Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional
25 de dezembro de 2021
Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.
A metástase é uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer. Esse fenômeno ocorre quando as células cancerígenas se desprendem do tumor primário, entram na circulação sanguínea para finalmente atingir um órgão alvo distante. Uma vez que essas células separadas vão para o sangue, nós as chamamos de células tumorais secundárias.
Eles representam um material variável porque, por um lado, eles são os principais culpados da formação de metástase e, por outro lado, são mais fáceis do que biópsias tumorais. Na verdade, eles podem ser coletados por uma simples punção sanguínea. Apesar do baixo número dessas células na amostra de sangue, somos os primeiros a estabelecer várias linhas de células tumorais circulantes do sangue do paciente com maior preocupação usando a condição controlada em 3D.
Esta linha celular pode ser usada em qualquer linha de células comerciais para experimentos de rotina. Por exemplo, para a triagem genética de medicamentos, para proteína de interesse, mas também para o experimento in vivo para testar a capacidade de iniciação do tumor e seu potencial metastático. CTC, circulando linhas de células tumorais, deve ser cultivado em condições 3D em hipóxia.
Uma vez que o CTC tenha formado esferas, podemos colocá-la no meio e centrífugar-a por cinco minutos a 300 RCF. Descarte o supernatante e adicione 500 microliters de Accumax. Suspendemos um e incubamos a solução 20 minutos a 37 graus.
Em seguida, lave esferas dissociadas com PBS e pelota as células. Resuspenque a pelota com um DMEM/F12 recém-suplementado e veja as células na densidade de cinco células por microliter em uma nova placa de 24 Low Attachment. As esferas de CTCs de centrifugação eliminam o supernasce e lavam a pelota duas vezes com PBS.
A 500 microliter de PFE misture bem e incuba o tubo no gelo por 20 minutos. Em seguida, centrifugar as esferas fixas e lavar a pelota duas vezes com PBS, eliminando o volume máximo de PBS e adicionar 20 microliter de HistoGel formado. Leve-o para a suspensão e faça uma gota no vaso de cultura, deixe-o secar por 10 minutos e desprender-o usando um bisturi.
Agora você pode processar para qualquer desejado, a fim de CTCs visando uma proteína desejada de interesse. Coletar CTCs e desassociar as esferas com a Accumax como descrito anteriormente. Elimine o Accumax e resuspenja a pelota com três mL de tampão de bloqueio e transfira a suspensão através de um coador de células de 14 micrômetros para obter uma solução celular única.
Conte as células e envie em tubos e adicione um volume de 200.000 células, centrifugue os tubos e descarte o sobrenante. De acordo com a folha de dados de anticorpos, adicione em um tubo, o volume desejado do anticorpo e em outro tubo seu isótipo e continue os passos seguindo a orientação do fabricante. O tubo restante não será rotulado e o uso de um mercado de viabilidade é fortemente sugerido neste experimento.
No cítmetro, comece com o tubo não rotulado para definir a tensão na área negativamente rotulada. Depois disso, coloque o tubo de isótipo. O isótipo serviria como um controle negativo para distinguir entre o sinal positivo e o sinal não específico.
E termine o experimento com as células rotuladas com o anticorpo de interesse onde você deve ver uma mudança no portão rotulado positivamente, se a proteína de interesse for expressa. Isso suspende ctcs dissociados em meio suplementado na densidade de 200.000 células por mL. Em um ultra baixo acessório 96, placa bem, selar o volume de 50 microliter e incubar a placa 24 horas em hipóxia.
No dia seguinte, adicione 50 microliter de diferente concentração da droga testada e adicione o mesmo volume de DMEM/F12 apenas para determinar ainda mais a base de viabilidade celular e incubar a placa por mais 48 horas. No terceiro dia, reconstitua o agente e adicione 70 microliter da mistura em cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 20 minutos e, em seguida, meça a luminescência.
Este ensaio é uma ferramenta útil para testar um grande número de medicamentos, a fim de avaliar seus efeitos no crescimento celular do CTC. Em Eppendorf, células resuspend em 100 microliter de PBS beliscam a pele na parte de trás do mouse e inserem a agulha sob a pele. Injete lentamente todo o volume no mesmo local e monitore o crescimento do tumor a cada segundo dia e sacrifique os camundongos se o tumor excedesse um tamanho de 1,5 centímetros cúbicos.
Antes da cirurgia, injete subcutâneamente um analgésico, no lado ventral dorsal do camundongo, faça uma pequena incisão abaixo da 10ª costela. Levante suavemente o baço e coloque-o em uma gaze estéril. Usando uma seringa de insulina, injete 50 microliteres de CTCs resuspended em PBS e espere por três minutos sem remover a agulha.
Ligate o vaso arterial de um lado e o vaso venal do outro lado. Em seguida, remova o baço cortando diretamente acima das duas ligaduras. Costure o peritônio abdominal e a pele e desinfete bem a área.
O objetivo deste experimento é testar a capacidade de CTCs derivados de pacientes com câncer colorretal para colonizar o fígado induzindo a previsão metastática visível. Isolar e estabelecer a linha celular tumoral clínica é uma ferramenta emergente para estudos fundamentais e translacionais. Por exemplo, se você tem um gene de interesse onde os estudos in vivo demonstraram que esse gene está envolvido na migração e capacidade de invasão de linhas de células cancerígenas colorretais, derrubar esse gene em linhas de células tumorais circulantes antes da injeção no baço de camundongos, deixá-los colonizar o fígado pode ser uma boa ferramenta para confirmar seu resultado in vivo.
Para estudos translacionais, nossa principal perspectiva de isolar linhas de células tumorais circulantes é usar esse precioso material em medicina personalizada. A partir das amostras de sangue do paciente, isolaríamos e amplificamos CTCs na cultura por duas ou três semanas, a fim de ter material suficiente para examinar o painel de medicamentos que está disponível e avaliar sua citotoxicidade para finalmente atribuir
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Visão Geral
A metástase é uma das principais causas de mortalidade por câncer, e o entendimento de seus mecanismos é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos eficazes. Este artigo detalha protocolos para o isolamento, expansão e caracterização de linhagens de células tumorais circulantes (CTC) provenientes de pacientes com câncer colorretal metastático. Essas linhagens de CTC funcionam como modelos valiosos para estudos funcionais, triagem de fármacos e ensaios de metástase in vivo, apoiando tanto pesquisas fundamentais quanto abordagens de medicina personalizada.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do câncer
- Cultura celular
- Oncologia translacional
Antecedentes
- A metástase envolve células cancerosas se destacando do tumor primário, entrando na corrente sanguínea e colonizando órgãos distantes.
- As CTCs são raras, mas essenciais para a formação de metástases, e podem ser obtidas por meio de coletas sanguíneas minimamente invasivas.
- As biópsias tradicionais de tumor são invasivas e muitas vezes inacessíveis em estágios metastáticos.
- O estabelecimento de linhagens de CTCs permite análises moleculares e funcionais detalhadas.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer e expandir linhagens de CTCs de pacientes com câncer colorretal metastático.
- Fornecer protocolos para o cultivo, caracterização e testes funcionais de CTCs.
- Permitir testes de sensibilidade a medicamentos e modelagem de metástase in vivo utilizando CTCs derivadas de pacientes.
Métodos Utilizados
- Isolamento de CTCs de amostras de sangue de pacientes.
- Expansão de CTCs em cultivo tridimensional sob condições hipóxicas para formação de esferoides.
- Dissociação, fixação e imunomarcação de CTCs para análise de marcadores por citometria de fluxo.
- Ensaios de sensibilidade a fármacos utilizando medidas de viabilidade baseadas em luminiscência.
- Ensaios de iniciação tumoral e metástase in vivo por injeção subcutânea e esplênica de CTCs em camundongos imunodeficientes.
- Edição gênica de CTCs (por exemplo, shRNA, CRISPR/Cas9) para estudar a função gênica na metástase.
Resultados Principais
- Estabeleceram-se várias linhagens de CTCs a partir de pacientes com câncer colorretal metastático utilizando técnicas de cultivo 3D.
- As linhagens de CTCs podem ser caracterizadas quanto à expressão proteica por imunofluorescência e citometria de fluxo.
- Ensaios de triagem de fármacos permitem avaliar a sensibilidade das CTCs a quimioterápicos e agentes direcionados.
- Ensaios in vivo demonstram o potencial tumorigênico e metastático das CTCs, incluindo a colonização hepática após injeção esplênica.
- A edição gênica em CTCs viabiliza estudos funcionais de genes relacionados à metástase.
Conclusões
- As linhagens de CTC são um recurso valioso tanto para a pesquisa básica quanto translacional em câncer.
- Elas facilitam a medicina personalizada ao permitir testes de sensibilidade a medicamentos em células metastáticas derivadas de pacientes.
- Esses protocolos apoiam estudos mecanicistas da metástase e o desenvolvimento de terapias direcionadas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Linhas de células tumorais circulantes (CTC) derivadas de pacientes com câncer colorretal metastático fornecem uma plataforma transformadora para investigar mecanismos metastáticos e resposta a medicamentos em um contexto clinicamente relevante. Esses modelos derivados de pacientes permitem confiança preditiva na validação de alvos e na triagem terapêutica, abordando diretamente a lacuna translacional entre a descoberta e a aplicação clínica. Sua integração em fluxos de pesquisa e desenvolvimento apoia a tomada de decisões ajustada ao risco e a priorização de portfólios para terapêuticas contra câncer metastático.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a validação funcional de genes relacionados à metástase por meio de edição gênica e modelagem in vivo.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao permitir a avaliação direta da função gênica na disseminação metastática.
- Facilita a elucidação de vias ao caracterizar a expressão de marcadores em células tumorais circulantes utilizando imunofluorescência e citometria.
- Oferece confiança preditiva na seleção de alvos ao modelar in vivo a iniciação tumoral e o potencial metastático.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece sistemas celulares robustos derivados de pacientes para triagem de sensibilidade a fármacos com alto conteúdo informativo.
- Permite ensaios quantitativos de viabilidade para avaliar a citotoxicidade de quimioterápicos e agentes direcionados.
- Apóia a reprodutibilidade e padronização de ensaios por meio de culturas tridimensionais controladas e condições hipóxicas.
- Prepara linhagens validadas de CTCs para avaliação escalonável de compostos e fluxos de trabalho translacionais subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos pré-clínicos à biologia metastática relevante para a doença, melhorando a continuidade translacional.
- Permite a avaliação in vivo da colonização metastática, como metástase hepática, utilizando CTCs derivadas de pacientes.
- Apóia a estratificação orientada por biomarcadores e abordagens de medicina personalizada ao associar a resposta ao fármaco a perfis de CTCs específicos do paciente.
- Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo evidência funcional da eficácia terapêutica em contextos metastáticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O estabelecimento e a caracterização de linhagens de CTC conectam a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a validação pré-clínica, permitindo uma integração contínua ao longo do continuum de P&D em oncologia.
- Biologia da Descoberta: Fornece uma plataforma para testes de hipóteses e estudos mecanicistas de fatores que impulsionam a metástase.
- Triagem: Fornece modelos derivados de pacientes prontos para ensaios, permitindo testes reprodutíveis de sensibilidade a fármacos.
- Análises: Gera leituras quantitativas da expressão de marcadores e viabilidade celular, apoiando análises comparativas.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro ao comportamento metastático in vivo, aumentando o valor preditivo para a translação clínica.
- Reutilização Empresarial: Oferece um recurso reutilizável e escalonável para iniciativas contínuas de validação de alvos e triagem terapêutica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa sobre câncer metastático.
- Valor Operacional: Padroniza fluxos de trabalho para o isolamento, expansão e testes funcionais de CTCs.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e a alocação de capital ao fornecer dados de eficácia clinicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de programas de câncer metastático com base na validação funcional.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular tridimensional, citometria de fluxo e modelagem in vivo.
- Exige acesso a instrumentação especializada para cultura em condições hipóxicas e ensaios de viabilidade baseados em luminescência.
- Necessita padronização entre equipes para protocolos reprodutíveis de isolamento e caracterização de CTCs.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de câncer ou amostras derivadas de pacientes.
- Limitado pela raridade das CTCs e pela variabilidade na qualidade das amostras dos pacientes.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:07
Introduction
1:17
CTC Amplification in 3D Culture Conditions
2:01
Immuno-Fluorescence Staining on CTC Sphere Sections
2:41
Results: Immuno-Fluorescence Staining on CTC Sphere Sections
2:52
Cytometry Analysis
3:50
Results: Cytometry Analysis
4:13
Luminescence Visability Assay
5:05
Results: Luminescence Visability Assay
5:14
Subcutaneous Injections
5:32
Results: Subcutaneous Injections
5:42
Intrasplenic Injection
6:27
Results: Intrasplenic Injection
6:42
Conclusion
