Name: 극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 극저온 전자 단층 촬영을 위한 유리체 라멜라 준비 방법을 Plasmodium falciparum 감염 적혈구에서. 이 기술은 말라리아 기생충의 고해상도 구조 분석과 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 Wellcome Trust(212916/Z/18/Z)의 전체 또는 일부 자금 지원을 받았습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출로 인해 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY 공개 저작권 라이선스를 적용했습니다.
이 방법이 개발된 이 프로젝트는 Helen R. Saibil, Roland A. Fleck 및 Michael J. Blackman에게 수여된 의학 연구 위원회 보조금 MR/P010288/1의 자금 지원을 받았습니다. P. falciparum 의 문화는 Michael J. Blackman 그룹 구성원의 지원을 받아 Francis Crick Institute에서 재배되었습니다. 저자는 얇은 혈액 도말에서 화합물 2 및 E64 처리 분열증의 이미지를 제공한 Ser Ying (Michele) Tan 박사에게 감사를 표합니다. 대부분의 라멜라는 eBIC 직원의 지원으로 생산되었으며 연구 제안 NT21004에서 Scios 이중 빔 cryoFIB-SEM에 액세스해 주셔서 감사합니다. 저자는 또한 CUI 내에서 FIB 밀링 기술의 개발을 계속하는 데 있어 Royal Society Industry Fellowship 계획(INF\R2\202061)의 지원을 인정합니다. 저자는 또한 이 방법 논문과 관련하여 유용한 토론을 하고 프로젝트를 감독한 Helen R. Saibil에게 감사를 표합니다.

인간 혈액은 영국 국립 혈액 및 이식 서비스를 통해 익명의 기증자로부터 채취했으며 수령 후 2주 이내에 사용됩니다. 사용에 대한 윤리적 승인이 필요하지 않습니다.
1. Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구의 준비 및 급락 동결
<ol><li>70%(v/v) 등장 밀도 구배 배지에서 원심분리(1,580 x g)로 성숙한 분열증을 분리합니다(인간 적혈구에서 3D7 Plasmodium falciparum 의 무성 혈액 단계를 배양하는 방법에 대한 표준 절차는 Blackman MJ, 1995,37 참조).</li>
	<li>공기 건조된 얇은 혈액 필름을 100% 메탄올로 유리 슬라이드에 고정하여 6.7 mM 인산염 완충액, pH 7.1에서 10% 김사 염색으로 염색하기 전에 분열증의 형태학적 균질성을 확인하였다. 참고: 특정 출구 지점에서 지연된 분열증에 대한 준비를 풍부하게 하기 위해 분열증은 화합물 2 및 E64 억제제와 추가로 동기화될 수 있습니다(이러한 억제제의 효과에 대한 설명은 대표 결과 및 그림 1 참조). 주의: Plasmodium falciparum 은 인간 병원체이며 지역 보건 및 안전 지침에 따라 적절한 격리 시설에서만 취급해야 합니다.</li>
	<li>분열증을 부드럽게 원심분리하여(240 x g) 펠릿화하고 RPMI 배지의 세포 펠릿의 2배 부피에 재현탁하여 50% 헤마토크릿 현탁액을 생성합니다.</li>
	<li>수동 플런지 동결 장비에서 글로우 방전의 탄소 쪽에 2.5μL의 분열증을 적용합니다(60초, 공기 중 30mA의 글로우 방전 장치 설정 사용, 그리드의 탄소 면만 처리) 200/2 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 4메쉬 구리 그리드 가장자리가 찢어진 등급 1 여과지를 사용하여 그리드 뒷면에서 ~20초 동안 블롯합니다. 액체 질소 냉각 액체 에탄에 뛰어 들어 그리드를 저장소로 옮깁니다 (이 연구에 사용 된 장비에 대한 재료 표 참조). 참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있으며 그리드를 액체 질소 아래에 무기한 저장할 수 있습니다. 주의 : 액체 질소는 질식하며 동상을 유발합니다. 산소 모니터링이 있는 적절한 환경에서 주의해서 다루십시오. 주의 : 액체 에탄은 심한 화상을 일으키고 가연성입니다. 발화원에서 멀리 떨어진 흄 후드에서 사용하십시오. 알림: 급락 냉동 분열증은 더 이상 실행 가능하지 않습니다. 이것은 공기 해동 된 급지 냉동 분열증의 여러 금 그리드로 인간의 혈액을 배양하고 냉동되지 않은 대조군과 비교하여 며칠 후에 기생충 성장을 관찰하지 않음으로써 결정되었습니다. 따라서 schizonts의 냉동 그리드는 일반적인 안전 및 오염 제거 절차 (장갑, >70 % 에탄올로 표면 / 도구 멸균 및 >70 % 에탄올로 그리드 처리)를 사용하여 격리 시설 외부에서 안전하게 처리 할 수 있습니다.</li>
	<li>광학 현미경을 위해 극저온 스테이지를 사용하여 그리드를 스크린하고 그리드를 가로지르는 얼음의 구배에 특히 주의를 기울입니다. 얼음의 얇은 영역에서는 셀 범위에 대해 개별 그리드 사각형을 확인하십시오. 참고: 가장 적합한 정사각형은 격자 정사각형의 중심에 있는 한 셀 두께여야 합니다(그림 2). 이렇게 하면 격자 막대에 대한 가장자리의 두꺼운 얼음에 부딪히지 않고 사각형 중앙을 가로질러 라멜라를 밀링할 수 있습니다. 여기서 실험을 일시 중지할 수 있으며 그리드를 액체 질소에 무기한 저장할 수 있습니다. 세포에 형광 마커가 있는 경우 cryoCLEM으로 그리드를 스크리닝하여 관심 있는 X/Y 위치를 찾을 수 있으며, 이는 cryoFIB-SEM의 그리드 위치와 상관관계를 파악하여 직접 밀링할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 플런지 냉동 세포의 그리드 FIB 밀링
<ol><li>CryoFIB 전용 오토그리드 림의 전면을 지워지지 않는 검은색 마커 펜으로 표시하여 컷어웨이 섹션의 중심과 림의 반대쪽을 나타냅니다(그림 3). 클리핑 스테이션을 설정하고 그리드를 표시된 링 카본 면이 아래로 향하도록 합니다.</li>
	<li>그리드를 cryoFIB-SEM 셔틀(셔틀에 따라 일반적으로 2개의 그리드) 탄소 면이 위로 향하게 하고 아르곤 분위기(5 x 10-2mbar)(60초 동안 5mA - 두께는 가변적임)에서 백금 스퍼터 코팅을 적용하거나 탄소/백금 전자빔 회전 코팅(~4nm 두께)을 셀 표면에 적용합니다. 참고: 두 가지 유형의 코팅 모두 SEM 이미징 중에 전하 분산을 돕습니다. e-빔 로터리 코터의 장점은 코팅의 정확한 두께를 지정할 수 있다는 것입니다.</li>
	<li>셔틀을 cryoFIB-SEM에 로드하고 5kV(13pA 또는 25pA)에서 SEM으로 각 그리드의 세포 분포를 평가합니다. 저배율 개요(~100x)를 사용하여 그리드 전체의 얼음 그라데이션을 확인합니다. 그런 다음 고배율(~5,000x) 이미지를 촬영하여 개별 그리드 사각형을 보고 밀링할 수 있는 가시적인 세포 특징과 낮은 표면 오염이 있는 그리드 영역을 식별합니다.</li>
	<li>가스 주입 시스템(GIS)을 사용하여 각 그리드 표면에 >2μm 유기백금 코팅을 적용합니다. 이렇게 하려면 GIS 바늘을 그리드 위의 챔버에 삽입하고 유기 백금 소스를 설정 온도로 설정 온도(예: 3-10초 동안 ~27°C)로 가열하여 증기 흐름을 생성합니다. 참고: GIS 바늘을 통한 유기백금 코팅의 적용 각도, 온도 및 타이밍은 균일한 코팅을 최대화하도록 최적화되어야 합니다. 이는 사용된 특정 cryoFIB-SEM에 따라 다릅니다(자세한 설명은 대표 결과 참조).</li>
	<li>그리드의 평면이 이온 빔의 입사각에서 ~ 10 °가되도록 샘플을 기울이고 SEM 및 FIB 이미지 모두에서 볼 수있는 적절한 그리드 사각형의 중심을 이동하십시오.</li>
	<li>낮은 전류(공칭 1.5pA, 30kV)에서 이온 빔을 사용하여 그리드를 조사하고 그리드 사각형의 중심에 있는 셀을 시각화할 수 있을 만큼 충분히 높은 배율(~7,000x)로 이동합니다. 첫 번째 밀링 전류(300pA)에서 샘플에 초점을 맞추고 난시를 교정합니다. 밝기와 대비를 조정한 다음 두 개의 직사각형 패턴을 밀링하여 3μm 두께의 보호 영역 위와 아래에 하나씩 표시하며, 그 중심은 최종 라멜라의 원하는 위치입니다. 참고: 패턴의 선택한 너비는 주변 셀층의 지형과 셀 크기에 따라 달라집니다. 7-20 μm는 정신 분열증에 적합한 너비이지만 더 넓은 라멜라는 밀링하는 데 더 오래 걸립니다. 첫 번째 밀링 단계에서 선택한 패턴 높이는 약 6μm부터 시작하는 샘플 두께에 따라 다릅니다. 밀링 중에 조정해야 할 수도 있습니다. 밀링은 패턴의 바깥 쪽 상단 및 하단 가장자리에서 라멜라면을 향해 방향으로 수행됩니다. 이것은 병렬로 수행 할 수 있으며, 두 패턴이 동시에 또는 순차적으로 밀링되어 먼저 라멜라 위에서 재료를 제거한 다음 아래에서 재료를 제거합니다.</li>
	<li>첫 번째 전류에서 밀링을 시작합니다. 이온 빔 보기에서 실시간 진행 상황을 모니터링하고 SEM(5kV, 13 또는 25pA)으로 간헐적으로 모니터링합니다. 이온 빔이 보호 영역 위와 아래를 뚫고 나왔는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 직사각형 패턴의 높이를 늘려 더 많은 재료를 제거합니다. 라멜라 위와 아래의 표면이 이온 빔에서 완전히 매끄러울 때 멈춥니다. 알림: 이온 빔은 직사각형 패턴의 내부에 초점면에 특징이 없을 때 보호 영역 위와 아래를 뚫고 나왔습니다. 격자 막대와 같은 일부 기능은 배경에서 초점이 맞지 않게 보일 수 있습니다.</li>
	<li>다음 밀링 전류(100pA)로 변경합니다. 초점을 맞추고 밝기/대비를 조정합니다. 두 직사각형 패턴 사이의 공간을 1.5μm로 줄이고 패턴 높이를 줄여 밀링되지 않은 재료만 덮습니다. 라멜라 위와 아래의 표면이 완전히 매끄러워질 때까지 새로운 전류에서 밀링을 시작합니다.</li>
	<li>0.3μm의 두께에 도달할 때까지 이 과정을 단계적으로 반복하여 표 1의 밀링 방식에 따라 매번 이온빔 전류를 줄입니다.</li>
	<li>하나 또는 두 그리드에서 여러 개의 라멜라(양은 샘플의 두께와 사용 가능한 시간에 따라 다름)를 0.3μm 두께로 밀링하고 각 라멜라의 X/Y/Z 위치를 기록하고 세션이 끝날 때 ~1-2시간을 남겨 라멜라를 최종 두께(60-200nm)로 연마합니다.</li>
	<li>전체 그리드에 대한 저배율 SEM 개요를 확인하고 그리드 전면의 라멜라(이온 빔 소스에 더 가까움)에서 그리드 후면의 라멜라(이온 빔 소스에서 가장 멀리 떨어져 있음)까지의 연마 경로를 계획합니다(그림 5). 알림: 이것은 연마된 라멜라 표면에 절제된 재료의 재침착을 줄입니다.</li>
	<li>두 직사각형 패턴 사이의 공간을 100-200nm로 줄이고 30pA의 이온 빔 전류에서 최종 연마 단계를 시작합니다. 2-3kV(13pA, 드웰 = 300n, 3072 x 2048, 풀프레임의 경우 ~2초)에서 SEM으로 진행 상황을 모니터링하고 SEM에 의해 라멜라에서 대비가 손실되거나 라멜라 자체의 유기백금 코트가 무결성을 잃기 시작하면 연마를 중지합니다.</li>
	<li>그리드를 제거하기 전에 전체 그리드의 저배율 SEM 이미지를 획득하고 각 라멜라의 이미지를 저장합니다. 나중에 TEM에서 그리드를 교차 확인하는 데 사용합니다. 여기에서 실험을 일시 중지하고 액체 질소 아래에 얇은 판이있는 그리드를 보관하십시오 - 조심스럽게 다루십시오. 알림: 그리드는 cryoFIB-SEM에서 제거할 때 가볍게 스퍼터링 코팅될 수 있으며, 이는 고배율에서 TEM의 드리프트 및 충전을 제한하는 데 도움이 될 수 있지만 너무 많은 스퍼터 코팅은 라멜라 내부의 생물학적 내용물을 가릴 수 있으므로 주의해서 수행해야 합니다. 이 단계에서 형광에 대해 라멜라를 스크리닝하는 것이 가능합니다. 그러나 충분한 신호를 얻는 것은 라멜라 두께 내에서 표지된 단백질의 풍부도에 따라 달라집니다. 라멜라의 손상을 제한하고 표면 오염을 방지하기 위해 그리드를 취급할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다.</li>
</ol>3. Tilt 시리즈 수집 및 데이터 처리의 일반적인 개요
<ol><li>그리드를 TEM에 로드하여 밀링 방향을 스테이지의 틸트 축에 수직으로 정렬합니다. 알림: 그리드 정렬은 오토그리드 테두리의 표시를 사용하여 눈으로 수행됩니다. ~10°의 오차 한계가 허용되며, 그렇지 않으면 그리드가 기울어질 때 라멜라의 양쪽 트렌치 벽이 라멜라를 가릴 수 있습니다.</li>
	<li>전체 그리드의 저배율 맵(~150x)을 획득하고 라멜라를 찾습니다. 그런 다음 각 라멜라의 중간 배율 맵(라멜라 크기에 따라 ~1,500배)을 획득하고 관심 영역을 찾습니다.</li>
	<li>그리드를 ±10° 미리 기울여 라멜라(그리드가 아님)의 평면을 광축에 수직으로 만듭니다 알림: 사전 기울기의 방향은 저배율 및 중배율 맵에서 라멜라의 앞쪽 가장자리 위치(남은 유기백금 코트 찾기)에 따라 결정될 수 있습니다. 여기에 사용된 TEM의 경우 그리드는 라멜라의 앞쪽 가장자리가 맵에서 위쪽을 가리키는 경우 +10° 사전 기울기가 필요하고 아래쪽을 가리키는 경우 -10° 사전 기울기가 필요합니다. 각 그리드는 오토로더에 집어 넣고 삽입하는 방법에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	<li>관심 영역에 필요한 시야와 해상도를 모두 허용하는 픽셀 크기에서 선량 대칭 틸트 시리즈38 (예: -54° - +54°, 3-5° 증가)을 획득합니다. -2에서 -5 μm 사이의 디포커스 값 범위를 사용합니다. 각 증분에서 3-10 프레임의 동영상을 수집하고 이를 위해 픽셀 크기에 따라 이러한 매개변수를 조정하여 ~150 e-/Å2 (300kV TEM의 경우)의 총 선량을 축적합니다. 알림: 라멜라의 균열은 이러한 영역이 표류할 수 있으므로 피해야 합니다. 표면 오염은 관심 영역이나 높은 기울기에서 초점 영역을 가릴 수 있으므로 피해야 합니다.</li>
	<li>MotionCor239와 같은 프로그램을 사용하여 동영상을 모션으로 보정합니다. 보정된 이미지(누적된 e-/이미지)40 에 선량 가중치 필터를 적용하고 CTFFIND441과 같은 프로그램을 사용하여 각 이미지의 디포커스를 추정합니다.</li>
	<li>etomo (IMOD) 42 와 같은 프로그램에서 기준점이없는 정렬 (패치 추적)을 사용하여 틸트 시리즈에서 이미지의 정렬 및 각도 관계를 계산합니다.</li>
	<li>정렬 및 회전 정보를 디포커스 값과 함께 3차원 CTF 보정을 적용할 수 있는 프로그램(예: NovaCTF43)에 입력합니다. 보정된 단층 촬영을 계산하여 다운스트림 분석과 관련된 범주화 계수가 있는 출력 단층 촬영을 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>재구성을 분석하고 필터링, 세분화 또는 하위 단층 구조 평균화와 같은 다운스트림 처리를 준비합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

cryoFIB 밀링이 점점 더 일상화되고 있지만 밀링을 위한 최적의 샘플 준비는 그렇지 않습니다. 따라서 이 프로토콜에서 대부분의 중요한 단계는 샘플이 CryoFIB-SEM에 도달하기 전에 발생합니다. 밀링을 시도하기 전에 가능한 최상의 샘플을 생성하기 위해서는 여러 차례의 세포 준비, 플런지 동결, 광학 및 전자 현미경에 의한 스크리닝을 통한 샘플 최적화가 필요합니다. 최상의 샘플을 확보하면 성공 가능성이 높아질 뿐만 아니라 장비 사용을 최적화할 수 있습니다. 이러한 이유로 대부분의 국가 시설은 기계에 시간을 부여하기 전에 충분한 최적화가 수행되었다는 증거를 요구합니다. cryoFIB-SEM에 들어가면 유기백금 코팅의 효과를 극대화하는 것이 균일하게 얇은 라멜라를 생성하는 데 중요합니다. 마지막으로, 인내심과 우수한 샘플 처리는 사용자의 전제 조건이며, 사용자는 섬세한 라멜라가 포함된 그리드를 생산한 다음 옮기는 데 며칠 동안 앉아 있어야 합니다. 이것은 자동화된 밀링 전략(47,48)의 도입으로 바뀔 수 있지만, 아직까지는, 전체 밀링 공정은 여전히 대부분의 시설에서 대부분 수동이다.
이 연구는 P. falciparum schizonts에만 초점을 맞추었지만 여기에 제시된 방법은 다른 세포 유형에 대한 그리드 준비 및 밀링을 최적화하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 고려해야 할 중요한 요소는 그리드에 적용되는 셀의 밀도, 그리드 유형(구리는 일부 셀에 유독함), 탄소 필름의 구멍 크기 및 간격, 블로팅 시간 및 블로팅 방법(단일/양면, 수동 또는 자동)입니다. 또한 세포가 그리드(일반적으로 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 금 그리드)에서 성장하는 경우 블로팅 및 동결 전에 광학 현미경으로 밀도를 확인할 수 있습니다. 밀링 전략은 셀이 그리드에 증착되는 방식에 따라 다릅니다. 말라리아에 감염된 적혈구의 경우, 그리드는 본질적으로 깨지지 않은 세포층으로 코팅되어 있으며, 일부 영역에서는 더 두껍고 다른 영역에서는 더 얇습니다. 밀링은 얼음 두께가 단층 촬영에 적합한 크기의 라멜라를 생성하는 이 구배를 따라 한 영역의 여러 지점에서 수행됩니다. 이 접근법은 여러 세포를 통해 슬라이스를 포함하는 라멜라를 생성할 수 있으므로 더 작은 세포에 적합합니다. 더 큰 세포 또는 세포 덩어리의 경우 하나의 세포 또는 세포 덩어리가 하나의 라멜라를 생성할 수 있는 경우일 수 있습니다.
그리드 처리 및 시료 이송은 이 워크플로우의 주요 과제 중 하나입니다. 라멜라는 파손 또는 균열, 생물학을 가리는 커튼 인공물, 과도한 표면 오염 및 TEM 내의 그리드 방향 문제로 인해 손실될 수 있으며 그리드를 재배치하기 위한 추가 처리 단계가 필요합니다. 손실의 정도는 매일, 그리드마다 다르지만 시간이 지남에 따라 연습과 처리 경험을 통해 개선됩니다. 이 연구에서는 라멜라를 파괴하지 않고 오토로더에서 그리드의 방향을 여러 번 조심스럽게 변경할 수 있으며 이는 때때로 표면 얼음을 씻어내는 이점이 있음이 밝혀졌습니다. 이 워크플로의 또 다른 주요 제한 사항은 라멜라를 생성하는 데 걸리는 시간입니다. 생산 속도가 느리기 때문에 적절하게 최적화된 샘플을 확보하여 밀링을 최대한 효율적으로 만드는 것이 중요합니다.
유리질 생물학적 샘플의 FIB-밀링에 대한 많은 적응이 최근에 도입되었습니다. 게임 체인저는 cryoFIB-SEM 챔버 내에서 극저온 냉각 리프트 아웃 도구를 구현하여 고압 냉동 샘플에서 더 큰 재료 블록을 밀링 할 수 있습니다. 블록은 금속 막대에 부착하거나 그리퍼에서 집어 들고 특별히 수정된 EM 그리드가 포함된 두 번째 샘플 위치로 이동할 수 있습니다. 그런 다음 블록을 유기 백금으로 코팅하고 밀링하여 라멜라를 생성 할 수 있습니다. 고압 냉동 물질로부터 라멜라를 분쇄할 수 있다는 것은 훨씬 더 큰 세포와 조직을 처리할 수 있다는 것을 의미하며, 특히 상관 형광 현미경으로 영역을 표적화할 수 있다12. FIB-밀링 방법에 대한 다른 최근의 적응은 샘플(16)을 쐐기 예비-밀링(wedge pre-milling)하여 커튼 아티팩트를 감소시키는 것, 미세유체 극저온 고정(microfluidic cryo-fixation)(49 ) 및 세포 분포(50)를 개선하기 위한 전자 현미경 그리드(electron-microscopy grid)의 광-마이크로패터닝(photo-micropatterning)을 포함한다. 또한, 라멜라의 양쪽 밀링 미세 팽창 갭은 최종 두께51에 도달 할 때 주변 샘플에 의한 압축을 완화 할 수 있음이 입증되었습니다. 이것은 이 연구의 샘플과 같이 연속적인 세포층을 밀링할 때 특히 유용할 수 있으며, 여기서 최종 연마 단계 동안 라멜라의 굽힘이 때때로 보입니다.
전자 현미경의 미래는 서브 단층 촬영 평균화에 의한 현장 분자 구조의 결정이 될 것이며 FIB 밀링은 이러한 유형의 워크플로우를 위한 유리체 생물학적 샘플의 생산을 용이하게 하는 중요한 도구입니다. FIB 밀링은 아직 생물학적 응용을 위한 초기 단계에 있지만, 학계 및 국가 시설 모두의 연구자들의 노력과 연구를 지원하기 위한 cryoFIB-SEM 기술 개발에 대한 상업적 투자 덕분에 방법 개발이 빠른 속도로 진행되고 있습니다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온에서 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 <500nm 두께의 생물학적 시료의 세포 내용물만 효과적으로 이미지화할 수 있으며, 표본의 범위를 바이러스, 원핵생물, 단순 단세포 유기체 및 더 큰 진핵 세포의 더 얇은 영역으로 제한합니다1. 그리드 집속 이온 빔 (FIB) 밀링을 사용하면 극저온 (< -150 ° C)에서 더 두꺼운 플런지 냉동 생물학적 샘플을 전자 투명 라멜라로 얇게 만들 수 있습니다. 그런 다음 생성된 라멜라는 시각화 및 단층 촬영 데이터 수집을 위해 TEM으로 전송되어 세포 내부의 세포 및 분자 특징에 대한 고해상도 3D 재구성을 가능하게 합니다(검토는 Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163 및 Wagner et al., 20204 참조).
FIB 밀링은 재료 과학 분야에서 등장했으며, 샘플은 다운스트림 분석을 위해 준비하기 위해 일상적으로 얇아집니다5. 이는 주사 전자 현미경 (SEM)에서 수행되며, 기존의 주사 전자 현미경 광학과 집속 이온 빔 (FIB)을 생성하고 미세하게 제어 할 수있는 광학 장치를 포함하는 두 번째 열(FIB-SEM이라고함)이 있습니다. 이를 통해 샘플의 특정 영역이 갈륨 소스에 의해 생성된 이온에 의해 제거되어 과도한 물질을 제거하고 라멜라6을 남길 수 있습니다. 밀링 공정은 시료 지형의 SEM 이미징에 의해 안내되며, 이는 관심 영역을 찾고 밀링 진행 상황을 모니터링하는 데 사용됩니다. 생물학적 응용 분야의 경우 기본 설정은 거의 동일하지만 밀링은 극저온에서 수행됩니다. 이를 위해서는 표준 FIB-SEM이 일정한 온도와 낮은 표면 오염률을 유지하는 극저온 냉각 단계와 실투 또는 오염 없이 시료 이송을 용이하게 하는 에어록을 갖도록 조정해야 했습니다. 샘플 셔틀은 또한 TEM 그리드, 플랑셰트 및 모세관을 포함하여 다양한 캐리어를 cryoFIB-SEM 내부에 장착할 수 있도록 수정되었습니다. 몇 가지 주요 연구자 그룹이 이러한 방법의 개발과 이 분야의 지속적인 기술 발전의 중심이었습니다 7,8,9,10,11,12. 상용 솔루션은 이제 극저온에서 생물학적 FIB 밀링에 더 널리 사용 가능하며 최적화된 샘플이 주어지면 라멜라의 그리드 밀링이 더욱 일상화되고 있습니다.
다양한 실온 및 CryoEM 기술을 사용하여 적당한 해상도의 전체 다세포 유기체부터 세포 수준에서 복잡한 과정의 맥락을 이해하고 훨씬 더 자세하게 결정하는 것까지 모든 규모의 생명체에 걸쳐 세포 정보를 시각화할 수 있습니다. in situ 분자 구조13,14,15,16,17,18,19. 고전적인 실온 기술에는 TEM에 의한 세포 형태 분석을 위한 초미세절제술에 의한 고정 및 염색된 수지 포매 세포 및 조직 절편이 포함됩니다(검토를 위해 Studer et al., 200820). 나이프 (직렬 블록 얼굴 이미징) 또는 집속 이온 빔으로 물질을 점진적으로 제거하기 전에 보존 된 세포 블록의 표면을 이미지화하기 위해 SEM에 의한 2 차 전자 산란을 이용하는 대체 기술이 개발되었습니다21,22,23. 이 기술은 또한 염색되지 않은 유리체의 세포 또는 조직 블록에 대한 cryoFIB-SEM을 사용하여 극저온 (극저온 이미징이라고 함)에서 성공적으로 구현되었습니다24. 또는 더 두꺼운 라멜라(~15μm 두께)를 밀링하고 STEM 이미징으로 연구할 수 있습니다25. 이러한 기술을 사용하여 많은 세포를 포함하는 전체 블록을 이미지화하여 인구 정보를 수집하거나 전체 기관/유기체를 이미지화하고 3D로 재구성할 수 있습니다. 그러나 세포에서 고분해능 분자 정보에 접근하려면 시료를 거의 원시적이고 냉동된 수화 상태로 보존해야 하므로 극저온 조건에서 준비해야 합니다. 유리체 절편의 극저온 전자 현미경(CEMOVIS)은 생물학적 물질의 고압 동결 블록을 극저온 조건에서 울트라마이크로톰으로 절편하는 기술입니다. 이것은 cryo-section(40-100nm 두께)의 리본을 생성합니다.26, EM 그리드에 부착되고 TEM에서 이미지화됩니다. 그러나 칼과 유리체 샘플의 물리적 상호 작용은 세포 구조를 심각하게 왜곡시킬 수 있는 크레바스 및 압축 인공물을 유발합니다27,28,29,30. 두꺼운 섹션은 이러한 아티팩트에 더 취약하므로 ~70nm보다 두꺼운 섹션을 사용하는 것은 비실용적입니다26. 이 제한은 단층 촬영에서 생물학적 구조의 3D 보기를 크게 제한합니다. 극저온에서의 FIB 밀링은 이러한 문제를 경험하지 않지만 시편의 여러 부분에 걸쳐 밀링 속도가 차등하여 발생하는 자체 아티팩트가 있어 라멜라 내에서 다양한 두께(커튼이라고 함)가 발생합니다. 이 문제는 밀링 중에 라멜라의 앞쪽 가장자리를 보호하는 가스 주입 시스템(GIS)을 통해 적용된 유기백금 코팅을 적용함으로써 완화됩니다31. 그리드 FIB 밀링을위한 샘플 두께의 상한선은 유리질을 유지하면서 샘플을 동결시키는 능력으로 정의됩니다32, 극저온 리프트 아웃 기술과 생물학적 표본에 적합한 샘플 캐리어가 도입됨에 따라 FIB 밀링은 고압 냉동 샘플을 처리하는 데에도 사용할 수 있습니다31,33,34,35. 또한, 플런지 냉동 샘플은 필요한 배율에서 틸트 시리즈를 수집하기에 충분한 표면적을 제공하는 합리적인 크기의 라멜라를 생성하기에 충분한 생물학적 물질이 있어야 하기 때문에 너무 얇을 수 없습니다. 이 문제는 박테리아나 효모와 같은 더 작은 세포 덩어리를 밀링하여 완화할 수 있습니다. 최종 라멜라 두께(~100-300nm)는 일반적으로 시료 무결성 및 밀링 전략에 따라 결정됩니다. 얇은 라멜라는 서브 단층 촬영 평균화와 같은 고해상도 구조 작업에 더 좋지만 두꺼운 라멜라는 CEMOVIS로 얻을 수 있는 것보다 훨씬 더 큰 세포 부피를 포함하여 거의 기본적으로 보존된 샘플에서 더 많은 세포 맥락을 제공합니다. FIB 밀링은 또한 전자 회절 연구를 위해 급락 동결 단백질 결정을 얇게 만드는 데 사용할 수 있습니다36.
유리체 세포의 FIB 밀링은 과학적 질문에 현장에서 거의 네이티브 표본의 고해상도 분자 세부 정보가 필요한 경우 수행하는 데 시간과 노력을 들일 가치가 있습니다. 라멜라의 일상적인 생산을 위해 더 많은 시설에 접근할 수 있는 속도 제한 단계는 종종 밀링 전에 샘플을 최적화하는 것이며, 여기서 샘플이 유리질이고 견고하고 균일하게 얇은 라멜라를 생성하기 위한 적절한 두께인지 확인하는 데 시간이 걸립니다. 여기에 설명된 것은 말라리아의 원인 병원체인 Plasmodium falciparum 기생충에 감염된 FIB 밀링 플런지 냉동 인간 적혈구에 대한 샘플 최적화이지만 이 접근 방식은 주어진 샘플에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>클리핑 스테이션</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>해당 사항 없음</td><td>Thermo</td></tr><tr><td>Clipping station</td><td>Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Compound 2</td><td>n/a</td> 해당 <td>없음</td><td>Simon A. Osborne 박사 합성, LifeArc</td></tr><tr><td>Cryo-FIB 특정 오토그리드 림</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1205101</tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X 글로우 방전 유닛</td><td>Quorum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>배양에 사용되는 제형은 맞춤 제작되며(REF 041-91762 A) Albumax, glutamine, HEPES 및 hypoxanthine 보충제를 포함합니다.</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>그리드 박스</td><td>서브 옹스트롬</td><td>PB</td><td>클리핑 그리드용</td></tr><tr><td>그리드 박스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>해당 없음</td><td>- Thermo Fisher Scientific 그리드 박스에서 직접 견적</td></tr><tr><td></td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>Home-made manual plunge freezing rig</td><td>n/a</td><td>해당 없음</td><td>절연 에탄 포트(고밀도 폼)와 액체 질소 수조(폴리스티렌)가 격리 시설의 벤치 탑에 있습니다.</td></tr><tr><td>인간 혈액</td><td>해당 없음</td><td></td><td>영국 국립 혈액 및 이식 서비스</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM 라이카 VCT500 스테이지 냉각 시스템</td><td>JEOL</td><td>해당 없음</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>라이카 EM ACE600 VCT500 극저온 스테이지</td><td>라이카</td><td>해당 없음</td> 스<td>퍼터 코팅기</td></tr><tr><td>라이카 EM ACE900</td><td>라이카</td><td>해당 없음</td><td>전자빔 로터리 코팅기. 습도가 조절되는 방에서.</td></tr><tr><td>광학 현미경용 Linkam 극저온 스테이지</td><td>Linkam</td><td>모델 번호 CMS196</td><td>클리핑 및 클리핑되지 않은 그리드용 카세트. 습도가 조절되는 방에서.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E200 광학 현미경</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>습도 조절실에서 Linkam 극저온 스테이지.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll 쿠션용 솔루션은 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 매체 및 315 ml</td></tr><tr><td>Percoll Quantifoil 구리 200 메시 2/4 홀 탄소 EM 파인더 그리드</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100 팩</td></tr><tr><td>Quantifoil 구리 200 메시 2/4 구멍 탄소 EM 그리드</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 팩</td></tr><tr><td>Quorum PP3010 준비 챔버</td><td>Quorum</td>입니다.<td>해당 없음 스</td><td>퍼터</td></tr><tr><td>코터 Scios 듀얼 빔에는 Quorum PP3010 전송 스테이지가 장착되어 있습니다.</td><td>FEI</td><td>해당 없음</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor 미세 검정 영구 마커 펜</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K2 또는 K3 카메라가 장착된 TEM</td> <td>해당 없음</td>.</tr>습도가 조절되는 방에서 <tr><td>Whatmann 1등급 여과지</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scope A1 광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>, Linkam 극저온 스테이지 포함.</td></tr></tbody></table>

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

여기에 제시된 것은 다른 생물학적 샘플에 쉽게 적용할 수 있는 Plasmodium falciparum에 감염된 인간 적혈구의 급락 동결 그리드에서 극저온 라멜라를 준비하기 위한 프로토콜입니다. 시료 준비, 밀링 및 라멜라 관찰에 대한 기본 원칙은 모든 기기에 공통적으로 적용되며, 이 프로토콜은 초저온 전자 현미경(cryoEM) 및 초저온 전자 단층 촬영(cryoET)을 위한 그리드 내 극저온 라멜라 준비에 대한 일반적인 지침으로 따를 수 있습니다. 세포를 지지하는 전자 현미경 그리드는 수동 또는 자동 플런지 냉동고를 사용하여 액체 질소 냉각 액체 에탄으로 플런지 동결된 다음 극저온 스테이지가 장착된 광학 현미경에서 스크리닝됩니다. 동결 된 그리드는 집속 이온 빔 (cryoFIB-SEM)이 장착 된 극저온 주사 전자 현미경으로 전송됩니다. 그리드는 밀링 전에 일상적으로 스퍼터링 코팅되어 밀링 중에 축적된 전하의 분산을 돕습니다. 또는 e-빔 로터리 코터를 사용하여 그리드에 탄소-백금 층을 적용할 수 있으며, 정확한 두께를 보다 정밀하게 제어할 수 있습니다. cryoFIB-SEM 내부에 들어가면 가스 주입 시스템(GIS)을 통해 유기백금 화합물의 추가 코팅이 그리드 표면에 적용됩니다. 이 층은 밀링될 때 라멜라의 앞쪽 가장자리를 보호하며, 그 무결성은 균일하게 얇은 라멜라를 달성하는 데 중요합니다. SEM을 통해 관심 영역을 식별하고 과도한 열 발생을 피하기 위해 라멜라가 전자 투명도에 도달할 때 이온 빔의 전류를 감소시키는 단계적 방식으로 밀링이 수행됩니다. 그런 다음 여러 개의 라멜라가 있는 그리드를 극저온 조건에서 투과 전자 현미경(TEM)으로 전송하여 틸트 시리즈 획득을 수행합니다. 라멜라 전처리를 위한 견고하고 오염 없는 워크플로우는 세포 cryoEM, cryoET 및 서브 단층 촬영 평균화를 포함한 다운스트림 기술의 필수 단계입니다. 특히 고압 냉동 샘플의 리프트 아웃 및 밀링을 위한 이러한 기술의 개발은 현장에서 최우선 과제입니다.

집속 이온빔 밀링을 사용하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 급락 동결 생물학적 샘플에서 유리질 그리드 상의 라멜라를 생성합니다.

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

이 프로토콜은 초저온 전자 단층 촬영을 위한 Plasmodium-falciparum에 감염된 적혈구의 유리체 라멜라 제조를 간략하게 설명합니다. 이를 통해 기생충이 말라리아를 유발하는 방법에 대한 자세한 구조 정보를 직접 관찰할 수 있습니다. 초저온 전자 단층 촬영은 세포 내부에 대한 고해상도 정보를 기록합니다.단일 단백질 복합체를 현장에서 관찰할 수 있을 만큼 강력하며, 이를 계산적으로 추출하고 평균화하여 단백질에 대한 3차원 구조 정보를 밝힐 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 초저온 전자 단층 촬영을 위한 유리체 라멜라를 처음 생산하는 사람에게 출발점이 될 수 있습니다. 이것은 오늘 프로토콜을 수행 할 Alejandra Carbajal입니다.시작하려면 CryoStage를 사용하여 냉동 구리 그리드를 스크리닝하고 그리드를 가로지르는 얼음의 구배에 특히 주의를 기울이는 광학 현미경을 사용합니다. 얼음의 더 얇은 영역에서 셀 범위에 대해 개별 그리드 사각형을 확인하십시오. 지워지지 않는 검은색 마커를 사용하여 Cryo-FIB-SEM 전용 오토그리드 림의 전면과 반대쪽을 표시합니다.잘린 그리드를 탄소면이 위로 향하게하여 Cryo-FIB-SEM 셔틀에 넣고 4 나노 미터 두께의 탄소 또는 백금 전자 빔 회전 코팅을 셀 표면에 적용합니다. 셔틀을 Cryo-FIB-SEM에 로드하고 5킬로볼트에서 SEM으로 각 그리드의 셀 분포를 평가합니다. 100 전력에서 저배율 개요를 통해 그리드 전체의 얼음 그라데이션을 살펴보십시오.그런 다음 5, 000 전력에서 더 높은 배율의 이미지를 찍어 개별 그리드 사각형을 봅니다. 가스 주입 시스템 바늘을 그리드 위의 챔버에 삽입하고 유기 백금 소스를 설정된 시간 동안 설정 온도로 가열하여 증기 흐름을 생성하여 각 그리드의 표면에 2마이크로미터 유기백금 코팅을 적용합니다. 샘플을 관찰하기 위해 그리드의 평면이 이온 빔의 입사각에서 약 10도가되도록 샘플을 기울이고 SEM 및 FIB 이미지 모두에서 볼 수있는 적절한 그리드 사각형의 중심을 이동하십시오.낮은 전류에서 이온 빔을 사용하여 그리드를 고배율로 조사하여 그리드 사각형의 중심에 있는 셀을 시각화합니다. 밀링할 직사각형 패턴 2개를 표시하는데, 하나는 3마이크로미터 두께의 보호 영역 위와 아래에 있습니다. 그런 다음 빔 설정을 선택하고 밝기와 대비를 조정하여 난시를 교정합니다.설정이 완료되면 300피코암페어의 전류에서 밀링을 시작하면서 이온 빔 보기에서 실시간 진행 상황을 모니터링하고 SEM으로 간헐적으로 모니터링합니다. SEM에서 샘플을 확인하고 첫 번째 밀링 후 이온 빔이 보호 영역 위와 아래의 샘플을 통과하지 않은 경우 직사각형 패턴의 높이를 높여 더 많은 재료를 제거합니다. 라멜라 위와 아래의 표면이 이온 빔 보기에서 완전히 매끄러우면 밀링을 중지합니다.밀링 공정을 단계적으로 반복하여 두께가 300나노미터에 도달할 때까지 매번 이온빔 전류를 줄입니다. 각 라멜라의 X, Y, Z 위치를 기록합니다. 실험이 끝날 때 라멜라를 연마하려면 저배율 SEM 개요를 사용하여 연마할 라멜라 그룹을 선택하고 연마 루트를 표시합니다.연마 루트가 표시되면 두 직사각형 패턴 사이의 공간을 100-200 나노 미터로 줄이고 30 피코 암페어의 이온 빔 전류에서 연마를 시작합니다. 2-3킬로볼트에서 SEM으로 진행 상황을 모니터링합니다. 라멜라의 대비가 SEM에 의해 손실되거나 유기백금 코트 또는 라멜라 자체가 무결성을 잃기 시작하면 연마를 중지하십시오.각 라멜라의 저배율 SEM 이미지를 획득하고 저장합니다. 실험 완료 후 현미경에서 셔틀을 제거합니다. 라멜라로 그리드를 제거하고 액체 질소 아래에 보관하십시오.그리드를 주의해서 다루십시오. 형태학을 연구하기 위해, 분열증은 E-64 억제제의 화합물 2를 사용하여 출구의 다른 단계에서 멈췄습니다. 화합물 2의 존재 하에서, 숙주 적혈구에서 기생하는 막과 주변 헤모글로빈 사이의 경계가 잘 정의되었다.온전한 기생 액포 또는 PV는 헤모조인 결정의 단일 클러스터에 메로조이트로 가득 차 있었습니다. 화합물 2 개의 동기화 된 schizonts가 E-64로 세척되었을 때, PV 막이 파열되고 메로 조이트가 RBC 내에서 퍼졌습니다. 구리 그리드에서 좋은 세포 분포의 전형적인 예는 잘 정의된 주변부와 손상되지 않은 액포 막을 가진 큰 적혈구를 보여줍니다.부분적으로 붕괴된 숙주 적혈구 내에서 개별 메로조이트는 작은 세포 클러스터로 시각화되었습니다. 각 정신 분열증은 중앙에 검은 반점이 있어 헤모조인 결정의 위치를 나타냅니다. 밀링 후, 그리드를 TEM에 로드하여 라멜라의 위치를 식별하고 단층 촬영으로 표적화하기에 적합한 영역을 찾았습니다.샘플 현미경 사진에서 최근에 메로조이트에 의해 침범된 적혈구를 볼 수 있습니다. 숙주 세포 유래 막으로 둘러싸인 메로조이트는 RBC의 경계 내에서 볼 수 있습니다. 메로조이트의 꼭대기 끝에서 세포를 둘러싸고 있는 2개의 막과 전자 밀도가 높은 버섯 모양의 특징과 관련된 메로조이트의 꼭대기에 쌓인 4개의 막이 명확하게 보였습니다.메로조이트의 세포질 내에서, 메로조이트 원형질막과 다층 소포 사이의 융합 사건이 확인되었다. 230 나노 미터 두께의 라멜라에 대한 추가 TEM 분석에서, E-64로 처리 된 성숙한 메로 조이트의 전형적인 형태가 관찰되었다. 적혈구막 내에서 메로조이트 원형질막은 내막 복합체, 극성 고리, 미벅, 립트리 및 핵막과 같은 세포 소기관과 함께 볼 수 있습니다.이 기술의 가장 중요한 부분은 얇은 라멜라를 재현 가능하고 효율적으로 생산할 수 있도록 그리드를 최적화하는 것입니다. 이 기술의 추가 개발을 통해 연구자들은 말라리아 기생충 내에서 단일 단백질 분자를 시각화하고 말라리아 탈출에서 그 역할을 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 &lt;1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

배우세요 극저온 전자 단층 촬영을 위한 유리체 라멜라 준비 방법을 Plasmodium falciparum 감염 적혈구에서. 이 기술은 말라리아 기생충의 고해상도 구조 분석과 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적입니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

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