Name: Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a identificar proteínas-alvo de mensageiros secundários nucleotídeos em Escherichia coli usando o ensaio DRaCALA. Este método rápido e sensível permite a descoberta sistemática de interações proteína-ligante em biologia de sistemas bacteriana.

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O trabalho é apoiado por um NNF Project Grant (NNF19OC0058331) para a YEZ, e o programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie (Nº 801199) à MLS.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. Preparação de lises celulares inteiras
<ol><li>Inocular a coleção E. coli K-12 ASKA ORFeome estica15 em 1,5 mL Caldo de Lysogeny (LB) contendo 25 μg/mL chloramphenicol em placas de poços profundos de 96. Cresça durante a noite (O/N) por 18 h a 30 °C com agitação a 160 rpm. No dia seguinte, adicione isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final de 0,5 mM) às culturas O/N para induzir expressão proteica a 30 °C por 6 h.</li>
	<li>Células de pelota a 500 x g por 10 min. Congele as pelotas a -80 °C até usar. Para lise as células, adicione 150 μL de tampão de lise L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, suplementado com fluoreto de fenilmetilsulfonyl de 2 mM (PMSF), 40 μg/mL DNase 1 e 0,5 mg/mL de lysozime) para ressususpensar a pelota.</li>
	<li>Congele as células a -80 °C por 30 min e descongele a 37 °C por 20 min. Repita este ciclo três vezes para lise as células. Armazene as lises a -80 °C antes de usar.</li>
</ol>2. Purificação de Relseq e GppA
NOTA: As proteínas recombinantes Relseq de Streptococcus equisimilis e GppA de E. coli K-12 são usadas para sintetizar o pppGpp radiolabeled e ppGpp, respectivamente.
<ol><li>Crescer e coletar células superexpressando cada proteína.<ol>
<li>Cresça a cepa E. coli BL21 DE3 até a fase exponencial (densidade óptica (OD) ~0,3-0,4) em caldo LB, e gire 1 mL de cultura a 6000 x g por 5 min. Decante o supernascimento, e resuspenja as células com 100 μL de caldo TSB gelado (caldo LB suplementado com 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/meL dimetilsulfoxida, 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Misture os plasmídeos com o relseq e gppAmarcados por histidina, cada 100 ng, com as suspensões celulares acima em TSB, e incubar no gelo por 30 minutos. Choque térmico das células a 42 °C para 40 s. Coloque a mistura no gelo por 2 min, e adicione 1 mL de caldo LB à temperatura ambiente para permitir que as células se recuperem por 1h a 37 °C com agitação a 160 rpm.</li>
		<li>Placa as células recuperadas em placas de ágar LB suplementadas com os antibióticos correspondentes (Relseq:100 μg/mL ampicillin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). No dia seguinte, inocular as colônias em caldo LB para iniciar as pré-culturas O/N de ambas as cepas a 37 °C.</li>
		<li>Após 18 h, inocular 500 mL de meio LB com 10 mL das culturas O/N e os antibióticos correspondentes. Cresça as culturas agitando a 160 rpm a 37 °C. Quando o OD600nm atingir 0,5-0,7, induzir expressão proteica adicionando 0,5 mM IPTG e crescendo por 3h a 30 °C com agitação a 160 rpm.</li>
		<li>Colete as células girando a 6084 x g por 10 min a 4 °C. Resuspense a pelota em 20 mL de salina tamponada de fosfato de 1x (PBS) e re-centrífuga a 1912 x g por 20 min a 4 °C. Decante o supernatante e congele as pelotas a -20 °C antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificação de afinidade do ácido nitrilotriactico de níquel (Ni-NTA) NOTA: A partir deste ponto, certifique-se de que as amostras estão frias.<ol>
<li>Adicione 40 mL de tampão de lise gelada L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoetanol complementado com inibidores de protease (comprimido livre de EDTA; ver a Tabela de Materiais) para resuspensar a pelota. Lise as células através de sônica (60% de amplitude, 2 s ON/ 4 s OFF por 8 min ON). Limpe o lise girando a 23.426 x g por 40 min a 4 °C, e continue com o sobrenatante para a purificação.</li>
		<li>Durante a centrifugação acima, prepare a resina Ni-NTA.<ol>
<li>Transfira 500 μL de resina Ni-NTA homogeneizada para uma coluna de cromatografia de polipropileno em pé, e deixe-a se contentar com 15 minutos e a solução de armazenamento escorra. Lave a resina com 15 mL de água ultrauso duas vezes e depois lave a coluna com 15 mL do tampão de lise L2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carregue o supernanato limpo de lise celular do passo 1 para a coluna, e deixe-o fluir. Lave a coluna com 30 mL de tampão de lavagem (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 20 mM imidazole).</li>
		<li>Elute as proteínas com 400 μL do tampão de eluição (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5% glicerol, 500 mM imidazol) três vezes. Em seguida, repita a elução com outros 300 μL do buffer de eluição. Combine as proteínas elucidas a um volume final de 700 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtragem de gel<ol>
<li>Prepare o tampão de filtragem de gel (50 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol). Lave a coluna de exclusão de tamanho com um volume de coluna (25 mL) do tampão de filtragem de gel.</li>
		<li>Carregue a amostra acima de 700 μL usando um loop de 500 μL, execute a 0,5 mL/min e colete 2-3 frações, cada uma de 0,5 mL de volume, contendo as respectivas proteínas.</li>
		<li>Combine e concentre as frações que contêm cada uma das proteínas usando uma coluna de spin, e meça a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Síntese de PPPGpp e ppGpp com etiqueta em P de 32P
<ol><li>Monte uma reação relseq em pequena escala em um tubo de tampa de parafuso (ver Tabela 1). NOTA: Trabalhe com reagentes radioativos apenas em local licenciado e com equipamento de proteção individual.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Pequena escala</td>
			<td>Grande escala</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água ultrapura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq buffer*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (final de 8 mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Relseq (4 μM final)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 Triptofato P-α-Guanosine (GTP) (final 120 nM) (ATENÇÃO)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: A montagem de informações para as reações de síntese de pequena e grande escala de pppGpp. *10x Relseq buffer contém 250 mM Tris-HCl, pH 8.6; 1M NaCl; 80 mM MgCl2. Abreviação: pppGpp = pentafosfato de guanosina.
<ol start="2"><li>Incubar o tubo a 37 °C em um termomixer por 1h, depois a 95 °C por 5 min, e coloque no gelo por 5 min. Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante (sintetizado 32P-pppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.</li>
	<li>Para sintetizar 32P-ppGpp de 32P-pppGpp, transfira metade do produto 32p-pppGpp para um novo tubo de tampa de parafuso e adicione 1 μM GppA. Incubar o tubo a 37 °C por 10 min, a 95 °C por 5 min, e depois coloque no gelo por 5 minutos.</li>
	<li>Gire a proteína precipitada a 15.700 x g por 5 min, e transfira o supernante (sintetizado 32P-ppGpp) para um novo tubo de tampa de parafuso.</li>
	<li>Analise a placa de 32P-pppGpp e 32P-ppGpp executando 1 μL das amostras em uma placa de cromatografia de camada fina (TLC) (placas TLC modificadas por polietileneimina) utilizando as placas TLC 1,5 M KH2PO4, pH 3.4, como fase móvel. NOTA: Use o α-32P-rotulado guanosina 5'-triphosphate (32P-α-GTP) como controle.</li>
	<li>Seque completamente a placa TLC, coloque-a entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize e quantifique os sinais usando um fósforo. NOTA: Quando as proporções de 32P-pppGpp e 32P-ppGpp forem superiores a 85%, uma reação em larga escala (500 μL, suficiente para triagem de 20 placas de 96 poços) pode ser montada e sintetizada usando a Tabela 1.</li>
</ol>4. Triagem DRaCALA das proteínas-alvo de (p)ppGpp
<ol><li>Descongele e transfira 20 μL de lises celulares inteiras para uma placa de microtiter fundo V de 96 poços. Adicione 2,5 U/poço de endonuclease de Serratia marcescens, e incubar a 37 °C por 15 min para reduzir a viscosidade lysate. Coloque os lises no gelo por 20 minutos.</li>
	<li>Misture o tampão de 32P-pppGpp e 32P-ppGpp em uma proporção de 1:1, e adicione 1x tampão de lise L1 para tornar a concentração final de (p)ppGpp igual a 4 nM. NOTA: Dada a similaridade química entre o pppGpp e o ppGpp, uma mistura de ambos os produtos químicos simplificará o processo de triagem.</li>
	<li>Use uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas para adicionar e misturar 10 μL da mistura (p)ppGpp com o lise celular. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 5 min.</li>
	<li>Lave a ferramenta de 96 x pino colocando em 0,01% a solução de detergente não iônico para 30 s e seque em um papel de tecido para 30 s. Repita a lavagem da ferramenta do pino 3x.</li>
	<li>Coloque a ferramenta de pinos nas placas de amostra acima de 96 poços e espere por 30 s. Levante a ferramenta do pino para cima e coloque-a em linha reta para baixo em uma membrana de nitrocelulose por 30 s. NOTA: Se faltar uma mancha, local 2 μL das amostras correspondentes com uma pipeta e pontas filtradas. É aconselhável fazer um ponto duplicado da mesma amostra que indicado abaixo.</li>
	<li>Seque a membrana por 5 minutos no RT. Coloque a membrana entre uma pasta de plástico transparente e exponha-a a uma tela de fósforo de armazenamento por 5 minutos. Visualize usando um fósforo.</li>
</ol>5. Quantificação e identificação de potenciais proteínas-alvo
<ol><li>Use o software de análise associado ao fosforrimager para abrir o arquivo .gel das placas visualizadas. Use a função de análise Array para definir os 96 pontos configurando uma grade de 12 colunas x 8 linhas.</li>
	<li>Defina círculos grandes para circunscrever a borda externa de todos os pontos (ver Figura 1B). Exporte o Volumn+Background e Área dos grandes círculos definidos e economize em uma planilha. NOTA: Se necessário, reposicione cada círculo individual para se sobrepor perfeitamente com as manchas e redimensione cada círculo individual para torná-lo ligeiramente maior do que o local real.</li>
	<li>Dimensione os círculos definidos para circunscrever os pequenos pontos internos. Exporte o Volumn+Backgrounde Área dos pequenos círculos definidos e economize em uma planilha.</li>
	<li>Calcule as frações de vinculação na planilha usando a equação na Figura 1Be plote os dados. Identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> Figura 2: Fluxo de trabalho global do processo de triagem DRaCALA. A produção de proteínas de uma coleção Escherichia coli ASKA é induzida, e as células são lístidas. Enquanto isso, as proteínas recombinantes Relseq-His e GppA-His são purificadas e usadas para sintetizar pppGpp e ppGpp de 32P-α-GTP. As moléculas de ppGpp radioativamente rotuladas (p)ppGpp são então misturadas com os lises, e uma ferramenta de 96 pinos é usada para detectar as misturas em uma membrana nitrocelulose para posterior exposição a uma tela de armazenamento de fósforo, imagem e quantificação dos sinais radioativos. Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente; IPTG = isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside; GTP = guanosina 5'-triphosfato; SDS-PAGE = eletroforese de gel de dodecylsulfato-poliacrilamida de sódio ; TLC = cromatografia de camada fina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.

Uma das etapas críticas na realização da triagem DRaCALA é obter bons lises celulares inteiras. Em primeiro lugar, as proteínas testadas devem ser produzidas em grandes quantidades e em formas solúveis. Em segundo lugar, a lise das células deve estar completa, e a viscosidade do lysate deve ser mínima. A inclusão da lise e o uso de três ciclos de congelamento são muitas vezes suficientes para lise completamente as células. No entanto, o DNA cromossômico liberado torna o viscoso lísato e gera alto sinal de ligação de fund...

As bactérias usam várias pequenas moléculas de sinalização para se adaptar em ambientes em constante mudança1,2. Por exemplo, os autoindutores, N-acylhomoserine lactones e seus oligopeptídeos modificados, mediam a comunicação intercelular entre bactérias para coordenar o comportamento populacional, um fenômeno conhecido como quórum sensoriando2. Outro grupo de pequenas moléculas de sinalização são os NSMs, incluindo o monofosfato de adenosina cíclica amplamente estudado (cAMP), di-AMP cíclico, monofosfato de di-guanosina cíclico (di-GMP cíclico), e penta-e tetra fosfatos (p)ppGpp1. As bactérias produzem esses NSMs como resposta a uma variedade de diferentes condições de estresse. Uma vez produzidas, essas moléculas se ligam às suas proteínas-alvo e regulam várias vias fisiológicas e metabólicas diferentes para lidar com as tensões encontradas e aumentar a sobrevivência bacteriana. Portanto, a identificação das proteínas alvo é um pré-requisito inevitável para decifrar as funções moleculares dessas pequenas moléculas.
A última década testemunhou um boom de conhecimento dessas pequenas moléculas de sinalização, principalmente devido a várias inovações técnicas que revelaram as proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Estes incluem a técnica do composto de captura3,4,5, e a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligantes (DRaCALA)6 a ser discutido neste artigo.
Inventado por Vincent Lee e colegas de trabalho em 20116,o DRaCALA implanta a capacidade de uma membrana nitrocelulose para sequestrar diferencialmente ligantes livres e ligados à proteína. Moléculas como proteínas não podem se difundir em uma membrana de nitrocelulose, enquanto pequenos ligantes, como os NSMs, são capazes de. Ao misturar o NSM (por exemplo,ppGpp) com a proteína a ser testada e localizá-las na membrana, dois cenários podem ser esperados (Figura 1): Se (p)ppGpp se ligar à proteína, o radiolabeled (p)ppGpp será mantido no centro do local pela proteína e não se difundirá para fora, dando um pequeno ponto intenso (i.e., forte sinal radioativo) sob um fosforrimager. No entanto, se (p)ppGpp não se ligar à proteína, ele irá difundir livremente para fora para produzir um grande ponto com sinal radioativo de fundo uniforme.
Além disso, o DRaCALA pode detectar a interação entre uma pequena molécula e uma proteína não purificada em uma célula inteira lysate se a proteína estiver presente em uma quantidade suficiente. Essa simplicidade permite o uso de DRaCALA na identificação rápida de alvos proteicos usando uma biblioteca de expressão ORFeome. De fato, as proteínas-alvo de cAMP7,cíclico di-AMP8,di-GMPciclic 9,10e (p)ppGpp11,12,13 foram sistematicamente identificadas pelo uso de DRaCALA. Este artigo de vídeo usa (p)ppGpp como um exemplo para demonstrar e descrever as etapas e considerações críticas na realização de uma triagem DRaCALA bem sucedida. Note-se que uma descrição mais completa do DRaCALA14 é altamente recomendada para ler em combinação com este artigo antes de realizar o DRaCALA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> Figura 1: O princípio da DRaCALA. (A) Esquema do ensaio DRaCALA. Consulte o texto para obter detalhes. (B) Quantificação e cálculo da fração vinculante. Consulte o texto para obter detalhes. Resumidamente, as manchas DRaCALA serão analisadas desenhando dois círculos que circunscrevem todo o local e o ponto escuro interno (ou seja,o retido (p)ppGpp devido à ligação da proteína testada). O sinal de ligação específico é o sinal radioativo do círculo interno (S1) após subtrair o sinal de fundo não específico (calculado por A1 × ((S2-S1)/(A2-A1)). A fração de ligação é o sinal de ligação específico dividido pelo sinal radioativo total (S2). Abreviaturas: DRaCALA = Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante; p)ppGpp = penta e tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x ferramenta de pino</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 Bolt Replicator, em centros de 9 mm, diâmetro do parafuso de 4,2 mm, 24 mm</td></tr><tr><td>de comprimento Placa de microtitulação de fundo em V de 96 poços</td><td>Esterilização</td><td>MIC9004</td><td>Microplaca de esterilização V Well 611V96</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Ágar nº 1</td></tr><tr><td>Cepa de coleção ASKA</td><td>NBRP, SHIGEN, JAPÃO</td><td></td><td>Ref: DNA Research, Volume 12, Edição 5, 2005, páginas 291-299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>endonuclease geneticamente modificada de Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Reagent Concentrate</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge; 99,9%</td></tr> <tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>gel filtration10x300 coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>contém 20% de etanol como conservante</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>Glicerol 87% para análise</td></tr><tr><td>Hypercassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &ge; 99,5% (GC)</td></tr><tr><td>Tela de Fósforo de Armazenamento IP</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td> Caldo de Lisogenia <td>Isopropila &beta;-D-tiogalactosídeo</td></tr><tr><td>(LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>Base de</td><td>Caldo LB de 12795027 Miller</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>de clara de ovo de galinha; BioUltra, pó liofilizado, &ge; 98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (Cloreto de magnésio)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ água</td><td></td><td></td><td>água ultrapura</td></tr> pipeta <tr><td>multicanal</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - Ponta de clipe; 1-10 ul, 8 x canais</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de Nitrocelulose</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0,45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Solução salina tamponada com fosfato (Dulbecco A), Comprimidos</td></tr><tr><td>PEG3350 (Polietilenoglicol 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>Solução de fluoreto de fenilmetanossulfonilo - 0,1 M em etanol (T)</td></tr><tr><td>Gerador de imagens de fósforo</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 Pontas de pipeta de imagens de fósforo</td></tr><tr><td>, filtradas</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &mu; l coluna de</td></tr><tr><td>cromatografia Poly-Prep</td> não estéril <td>Coluna de cromatografia de polipropileno</td><td>7311550 Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>Comprimidos, tubo com tampa de rosca sem EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Tubos Microcentifuge, 2,0 ml com tampa de rosca, não estéril</td></tr><tr><td>SLS 96 de profundidade Placas de poço</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, Fundo em V,</td></tr><tr><td>coluna de centrifugação</td> natural <td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0,5 ml Filtros centrífugos</td></tr><tr><td>Termomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Thermomixer C</td></tr><tr><td>Placa TLC (placas PEI-celulose F TLC)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-celulose F (20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>Base Tris para Biologia Molecular</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>detergente viscoso não iônico</td></tr> <tr><td>e beta-mercaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC / titulação)</td></tr></tbody></table>

identificação das proteínas de ligação de pequenos ligantes com a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligand (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

A última década teve um tremendo progresso na compreensão de pequenas moléculas de sinalização na fisiologia bacteriana. Em particular, as proteínas-alvo de vários mensageiros secundários derivados de nucleotídeos (NSMs) têm sido sistematicamente identificadas e estudadas em organismos modelo. Essas conquistas se devem principalmente ao desenvolvimento de várias novas técnicas, incluindo a técnica do composto de captura e a ação capilar radial diferencial do ensaio ligante (DRaCALA), que foram utilizadas para identificar sistematicamente proteínas-alvo dessas pequenas moléculas. Este artigo descreve o uso dos NSMs, guanosine penta e tetrafosfatos (p)ppGpp, como exemplo e demonstração de vídeo da técnica DRaCALA. Utilizando DRaCALA, 9 das 20 proteínas-alvo conhecidas e 12 novas proteínas-alvo de (p)ppGpp foram identificadas no organismo modelo, Escherichia coli K-12, demonstrando o poder deste ensaio. Em princípio, o DRaCALA poderia ser usado para estudar pequenos ligantes que podem ser rotulados por isótopos radioativos ou corantes fluorescentes. Os passos críticos, prós e contras do DRaCALA são discutidos aqui para posterior aplicação desta técnica.

Seguindo o protocolo acima descrito normalmente produzirá dois tipos de resultados (Figura 3).
A Figura 3A mostra uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos (frações de ligação &lt; 0,025) da maioria dos poços. O sinal de ligação positivo do poço H3 dá uma fração de ligação de ~0,35 que é muito maior do que a observada para os outros poços. Mesmo sem quantificação, bem H3 é notável, sugerindo que uma proteína alvo e...

A Ação Capilar De Ligania Diferencial do Ensaio de Ligamento (DRaCALA) pode ser usada para identificar pequenas proteínas de ligação de ligantes de um organismo usando uma biblioteca ORFeome.

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Pequenas moléculas de sinalização visam várias proteínas efeitos para controlar a virulência bacteriana e a biologia humana. No entanto, essas proteínas efeitos são desafiadoras de identificar. Como uma ferramenta de biologia de sistemas, o DRaCALA permite uma identificação viável, rápida e altamente sensível das proteínas efeitos ou efeitos desconhecidas usando uma biblioteca OVium.DRaCALA poderia ser usado para estudar qualquer pequena molécula de sinalização, desde que possa ser rotulada com isótopo radioativo ou corantes fluorescentes. Comece inoculando E.coli em 1,5 mililitros de LB suplementados com 25 microgramas por mililitro de clororamfenicol em cada poço de placas de poços de 96 poços profundos para uma incubação noturna a 30 graus Celsius e 160 rotações por minuto. Na manhã seguinte, trate as culturas durante a noite com 500 micromolar IPTG por seis horas a 30 graus Celsius para induzir a expressão proteica.No final da incubação, pelota as células por centrifugação, remova o supernante, e congele as amostras a menos 80 graus Celsius. Para iniciar a lise, resuspenja as pelotas em 150 microliters de tampão de lise um por poço para uma incubação de 30 minutos a menos 80 graus Celsius antes de descongelar as células por 20 minutos a 37 graus Celsius. O lysate deve então ser armazenado a menos 80 graus Celsius antes do uso.Para completar a lise das células com proteínas superexpressas, resuspende as amostras em 40 mililitros de tampão de lise gelada dois e sonicar as amostras a uma amplitude de 60% em dois segundos em quatro segundos de folga por oito minutos, depois limpe os lises por centrifugação. Enquanto as amostras estão sendo centrifugadas, adicione 500 microliters de resina de níquel-NTA homogeneizada a uma coluna de cromatografia de polipropileno em pé. Após 15 minutos, lave a resina assentada duas vezes com 15 mililitros de água ultrapura e uma vez com 15 mililitros de tampão de lise dois.No final da centrifugação, carregue o supernatante de lysate limpo na coluna. Quando todo o lise tiver fluído através da coluna, lave a coluna com 30 mililitros de tampão de lavagem. Para elutar as proteínas, adicione 400 microliter volume de tampão de eluição à coluna e repita a eluição três vezes.Mais 300 microlitrais do buffer de eluição para repetir a eluição três vezes e combinar as proteínas eludidas em um volume final de 700 microliters. Para filtragem de gel da amostra elucida, depois de lavar uma coluna de exclusão de tamanho com 25 mililitros de tampão de filtragem de gel recém-preparado, carregue todo o volume de proteína elucida na coluna usando um loop de 500 microliteres. Execute a 500 microliters por minuto e colete de duas a três frações de volume de 500 microliteres das respectivas proteínas.Em seguida, use colunas de spin individuais para concentrar cada proteína e use o kit de ensaio de Bradford para medir as concentrações proteicas de acordo com os protocolos padrão. Para sintetizar o pentafosfato de guanosina rotulado 32, monte uma reação relseq de pequena escala em um tubo tampado de parafuso como descrito na mesa e incubar a reação em um ThermoMixer por uma hora a 37 graus Celsius e cinco minutos a 95 graus Celsius, seguido por cinco minutos no gelo. No final das incubações, gire a proteína precipitada por centrifugação e transfira o fosforo sintetizado 32 rotulado pentafosfato de guanosina contendo supernasal a um novo tubo tampado para parafuso.Para a síntese de tetrafosfato de fósforo 32 guanosina, adicione um micromolar GppA à metade do produto de pentafosfato de guanosina rotulado 32 em um novo tubo tampado e incubar a reação por 10 minutos a 37 graus Celsius, cinco minutos a 95 graus Celsius e cinco minutos no gelo. No final da incubação, gire o precipitado por centrifugação e transfira o tetraforosfato de guanosina rotulado 32 contendo supernasal para um novo tubo. Para analisar as proteínas alvo isoladas, execute um microliter de cada amostra em uma placa de cromatografia de camada fina usando fosfato de monopotássio molar 1,5 como fase móvel.Após a análise, coloque a placa seca em uma pasta de plástico transparente e exponha a placa a uma tela de fósforo de armazenamento por cinco minutos antes de visualizar e quantificar os dados em um imager de fósforo. Para a triagem DRaCALA das proteínas-alvo, adicione 20 microlitadores dos lises por atacado descongelados a poços individuais de uma placa de microtiter fundo V de 95 poços e adicione 2,5 unidades de Serratia marcescens endonuclease a cada poço. Depois de 15 minutos a 37 graus Celsius, coloque os lises no gelo por 20 minutos.Em seguida, misture volumes iguais de fósforo 32 rotulados de pentafosfato de guanosina e tetrafosfato de guanosina e adicione 1X tampão de lise um à mistura para obter uma solução de pentafosfato de guanosina nanomolar. Usando uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas, misture 10 microliters da mistura de pentafosfato de guanosina com o linsato celular para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave uma ferramenta de pino 96X três vezes em uma solução de 0,01% de detergente não iônico por 30 segundos, seguido por 30 segundos de secagem em uma toalha de papel por lavagem antes de colocar a ferramenta de pino na placa de amostra de 96 poços.Após 30 segundos, levante a ferramenta do pino para cima e coloque-a em linha reta em uma membrana de nitrocelulose por 30 segundos. Após cinco minutos de secagem, coloque a membrana de nitrocelulose em uma pasta de plástico transparente para armazenamento de exposição da tela de fósforo e visualização por imagem fosfora, conforme demonstrado. Para quantificar e identificar potenciais proteínas-alvo, no software de análise associado ao imager fosforo, abra o arquivo em gel das placas visualizadas.Para definir os pontos a serem analisados, use a função de análise de matriz para configurar uma grade de 12 colunas por oito linhas. Para circunscrever a borda externa das manchas de orifício, defina grandes círculos, exporte o volume mais fundo e área dos círculos grandes definidos para uma planilha. Para circunscrever os pequenos pontos internos, dimensione os círculos definidos, exporte o volume mais fundo e área dos pequenos círculos definidos e salve todos os dados na planilha.Os círculos de posição se sobrepõem aos pontos conforme necessário, redimensionando os pontos ligeiramente maiores do que os reais. Use a equação para calcular as frações de vinculação na planilha e plotar os dados. Em seguida, identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.Nesta análise representativa, uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos na maioria dos poços pode ser observada. O sinal de ligação positivo no poço H3 exibiu uma fração de ligação muito maior do que a observada para os outros poços devido à superexpressão da proteína de ligação de pentafosfato guanosina Hpt. Nas placas representativas, vários poços apresentaram sinais de ligação de fundo relativamente mais elevados, como indicado pelos pontos internos relativamente fortes observados em muitos poços, bem como as frações de ligação consistentemente altas observadas após a quantificação.Notavelmente, alguns alvos também deram frações de vinculação variável, como os falsos positivos. Para esclarecer melhor, os pesquisadores usaram proteínas purificadas para testar a ligação novamente. Uma vez identificadas as proteínas-alvo, pode-se purificá-las à homogeneidade e confirmar a força e a especificidade da interação usando dRaCALA, calorimetria de titulação isotemal, ou outros métodos.Identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas de sinalização abre caminho para uma compreensão aprofundada dos papéis emergentes da virulência bacteriana à biologia humana.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve o método para analisar a interação proteína-ligante por eletroforese capilar de afinidade de mudança de mobilidade. Este método pode ser usado para caracterizar o comportamento de ligação de uma proteína com vários ligantes carregados.

Eletroforese capilar de afinidade por deslocamento de mobilidade: um método para analisar as interações amostra-ligante dependendo da migração diferencial de complexos proteína-ligante

Este vídeo demonstra a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligante - uma técnica para triagem sistemática de alto rendimento de proteínas de ligação ao segundo mensageiro de nucleotídeos intracelulares. Essa técnica permite a ligação direta dos mensageiros à proteína-alvo superexpressa no lisado celular - ignorando a necessidade de purificação de proteínas.

Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante: Uma Técnica de Alto Rendimento para Identificar Proteínas Intracelulares de Ligação ao Segundo Mensageiro de Nucleotídeos Bacterianos

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

A fluorimetria de varredura diferencial é um método amplamente utilizado para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas para interações com proteínas. Aqui, apresentamos um método simples para estender essas análises para fornecer uma estimativa da constante de dissociação entre uma pequena molécula e seu parceiro proteico.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Os protocolos apresentados descrevem duas técnicas baseadas em ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA) para a investigação rápida de interações ligante-receptor: O primeiro ensaio permite a determinação da constante de dissociação entre ligante e receptor. O segundo ensaio permite uma triagem rápida de peptídeos bloqueadores para interações ligante-receptor.

Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

O protocolo aqui descreve as interações da proteína de canal de íon hEAG1 purificado com a pequena molécula lipídica ligante fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP2). A medida demonstra que BLI poderia ser um método potencial para rastreio de ligante de canal novela pequena molécula íon.

Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

Um protocolo detalhado para executar uma titulação ELISA é descrito. Além disso, um algoritmo de romance é apresentado para avaliar a titulação ELISAs e obter uma constante de dissociação de ligação de um ligante solúvel a um receptor de imobilizado-placa de microtitulação.

Titulação ELISA como um método para determinar a constante de dissociação de interação do ligante do Receptor

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Aprenda a identificar proteínas-alvo de mensageiros secundários nucleotídeos em Escherichia coli usando o ensaio DRaCALA. Este método rápido e sensível permite a descoberta sistemática de interações proteína-ligante em biologia de sistemas bacteriana.

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

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