneira mais fácil de detectar a produção de ROS em neutrófilos de forma em tempo real.O método simples também poderia ser usado para monitorar a produção de ROS em outros tipos de células hospedeiras durante as interações hospedeira-bactérias.

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