Name: Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda um protocolo ex vivo de ferimento cutâneo humano para avaliar reparo tecidual com alta precisão. Este método permite quantificar a reepitelização em amostras de pele saudável e diabética, oferecendo uma plataforma pré-clínica valiosa para testar terapias de cicatrização.

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Gostaríamos de agradecer aos senhores deputados Paolo Matteuci e George Smith pelo fornecimento de tecido de pacientes. Também somos gratos à Srta. Amber Rose Stafford por ajudar na coleta de tecidos e no Apelo Daisy por fornecer instalações de laboratório.

<ol><li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+management+for+the+21st+century%3A+combining+effectiveness+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li>
<li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK%27s+National+Health+Service%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li>
<li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK%3A+costs+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li>
<li>López-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li>
<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223(2020).</li>
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<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modeling+conundrum%3A+murine+models+for+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
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<li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450(2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+%28CC+motif%29+ligands+17+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li>
<li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+excisional+wound%3A+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li>
<li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li>
<li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin%3A+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li>
<li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li>
<li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li>
<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283(2019).</li>
<li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8%2B+T+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li>
<li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).</li>
<li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+immunocompetent+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405(2018).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscale%2C+full-thickness%2C+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li>
<li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li>
<li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+senescence%3A+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li>
<li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li>
<li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin%3A+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362(2013).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Neste protocolo experimental, descrevemos um método otimizado para avaliar o fechamento de feridas na pele ex vivo humana usando coloração de tecido de montagem inteira. Este é um recurso importante para permitir uma avaliação crítica de possíveis tratamentos de feridas e proporcionar uma melhor compreensão da resposta de reparação de feridas humanas. Publicamos avaliação de cura em feridas de pele ex vivo anteriormente12,13, mas nestes relatos a abordagem de coloração de todo o montagem não foi usada para medir o fechamento da ferida. A coloração de montagem total é muito mais fácil e requer menos experiência técnica do que a histologia padrão, que envolve parafina ou incorporação de OCT e secção de amostras. O procedimento de montagem total também reduz a variabilidade experimental, permitindo a quantificação de toda a ferida e não apenas uma única seção transversa em uma posição definida dentro do tecido (ver Figura 4B para ilustração comparativa). Apoiamos plenamente a importância de quantificar a cicatrização de toda a estrutura de feridas não simétricas, conforme claramente descrito por Rhea e Dunnwald para feridas agudas murinas14. Esses autores mostraram a importância da secção serial de feridas excisionais in vivo para medidas reprodutíveis e precisas da morfologia da ferida. A secção serial pode ser igualmente aplicada a feridas ex vivo humanas; no entanto, para quantificação precisa do fechamento da ferida e re-epitelialização, a coloração de alto rendimento de montagem total deve ser o método preferido. Observamos que este protocolo de coloração de montagem total também deve ser compatível com o processamento subsequente (cera ou OCT) para análise histológica tradicional.
A coloração de montagem total não é sem desvantagens. Embora proporcione maior reprodutibilidade em experimentos de cicatrização de feridas, requer o uso de mais tecido para análise do que técnicas histológicas padrão. Este pode ser um problema onde o acesso ao tecido é limitado, particularmente quando vários anticorpos precisam ser avaliados. Uma abordagem alternativa seria empregar um método de ferida incisional onde a largura da ferida é relativamente uniforme e a variabilidade é reduzida (como mostrado em camundongos e feridas humanas15,16). No entanto, as feridas excisionais permanecem mais aplicáveis à maioria dos tipos de feridas patológicas17.
Neste estudo, foram criadas feridas de espessura parcial de 2 mm no centro de explants de pele de 6 mm. Este método pode ser otimizado para tamanhos alternativos de feridas excisionais e explantar em diferentes profundidades de pele18. Além disso, a força necessária para gerar feridas vai variar entre os doadores, onde a pele envelhecida exigirá menos força para a biópsia. Também evitaríamos usar a pele exibindo estrias proeminentes ou outras alterações estruturais. Validamos uma série de anticorpos para considerar diferentes aspectos da resposta de cura ex vivo. Este protocolo também pode ser usado com outros anticorpos relevantes para a pele, onde concentrações de anticorpos e tempos de incubação precisarão ser otimizados. No entanto, acreditamos que nosso protocolo é mais adequado à quantificação absoluta do fechamento total da ferida, seguido pela avaliação espacial de proteínas específicas de interesse. Embora o montagem integral forneça uma resolução reduzida de imunolocalização versus análise histológica padrão das seções teciduais, fornece informações 3D adicionais que estão faltando da histologia 2D padrão.
Uma ressalva de avaliar a cura nos modelos ex vivo skin versus in vivo é que ela carece de uma resposta sistêmica. Um aspecto importante da reparação da ferida é a inflamação e a subsequente granulação tecidual, que é causada por um influxo de células inflamatórias e células endoteliais da vasculatura19. Apesar dessa limitação, a pele ex vivo ainda proporciona uma melhor recapitulação da cicatrização clínica do que os ensaios de feridas baseadas em células. Experimentos in vitro em geral envolvem monocamadas ou co-culturas do tipo celular único cultivadas no plástico da cultura tecidual, enquanto a pele ex vivo fornece um ambiente nativo para explorar o comportamento celular. Mais recentemente, surgiram vários sistemas equivalentes à pele, onde a pele é cultivada em um ambiente laboratorial a partir de matriz artificial e células isoladas da pele20,21. Embora esses modelos imitem a pele humana melhor do que a maioria das abordagens in vitro, eles ainda não simulam totalmente o ambiente de tecido nativo e geralmente são muito frágeis para ferir reprodutivelmente. Além disso, nós (e outros) demonstramos que o tecido da pele humana ex vivo retém células imunes residentes, o que, sem dúvida, contribuirá para a reparação22,23. O trabalho futuro deve agora focar na ampliação da viabilidade e imunocompetência do modelo ex vivo para avaliação de cura em estágio final24. Uma opção é o avanço de tecnologias promissoras de órgãos em um chip capazes de prolongar a viabilidade tecidual e manter a arquitetura nativa da pele por até duas semanas na cultura25. Os modelos ex vivo também começaram a considerar a importância da resposta inflamatória da pele incorporando com sucesso células imunes, como neutrófilos, no tecido hospedeiro26 ou injetando tecido hospedeiro com anticorpos para provocar uma reação imune27. Esperamos que essas descobertas abram caminho para o desenvolvimento de métodos mais refinados e traduzíveis no futuro.
Um grande benefício do uso da pele ex vivo para medir o fechamento da ferida é a capacidade de comparar as taxas de cicatrização em tecidos saudáveis (por exemplo, não diabéticos) versus patológicos (por exemplo, diabéticos ou idosos). Aqui mostramos que a re-epitelialização e a formação de barreiras são de fato prejudicadas em feridas diabéticas versus saudáveis ex vivo. De fato, isso fornece um caminho para avaliação pré-clínica da reparação patológica, onde o envelhecimento e o diabetes são os principais fatores de risco para o desenvolvimento de feridas crônicas1. Enquanto existem modelos patológicos in vitro, como células isoladas de tecido envelhecido e diabético, ou células cultivadas em alta glicose para imitar hiperglicemia28,29, essas células podem perder rapidamente seu fenótipo uma vez removido do microambiente in vivo. Um componente importante do ambiente de cura patológica extrínseca é a matriz dérmica, que é alterada tanto no envelhecimento quanto no diabetes30. De fato, essa matriz perturbada afeta o comportamento dos fibroblastos residentes e ingênuos31,32. Assim, a importância de estudar células em seu ambiente de tecido hospedeiro não pode ser subestimada.
Em resumo, nosso protocolo fornece uma importante plataforma para quantificar a re-epitelialização de feridas humanas, explorar fatores regulatórios e testar a validade e eficácia de potenciais terapêuticas12,13. Embora os testes pré-clínicos ainda exijam abordagens in vivo, uma estratégia combinada usando tecido humano ex vivo e ferida in vivo murine deve refinar a via pré-clínica, reduzindo o uso de animais enquanto aumenta a tradução de espécies cruzadas.

As feridas crônicas e não curativas, altamente prevalentes em idosos e diabéticos, são uma área não apreciada de necessidade clínica não atendida. Essas feridas representam uma grande carga física e psicológica para os pacientes e custam bilhões aos prestadores de cuidados de saúde a cada ano para tratar1. Apesar da melhor compreensão da biologia das feridas e dos avanços tecnológicos, até 40% das feridas crônicas ainda não conseguem cicatrizar após o melhor cuidado padrão2. Assim, 14-26% dos pacientes com úlceras diabéticas no pé requerem posteriormente amputação3, enquanto a taxa de mortalidade pós-amputação de 5 anos é de aproximadamente 70%4. Como resultado, há uma exigência urgente de desenvolver novas terapias eficazes para melhorar a qualidade de vida do paciente, reduzindo a carga substancial de saúde imposta por feridas de cura ruins. Modelos pré-clínicos pouco preditivos continuam a ser um obstáculo significativo para o desenvolvimento de novas terapias eficazes.
O reparo de feridas é um processo dinâmico e multifacetado que envolve uma gama diversificada de tipos celulares, inúmeros níveis de comunicação e um ambiente tecidual que é temporariamente remodelado. A cicatrização da pele é sustentada por quatro grandes estágios reparados: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação matricial. Esses estágios, em última análise, atuam para prevenir a perda de sangue e a infecção, fechar a superfície da ferida (um processo chamado de re-epitelialização) e devolver a pele a um estado ileso5. As feridas crônicas estão associadas à etiologia diversificada e à perturbação generalizada aos processos de cura6,complicando ainda mais a identificação de alvos terapêuticos. No entanto, uma ampla gama de modelos foram desenvolvidos para elucidar os condutores moleculares e celulares da patologia da ferida e testar novas abordagens terapêuticas7.
O modelo de reparo de ferida mais usado é o ferimento agudo no rato. Os camundongos são altamente tratáveis para estudos mecanicistas e fornecem modelos validados de envelhecimento e diabetes8. Apesar das semelhanças gerais mostradas entre a cura do camundongo e do ser humano, as diferenças entre as espécies na estrutura da pele e na dinâmica de cura permanecem. Isso significa que a maioria das pesquisas de ferida murina não se traduz facilmente para a clínica9. Consequentemente, houve um impulso para sistemas humanos in vitro e ex vivo com alta aplicabilidade e tradução10,11.
Aqui fornecemos um protocolo aprofundado para a realização de feridas excisionais de espessura parcial na pele humana ex vivo. Também descrevemos nossa abordagem de coloração de montagem inteira como um método altamente reprodutível de avaliação da cicatrização da pele humana ex vivo. Mostramos a trajetória de reparação epidérmica (re-epitelialização) e posterior formação de barreiras, avaliando a taxa de fechamento de feridas em pele humana saudável versus diabética. Finalmente, demonstramos como a coloração de montagem inteira pode ser adaptada para uso com uma gama de anticorpos para avaliar vários aspectos da resposta à cura.

<table><tbody><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Para lavagem da pele</td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Tubos de microcentrífuga TubeOne, naturais (estéreis)</td><td>Starlab</td><td>S1615-5510</td><td>Para coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Placa CytoOne de 48 poços, Starlab</td><td></td><td>CC7682-7548</td><td>Para coloração de montagem inteira</td></tr><tr><td>Ácido acético Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0400/PB15</td><td>Parte do fixador</td></tr><tr><td>Brometo</td> <td>de alquiltrimetilamônioSigma-Aldrich</td><td>M7635</td><td>Parte do fixador</td></tr><tr><td>Anticorpo de actina de músculo liso alfa [1A4]</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Cora os vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Anticorpo anticolágeno I</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>Cora colágeno</td></tr><tr><td>Anticorpo anticitoqueratina 14 [LL002]</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Cora a epiderme</td></tr><tr><td>Anticorpo CD1A (CTB6)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5265</td><td>Cora células de Langerhans</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo, dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>Contracoloração para núcleos celulares</td></tr><tr><td>Falcon 60mm Placas de Petri</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Cultura humana ex vivo</td></tr><tr><td>Fibronectina Anticorpo (EP5)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8422</td><td>Cora fibronectina</td></tr><tr><td>Formaldeído, Extra Puro, Solução 37-41%, SLR</td><td>Fisher Chemical</td><td>F/1501/PB17</td><td>Parte do fixador</td></tr><tr><td>Cotonetes de Gaze</td><td>Medisave</td><td>CS1650</td><td>Para limpar a pele</td></tr><tr><td>Gibco&trade; Solução antibiótico-antimicótica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Cultura ex vivo humana</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, glicose alta, sem glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960044</td><td>Cultura ex vivo humana</td></tr><tr><td>Gibco Soro fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Cultura humana ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco HBSS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170088</td><td>Cultura ex vivo humana</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Cultura ex vivo humana</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><<td>em>Para coloração de imunoperoxidase</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Institutos Nacionais de Saúde</td><td>N/A</td><td>Para análise de imagem</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Anti-camundongo de cabra com adsorção cruzada, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>O anticorpo secundário usado depende dos fluorocromos necessários e do anticorpo primário</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Anti-coelho de cabra com adsorção cruzada, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>O anticorpo secundário usado depende dos fluorocromos necessários e do anticorpo primário</td></tr><tr><td>Invitrogen LIVE/DEAD Kit de Viabilidade/Citotoxicidade, para células de mamíferos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>Para avaliação da viabilidade do tecido</td></tr><tr><td>Pinça de Íris, 10 cm, Curva, 1x2 dentes</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td>Para criar feridas</td></tr><tr><td>Tesoura de íris, 11 cm, curva, SuperCut, Instrumentos de precisão mundial de carboneto de tungstênio</td><td></td><td>501264</td><td>Para criar feridas</td></tr><tr><td>Tesoura de íris, 11 cm, reta, SuperCut, Carboneto de tungstênio</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td>Para remover tecido adiposo</td></tr><tr><td>Queratina 1 Anticorpo Policlonal, Purificado</td><td>Biolegend</td><td>905201</td><td>Mancha a epiderme</td></tr><tr><td>Anticorpo Policlonal de Queratina 14, Purificado</td><td>Biolegend</td><td>905301</td><td>Mancha epiderme</td></tr><tr><td>LSM 710 Microscópio Confocal de Varredura a Laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>Descontinuado</td><td>Para imagens fluorescentes</td></tr><tr><td>Merck Almofadas absorventes Millipore</td><td>Merck Millipore</td><td>AP10045S0</td><td>Cultura humana ex vivo</td></tr><tr><td>Merck Millipore Nylon Filtros de membrana hidrofílica</td><td>Merck Millipore</td><td>HNWP04700</td><td>Cultura humana ex vivo</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum Solution</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>O soro animal usado depende do anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>Para tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Para bloquear o tampão</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Biorreagents</td><td>BP358-212</td><td>Parte do fixador</td></tr><tr><td>Bolsas de esterilização</td><td>Medisave</td><td>SH3710</td><td>Para esterilizar instrumentos</td></tr><tr><td>Stiefel Punções de biópsia de 2mm</td><td>Medisave</td><td>BI0500</td><td>Para feridas de espessura parcial</td></tr><tr><td>Stiefel Punções de biópsia de 6 mm</td><td>Medisave</td><td>BI2000</td><td>Para explante externo</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Placas de Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>Para preparar a pele</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Chemical</td><td>T/3751/08</td><td>Para tampão de lavagem</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (IgG de coelho)</td><td>Vetor Laboratórios</td><td>PK-6101</td><td>Para coloração de imunoperoxidase; O kit HRP usado depende do anticorpo primário</td></tr><tr><td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td>Para coloração de imunoperoxidase</td></tr><tr><td>Microscópio digital sem fio</td><td>Jiusion N</td><td>/A</td><td>Para imagens de campo claro</td></tr></tbody></table>

modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

As feridas crônicas não curativas, que afetam principalmente idosos e diabéticos, são uma área significativa de necessidade clínica não atendida. Infelizmente, os tratamentos atuais de feridas crônicas são inadequados, enquanto os modelos pré-clínicos disponíveis prevêem mal a eficácia clínica de novas terapias. Aqui descrevemos um modelo pré-clínico de alta produtividade para avaliar múltiplos aspectos da resposta de reparação da pele humana. Feridas de espessura parcial foram criadas na pele ex vivo humana e cultivadas em um curso de tempo de cura. Biópsias de feridas de pele foram coletadas em fixação para o procedimento de coloração de todo o montagem. As amostras fixas foram bloqueadas e incubadas em anticorpos primários, com detecção obtida por anticorpo secundário conjugado fluorescentemente. As feridas foram contra-manchadas e imagens via microscopia confocal antes de calcular o fechamento percentual da ferida (re-epitelialização) em cada biópsia. Aplicando este protocolo, revelamos que 2 mm de feridas excisionais criadas na pele saudável do doador são totalmente re-epitelializadas até o dia 4-5 pós-ferida. Pelo contrário, as taxas de fechamento de feridas de pele diabéticas são significativamente reduzidas, acompanhadas de reforma de barreira perturbada. A combinação do ferimento da pele humana com uma nova abordagem de coloração de montagem total permite um método rápido e reprodutível para quantificar o reparo da ferida ex vivo. Coletivamente, este protocolo fornece uma valiosa plataforma humana para avaliar a eficácia de potenciais terapias de feridas, transformando testes pré-clínicos e validação.

Neste relatório, apresentamos uma nova abordagem de feridas de pele ex vivo e coloração de todo o nível para avaliar fatores que influenciam a resposta ao reparo da pele humana. A Figura 1A mostra um esquema do gasoduto processual, que pode ser realizado em 3-10 dias, dependendo dos tempos de incubação da ferida. As feridas de espessura parcial são cultivadas em pilhas de membrana no ar : interface de membrana e podem ser coletadas para coloração de montagem integral, embutidas em parafina ou meio OCT para histologia geral, ou congeladas em nitrogênio líquido para análise bioquímica(Figura 1B). Geralmente criamos feridas de espessura parcial de 2 mm no centro de explants de 6 mm. No entanto, o tamanho da ferida e explanta circundante pode ser alterado dependendo dos requisitos. O procedimento de montagem total foi adaptado com sucesso para os métodos de coloração de imunoperoxidase e imunofluorescência(Figura 1C).
A imunofluorescência permite a sondagem de tecido com múltiplos anticorpos. Para isso, aconselhamos o uso de anticorpos primários criados em diferentes espécies, e anticorpos secundários fluorescentes com correspondência de espécies para limitar a reatividade entre espécies. As concentrações de anticorpos e os tempos de incubação precisarão ser otimizados. Se for observada a coloração de fundo, reduza as concentrações de anticorpos, aumente as etapas de lavagem e adicione o tampão de bloqueio ao anticorpo secundário. A viabilidade do tecido fresco pode ser avaliada diretamente com corantes de viabilidade comercial (ver Tabela de Materiais). Também mostramos que o tecido pode ser corrigido após a coloração de viabilidade e com sucesso quando é praticamente adequado(Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figura 1: A abordagem de coloração ex vivo humana e a abordagem de coloração de todo o montagem. (A) Pipeline que retrata o fluxo de trabalho processual desde a coleta da pele e a realização de ferimentos ex vivo, até a coloração do tecido e análise de dados. (B) Diagrama demonstrando o sistema de cultura de feridas de pele ex vivo humana com análises realizadas rotineiramente no tecido. (C) A coloração total pode ser empregada utilizando técnicas de imunoperoxidase e imunofluorescência. K14 = queratina 14. (D) O tecido vivo pode ser manchado com corantes de viabilidade comercial e imageado com sucesso pós fixação. Barra = 100 μm. Esta coloração foi realizada em pele não diabética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O uso mais amplamente aplicável para coloração de feridas de montagem total é determinar a taxa de fechamento da ferida de forma mais reprodutível do que pode ser fornecido através de seção histológica. O fechamento percentual foi quantificado como re-epitelialização percentual da superfície da ferida, conforme demonstrado na Figura 2A. A cobertura percentual da área de marcadores específicos pode ser medida a partir da área total da ferida ou como uma porcentagem da ferida re-epitelializada. Caracterizamos a cicatrização em pele saudável (não diabética) versus diabética em um período de sete dias, coletando feridas a cada dia após o ferimento (imagens representativas, Figura 2B). Feridas de pele saudáveis fechadas ao longo do tempo, como esperado, com fechamento total observado na maioria das amostras até o dia 4-5. Pelo contrário, as feridas de pele diabética não conseguiram fechar totalmente dentro do período de análise de sete dias(Figura 2C). Observou-se um atraso significativo no fechamento da ferida entre feridas de pele saudáveis e diabéticas ao comparar as taxas de cicatrização em cada ponto de tempo pós-lesão (P &lt; 0,001 ao dia 6, P &lt; 0,05 no dia 6 e P &lt; 0,05 a P &lt; 0,001 no dia 7).
Após avaliação das taxas globais de fechamento de feridas; medimos a porcentagem de toda a área da ferida (área externa na Figura 2A) onde células positivas de K14 poderiam ser visualizadas (coloração verde na Figura 2B). Curiosamente, observamos que em feridas saudáveis da pele ex vivo, a coloração do K14 atingiu o pico no dia 2 e, em seguida, rapidamente diminuiu (significância em cada ponto de tempo versus o pico do dia 2, Figura 2D). Isso provavelmente reflete a re-formação da barreira epidérmica inicial, excluindo a penetração de anticorpos K14 através de camadas epidérmicas diferenciadas (ver Esquema da Figura 2E). Durante o processo de re-epitelialização, os queratinócitos de camada basal (K14+ve) migram para dentro sobre a ferida aberta de modo que a epiderme se for mais próxima da borda da ferida externa se forma mais cedo do que a epiderme mais próxima da borda interna da ferida (frente migratória). Enquanto a borda frontal da epiderme recém-formada continua a migrar para fechar a ferida aberta restante, a epiderme da borda externa começa a se diferenciar para reformar as outras camadas epidérmicas. Na cura precoce, esperamos, assim, ver que a maior parte da área re-epitelializada consiste em células basais (K14+ve), enquanto em posterior reparo a coloração do K14 é perdida à medida que a epiderme se diferencia do interior externo (ver imagens de montagem total na Figura 2E). Portanto, o declínio das manchas de K14 mostradas na Figura 2D (setas descendentes) correlaciona-se com o aumento da diferenciação epidérmica. Curiosamente, as manchas visíveis de K14 atingiram o pico mais cedo em feridas saudáveis (dia 2) versus diabéticas (dia 4), demonstrando ainda que a ree epitelialização e a subsequente diferenciação epidérmica são em feridas de pele diabéticas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figura 2: A coloração de montagem total revela taxas de cicatrização perturbadas em pele diabética versus saudável. (A) O método utilizado para quantificar o fechamento da ferida a partir de medidas externas e internas da ferida. Imagens de Brightfield mostram a queratina 14 (K14) manchando em vermelho. Barra = 300 μm. (B) Imagens representativas de cura ao longo do tempo (pós-ferida diária) em pele saudável e diabética. Barra = 500 μm. K14 = verde. DAPI = núcleos azuis. (C) Quantificação das taxas de fechamento de feridas (re-epitelialização percentual) mostrando que feridas ex vivo de pele saudável fecham significativamente mais rápido do que feridas ex vivo de pele diabética. H = saudável. Db = diabético. (D) Percentual K14 manchas picos mais cedo na pele saudável versus diabético e, em seguida, diminui em linha com o aumento da diferenciação epidérmica (setas para baixo). (E) A coloração de K14 (célula epidérmica basal) é perdida à medida que a epiderme se diferencia. D = diferenciado. ND = não diferenciado. Linhas pontilhadas brancas retratam bordas internas e externas das feridas. Setas brancas = direção de migração. n = 6 feridas por doador, por ponto de tempo. Média +/- SEM. * = P &lt; 0,05, ** = P &lt; 0,01 e *** = P &lt; 0,001. Saudável e diabético comparado a cada ponto de tempo de cura em C (Valor P para comparação menos significativa). Mudança temporal na coloração do K14 em comparação com o pico para cada doador em D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Em seguida, usamos manchas de montagem inteira para explorar a expressão tecidual e a localização de outros marcadores relevantes para feridas na pele não diabética(Figura 3). Todos os anticorpos utilizados e suas concentrações de trabalho são fornecidos na Tabela de Materiais. Vasos sanguíneos na ferida aberta manchados positivamente com anticorpo de ato muscular liso alfa (a-SMA), usado em combinação com K14 para delinear as bordas epidérmicas em imagens de menor potência(Figura 3A). A matriz dérmica foi manchada com anticorpos contra colágeno tipo I (COL 1) e fibronectina (Fn). Aqui o colágeno foi observado como fibras grossas abundantes, enquanto as fibras de fibronectina eram esparsas, onduladas e finas(Figura 3A). Nossa abordagem de coloração de montagem completa também é capaz de fornecer resolução de nível celular de coloração, como demonstrado para queratinócitos K14 positivos(Figura 3B).
Finalmente, mostramos que as feridas ex vivo humanas possuem células imunes residentes, com células langerhans detectadas em torno de epiderme recém-formada no dia 3 pós-ferida(Figura 3C). De fato, esses resultados sugerem que a coloração de montagem total pode ser usada para investigar características-chave da resposta de cura, incluindo inflamação, proliferação e a matriz extracelular(Figura 4A). Juntos, nossos dados revelam que o procedimento combinado de woundamento da pele ex vivo e coloração de montagem integral é um método válido para avaliar vários aspectos do reparo da pele humana saudável e diabética (patológica).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figura 3: Otimização da abordagem de coloração de todo o montagem para uso com outros anticorpos. (A) Os vasos sanguíneos foram manchados com actina muscular suave alfa (α-SMA, verde) e queratina 14 (K14, vermelho), enquanto as fibras de matriz foram manchadas com colágeno I (COL 1, vermelho) e fibronectina (Fn, verde). (B) O procedimento de montagem integral fornece até a resolução de nível celular de localização (K14, verde; K1, vermelho). (C) Células CD1+ve Langerhans (verde) observadas em epiderme recém-formada. DAPI = núcleos azuis. Barra = 100 μm. Linhas pontilhadas brancas mostram bordas internas e externas das feridas e feridas separadas da epiderme. Esta coloração foi realizada em pele não diabética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figura 4: Validade do procedimento de coloração de todo o montagem para avaliação da cicatrização da ferida. (A) Ilustração que descreve como a técnica de coloração de todo o montagem pode avaliar processos relevantes para a ferida. Anticorpos utilizados = texto vermelho. K14 = queratina 14. COL 1 = colágeno 1. Fn = fibronectina. (B) O procedimento de coloração de montagem total (setas azuis) introduz menos variabilidade às medidas de fechamento da ferida do que a análise histológica padrão (setas vermelhas). S1 = seção 1. WE = borda da ferida. Barra = 300 μm. Esta coloração foi realizada em pele não diabética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui demonstramos uma técnica otimizada para avaliar o reparo da ferida usando a pele humana ex vivo combinada com uma abordagem de coloração de montagem inteira. Essa metodologia fornece uma plataforma pré-clínica para avaliação de potenciais terapias de feridas.

Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Neste artigo, apresentamos um protocolo otimizado de ferida de pele humana ex vivo que pode fornecer dados importantes de eficácia como parte de um pipeline de tradução clínica. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma avaliação precisa de alta produtividade do reparo da ferida na pele humana viva. Demonstrando o procedimento estarão Elizabeth Roberts, pesquisadora de pós-doutorado, e Alexandria Kidd, assistente de pesquisa do nosso laboratório.Para preparar uma amostra de tecido da pele para ferimentos, coloque o lado da dermis da pele para baixo em uma placa de Petri de 90 milímetros e use uma tesoura estéril para remover o tecido adiposo. Quando toda a gordura tiver sido removida, coloque a pele em 25 mililitros de HBSS suplementados com antibióticos por 10 minutos à temperatura ambiente com agitação intermitente para remover qualquer sangue residual no tecido adiposo. Após 10 minutos, enxágue a pele em 25 mililitros de DPBS.Após 10 minutos, repita a lavagem do HBSS sem antibióticos e, em seguida, realize uma lavagem final em 25 mililitros de DPBS. Em seguida, coloque uma membrana de filtro de nylon estéril sobre a pilha de almofada absorvente e seque o lado dérmico da pele em gaze estéril em uma placa de Petri de 90 milímetros para remover DPBS residuais. Coloque o lado de derme da pele seca para baixo em uma tampa limpa de placa de Petri de 90 milímetros para remover qualquer DPBS residual e dab a epiderme seca com gaze estéril fresca.Para criar uma ferida, pressione um soco de biópsia de dois milímetros contra a pele enquanto segura a pele firme e torce suavemente. Usando uma fórceps de tecido dentudos curvos, pegue cada lado da ferida de aproximadamente dois milímetros de diâmetro e enganchar a tesoura Iris curva sob a ferida. Use um soco de biópsia de seis milímetros para fazer uma biópsia ao redor da ferida central de dois milímetros para criar uma explanta de seis milímetros com uma ferida parcial de espessura de dois milímetros no centro.Em seguida, coloque a exderme epidermis da ferida sobre a pilha de membrana do filtro de nylon para uma incubação de um a sete dias a 32 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para coloração fluorescente, colete as explantas da ferida em tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de fixação da pele por tubo e incubar as explantas durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, substitua o fixador por um mililitro de tampão de lavagem de manchas.Após a lavagem, cubra cada amostra com aproximadamente 150 microliters de tampão de bloqueio e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Depois de remover o tampão de bloqueio, adicione 150 microliters de anticorpos primários diluídos no bloqueio de tampão por tubo e incubar as explanações da ferida durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, enxágue as amostras com 500 microliters de tampão de lavagem de manchas contendo 0,2% de azida de sódio seguido por três enxágues em tampão de lavagem regular.Após a lavagem, adicione 150 microliters de um anticorpo secundário conjugado de floresnce apropriado diluído em tampão de lavagem de manchas a cada poço para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, enxágue a explanta três vezes por 30 minutos em 500 microliters de tampão de lavagem de manchas por lavagem antes de contra-colorindo cada explanta com 150 microliters de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Por fim, lave a explanta duas vezes por 30 minutos com 500 microliters de tampão de lavagem por lavagem.Para imagens explant, coloque uma placa de Petri de 60 milímetros na plataforma de imagem de um microscópio confocal e adicione uma camada de aproximadamente um mililitro de DPBS ao prato. Use fórceps para transferir as explantas da ferida para o prato. Depois de configurar o software de imagem conforme apropriado para o experimento, posicione a ferida no centro do plano de imagem e adquira imagens das biópsias da ferida.Para realizar imagens de microscópio digital sem fio para obter imagens de alta qualidade de forma econômica, conecte um telefone ou laptop a um microscópio digital sem fio. Coloque as explantas de lado em um pedaço de tecido de laboratório e remova qualquer tampão de lavagem residual da amostra. Em seguida, posicione a explanta no centro do campo de visão do microscópio e adquira imagens usando a câmera conectada.Imunoperoxidase e imunofluorescência podem ser usados para coloração total do tecido de montagem. Além disso, a coloração viva/morta pode ser realizada em tecido fresco e imagem pré ou pós-fixação. A coloração total das feridas pode ser usada para determinar as taxas de fechamento das feridas de forma reprodutível.Nesta análise representativa, observou-se fechamento saudável da ferida da pele após quatro a cinco dias, enquanto as feridas de pele diabética não conseguiram fechar totalmente dentro do período de análise de sete dias. A expressão K14 atingiu o pico no segundo dia em feridas de pele saudáveis antes de diminuir rapidamente com o aumento da diferenciação epidérmica. Essa ree epitelialização e a subsequente diferenciação epidérmica foram nas feridas de pele diabéticas.A reforma da barreira epidérmica precoce exclui a penetração de anticorpos K14 dentro das camadas epidérmicas diferenciadas. No início do processo de reetelialização, os queratinócitos de camada basal positiva K14 migram para dentro sobre a ferida aberta, de tal forma que a epiderme se aproxima da borda da ferida externa se forma mais cedo do que a epiderme mais próxima da borda interna da ferida. Mais tarde, na fase de reparo, a coloração do K14 é perdida à medida que a epiderme se diferencia do exterior para dentro.A coloração completa do montagem também pode ser usada para estudar a expressão e localização de outros marcadores relevantes da ferida na pele, bem como a presença de células imunes de interesse no local da ferida em diferentes estágios de cicatrização. Gerar feridas excisionais reprodutíveis pode ser um desafio no início. Aconselhamos a prática do procedimento de ferir usando a pele excedente.

human-ex-vivo-wound-model-whole-mount-staining-approach-to-accurately

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Durante o desenvolvimento dos mamíferos, as feridas cutâneas gestacionais precoces cicatrizam sem cicatriz. Aqui, detalhamos um modelo confiável e reprodutível de cicatrização de feridas sem cicatrizes fetais no dorso cutâneo de embriões de camundongos E16.5 (sem cicatrizes) e E18.5 (cicatrizes).

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O objetivo deste protocolo é construir um equivalente tridimensional de pele de espessura total, que se assemelhe à pele natural. Com um dispositivo de ferimento automatizado especificamente construído, feridas precisas e reprodutíveis podem ser geradas sob manutenção de esterilidade.

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Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Aqui, dois modelos de cicatrização de feridas murinasão são descritos, um projetado para avaliar as respostas de cicatrização celular e citocina e o outro para quantificar a taxa de fechamento da ferida. Esses métodos podem ser usados com modelos de doenças complexas, como o diabetes, para determinar mecanismos de vários aspectos da má cicatrização de feridas.

Avaliação da Cicatrização aguda de Feridas utilizando o Implante de Esponja de Álcool Subcutâneo Subcutâneo Dorsal e Modelos de Ferida de Cauda Excisional.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de cicatrização de feridas queimadas. Uma queimadura térmica foi induzida na pele dorsal de camundongos usando um modelo de latão pré-aquecido. Tecido queimado foi desbridado e sobreposto com um enxerto de pele colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Este protocolo descreve como gerar feridas excisionais bilaterais e de espessura total em camundongos e como monitorar, colher e preparar as feridas para análise morfométrica. Incluído é uma descrição aprofundada de como usar seções histológicas seriais para definir, quantificar e detectar defeitos morfométricos.

Modelo de cura da ferida excisional de Murine e Análise de Ferida Morfômica Histológica

É descrito um modelo de ferida na pele de rato que permite a avaliação de vários agentes terapêuticos sob condições fisiológicas ou patológicas ao longo das distintas etapas do processo de cicatrização. Além disso, é detalhado um protocolo para realizar planimetria manual e monitorar a taxa de contração da ferida durante o reparo tecidual.

Um Modelo de Ferida Cirúrgica de Pele de Rato: Uma Abordagem para Estudos de Cicatrização de Feridas e Avaliação de Biomateriais

Aprenda um protocolo ex vivo de ferimento cutâneo humano para avaliar reparo tecidual com alta precisão. Este método permite quantificar a reepitelização em amostras de pele saudável e diabética, oferecendo uma plataforma pré-clínica valiosa para testar terapias de cicatrização.

Modelo de ferida ex vivo humana e abordagem de coloração de montagem inteira para avaliar com precisão o reparo da pele

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