Monitoramento de interações proteína-ligantes em células humanas por NMR quantitativo em tempo real usando um bioreator de alta densidade celular

A espectroscopia de NMR nas células oferece uma abordagem única para estudar a estrutura proteica e funcionar diretamente em células vivas e monitorar processos biologicamente relevantes, como interações proteína-ligantes. Este bioreator NMR pode manter um alto número de células humanas viáveis e metabolicamente ativas por vários dias no espectrômetro, permitir aplicações NMR em tempo real em células. Este método pode ser aplicado a qualquer proteína intracelular solúvel e livremente em queda submetida a alterações conformais ou químicas.

A rotulagem de isótopos amplia ainda mais a aplicabilidade do método. Para começar, monte a unidade de fluxo usando um tubo NMR da segunda unidade de fluxo, que mais tarde será substituído por aquele que contém células. Consulte as instruções de operação da unidade de fluxo para obter a montagem correta.

Coloque o banho de água conectado ao controle de temperatura da unidade de fluxo até 37 graus Celsius e coloque a garrafa do reservatório no banho de água. Conecte a tubulação FEP da garrafa do reservatório à bomba. Gire a válvula bioreatorial para contornar e pré-encha a bomba com meio.

Em seguida, gire a válvula bioreatorial para fluir e pré-encha o bioretor com o meio a 0,1 mililitros por minuto. Pegue um frasco T75 de células HEK 293 T transfectadas da incubadora de dióxido de carbono e remova o meio gasto. Adicione dois mililitros de trippsina EDTA às células e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente para desprender as células.

Inativar a trippsina com 20 mililitros de DMEM completos e suspender completamente as células por tubulação para cima e para baixo. Então, transfira-os em um tubo centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar as células a 800X G por cinco minutos à temperatura ambiente e descartar o supernatante.

Transfira a pelota celular para um tubo de microcentrifus de tampa de 1,5 mililitro. Para incorporar as células em fios de ágarose, derreta uma alíquota de agarose solidificada a 85 graus Celsius em um aquecedor de bloco, em seguida, mantê-lo em solução a 37 graus Celsius no aquecedor de bloco. Com uma pipeta Pasteur, encha a parte inferior do tubo NMR da unidade de fluxo com 60 a 70 microliters de gel de 1,5% de agarose e coloque-o no gelo para criar um plugue inferior de cinco milímetros de altura.

Aqueça a pelota celular por 15 a 20 segundos no aquecedor de bloco e suspenda cuidadosamente as células em 450 microliters de solução agarose, evitando a formação de bolhas. Aspire a suspensão celular/agarose em uma tubulação PEEK de cromatografia de 30 centímetros de comprimento de diâmetro interno de 0,75 milímetros conectado a uma seringa de um mililitro. Deixe a tubulação esfriar à temperatura ambiente por dois minutos.

Preencha o tubo NMR da unidade de fluxo com 100 microliters de PBS à temperatura ambiente. Fios fundidos de células embutidas na agarose no tubo NMR da unidade de fluxo empurrando suavemente a seringa. Remova o tubo NMR vazio da unidade de fluxo e aumente a vazão para dois mililitros por minuto por alguns minutos para remover bolhas residuais de gás na tubulação de entrada.

Defina a taxa de fluxo para 0,2 mililitros por minuto e insira o tubo NMR contendo as células empurrando-a para cima lentamente, mas de forma constante. Forneça o meio bioreator a uma vazão de 0,1 mililitros por minuto. Coloque a temperatura no espectrômetro NMR para 310 Kelvin e insira a unidade de fluxo no espectrômetro.

Uma vez que o bioreator esteja inserido no espectrômetro NMR, espere alguns minutos para permitir a troca média. Ajuste a correspondência e a sintonia do canal de prótons, shim o ímã e calcule o comprimento do pulso duro de 90 graus. Ajuste os níveis de potência do próton em cada sequência de pulso de acordo com o pulso duro do próton.

Registo um primeiro espectro NMR de prótons zgesgp para registrar o conteúdo da amostra na homogeneidade de campo. Copie o zgesgp e o p3919gp ou os experimentos SOFAST-HMQC para o número desejado e enfileira-os no spooler de aquisição. Injete uma solução concentrada da molécula externa para a garrafa média do reservatório perfurando a tubulação de silicone com uma seringa estéril e longa.

No final do experimento NMR, substitua o tubo contendo as células por um tubo vazio e enxágue a unidade de fluxo com água. Para células que expressam anidrase carbônica sem rótulo, processe o espectro p3919gp aplicando função de janela de enchimento zero e exponencial de ampliação da linha. Para células que expressam nitrogênio-15 rotulado, desmutase de superóxido, processe o espectro SOFAST-HMQC aplicando função de janela de sino de enchimento zero e sinal quadrado em ambas as dimensões.

No MATLAB, importe as regiões espectrais usando o script personalizado Load_ascii_spectra. Execute o script Load_acqus para extrair os horários do espectro 1D. Abra o GUI MCR-ALS 2.0 executando o script mcr_main e na guia de seleção de dados, carregue a matriz de espectros.

Verifique os dados plotando-os. Avalie o número de componentes, seja por decomposição de valor singular ou manualmente, e selecione um método para a estimativa inicial do espectro puro. A detecção variável mais pura ou a análise de fatores em evolução podem ser utilizadas.

Na seleção da janela dataset, selecione Continuar. Defina as restrições para as concentrações na janela de modo Restrições:linha. Aplique uma restrição de não negatividade, selecionando fnnls como Implementação e dois como o número de espécies.

Em seguida, aplique uma restrição de fechamento, defina a restrição a um, a condição de restrição de fechamento como igual a, e aplique a todas as espécies. Defina as restrições para o espectro na janela de modo Restrições:coluna. Aplique uma restrição de não negatividade, selecionando fnnls como implementação e dois como o número de espécies.

Na janela final, defina 50 iterações e um critério de convergência de 0,01. Especifique os nomes de saída para concentrações, espectros e desvio padrão. Clique em Continuar a executar o encaixe MCR-ALS.

As células do bioreator podem ser mantidas vivas por até 72 horas, conforme confirmado por um teste azul trypan. O bioreator foi utilizado para monitoramento em tempo real da ligação de dois inibidores, acetazolamida e metanfetamina à anidramina carbônica superexpressa no citosol das células HEK 293 T. A presença de sinais da proteína superexpressa e da homogeneidade de campo foi avaliada com o primeiro espectro de prótons esculpindo excitações.

No caso da anidrato carbônica, a ligação intracelular dos dois inibidores foi monitorada pela observação de sinais de prótons na região entre 11 e 16 partes por milhão do espectro WATERGATE, decorrentes das histidinações coordenadas pelo zinco e outros resíduos aromáticos. A vinculação bem sucedida foi confirmada pelo aparecimento de sinais adicionais. O MCR-ALS foi utilizado para separar os sinais de RMN decorrentes da anidrádrase carbônica livre e ligada, e para fornecer os perfis de concentração relativos das duas espécies.

O bioreator foi aplicado para monitorar a formação de um dissulfida intramolecular de zinco promovido pela ebselen, uma mímica de glutationa peroxidase. A análise da MCR-ALS em regiões selecionadas do espectro 2D separou os sinais decorrentes das duas espécies e forneceu seus perfis de concentração relativos. É importante inserir e remover o tubo NMR da unidade de fluxo lentamente e de forma constante para evitar saltos de pressão que possam causar a formação de bolhas.

O desenvolvimento de bioreatores de RN abriu caminho para estudar processos dependentes do tempo de resolução atômica, como a regulação de redux e interações medicamentosa/alvo em células vivas.