Name: Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprenda a preparar amostras de Saccharomyces cerevisiae para tomografia criogênica usando micromaquinamento por feixe de íons focado. Este protocolo detalhado abrange desde o cultivo celular até a aquisição de dados de alta resolução.

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Este trabalho foi apoiado instruct-ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia, e a infraestrutura de pesquisa CIISB, um Centro Instruct-ERIC (LM2018127). Reconhecemos o apoio obtido da Thermo Fisher Scientific Brno.

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação das amostras celulares para crio-ET é um fluxo de trabalho complexo que requer a utilização de vários instrumentos high-end. A qualidade da amostra pode ser comprometida durante cada etapa de preparação que influencia o throughput de todo o protocolo. Além disso, a necessidade da transferência de amostras entre instrumentos individuais representa um risco adicional de contaminação ou desvitarificação da amostra. Portanto, a otimização das etapas individuais no fluxo de trabalho de preparação da amostra é de alta importância para aumentar o rendimento e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho de preparação lamella. O protocolo aqui apresentado descreve a preparação otimizada de Saccharomyces cerevisiae para caracterização estrutural de complexos macromoleculares in situ por crio-ET.
O protocolo descreve a preparação de dois tipos de amostras de levedura que diferem principalmente na concentração das células na grade TEM. Ambas as amostras de levedura produziram lamellae de alta qualidade para crio-ET e a seleção do tipo de espécime pode ser feita de acordo com os objetivos do estudo em particular. A levedura forma aglomerados isolados de poucas células espalhadas aleatoriamente sobre a superfície da rede no primeiro caso, enquanto uma monocamada contínua de células está presente na superfície da grade TEM para o segundo tipo de amostra. O primeiro é adequado para a preparação rápida de lamella graças ao pequeno volume do material que deve ser fresado. A lamella final é bastante curta e, portanto, contém apenas 2-4 seções transversais celulares. As áreas adequadas para a preparação da amostra são distribuídas aleatoriamente sobre a superfície da rede, incluindo os quadrados da grade, o que pode restringir parcialmente a automação do fluxo de trabalho de preparação lamella. Este último tipo de amostra requer a utilização de correntes maiores durante a fase inicial de moagem para manter o tempo total de moagem. Além disso, este tipo de amostra é mais propensa a artefatos que decorrem de fresagem desigual (cortinas). Portanto, o SIG é sputtered na superfície da amostra por um período 50% maior do que no caso da amostra com pequenos aglomerados celulares para formar uma camada de proteção mais espessa. Em seguida, a amostra é sputtered com uma camada adicional de Iridium (alternativamente platina ou ouro) para curar a camada GIS, torná-la mais rígida e aumentar a condutividade da superfície da amostra. FIBM de áreas adicionais em cada lado da lamella (~2-5 μm da borda lamella) durante a primeira etapa da fresagem lamella áspera foi considerado benéfico para diminuir o número de lamellae quebrada provavelmente devido à diminuição da tensão na seção transversal final23. A lamella final é longa e contém ~10 seções transversais celulares, o que aumenta o número de regiões adequadas para crio-ET. A vitrificação inadequada do meio ou tampão entre as células pode ser facilmente atenuada pela adição do crio-protetor à solução tampão (5% de glicerol utilizado neste estudo). Como a maioria dos quadrados são adequados para a preparação de lamella, a amostra com células organizadas em uma monocamada contínua é bem adequada para a preparação de lamella não supervisionada.
Outro aspecto importante no fluxo de trabalho de preparação da lamella é a transferência para o microscópio eletrônico de transmissão e o posicionamento adequado da lamella para o eixo de inclinação do estágio do microscópio. Na melhor das hipóteses, o eixo principal lamella é perpendicular ao eixo de inclinação do microscópio que permite o rastreamento e o foco na altura da região imagem e impede que as bordas lamella protejam o campo de visão em ângulos de inclinação alta. Ao coletar os dados crio-ET usando o esquema simétrico de dose,18 a amostra deve ser inicialmente girada no microscópio para compensar a inclinação da lamella em relação ao plano de grade.

Desenvolvimentos tecnológicos e de software recentes fizeram da crio-microscopia eletrônica (crio-EM) de espécimes biológicos vitrificados uma das principais técnicas em pesquisa de biologia estrutural na última década1,2. A preparação de um espécime para crio-EM geralmente consiste na aplicação de uma proteína purificada ou um complexo de proteína com ácido nucleico no portador da amostra (grade TEM), seguido pela remoção da maior parte do líquido com um papel filtro, e mergulho de congelamento da grade com a fina camada residual de uma amostra em etano líquido ou propano3 . A amostra é, portanto, fixada em uma camada fina (tipicamente <80 nm) de tampão amorfo em um estado totalmente hidratado, em condições quase nativas, e sem necessidade de qualquer fixação química ou contraste de metais pesados. A imagem da amostra estruturalmente homogênea no microscópio eletrônico de transmissão resulta em dados que podem ser usados para a determinação da estrutura tridimensional da macromolécula em resolução quase atômica usando um único protocolo de análise de partículas2. Tal estrutura in vitro corresponde à representação da macromolécula nas condições e tratamento utilizado durante a preparação da amostra. Embora as estruturas determinadas sob as condições in vitro geralmente correspondam ao estado totalmente funcional da macromolécula, a capacidade de imagem das relações espaciais entre várias macromoléculas dentro da célula forneceria um contexto funcional adicional aos dados estruturais.
A tomografia crio-elétron (crio-ET) é usada para reconstruir volumes 3D de objetos pleomórficos ou complexos macromoleculares in situ4,5. A vantagem do crio-ET é que as informações tridimensionais são obtidas por meio de imagens de uma única entidade. No entanto, a resolução na qual complexos macromoleculares individuais ou organelas são observados é muito limitada. Portanto, a média das macromoléculas (média do sub-tomograma, STA) com a mesma estrutura de um número maior de tomogramas é necessária para atingir modelos de resolução de 4-8 Å a partir dos dados crio-ET6,7. Recentemente foi demonstrado que crio-ET e STA também podem ser aplicados para determinar estruturas de alta resolução de máquinas macromoleculares, como ribossomos no contexto do ambiente celular7. No entanto, a utilização da microscopia eletrônica de transmissão é limitada pela espessura da amostra. Em geral, este não é um problema para crio-EM de partícula única, onde a otimização das condições de vitrificação pode eventualmente resultar na incorporação da amostra em uma fina camada de gelo. Por outro lado, a maioria das células não são de fato transparentes para o feixe de elétrons de 300 keV. O caminho livre da média inelástica nos espécimes biológicos vitrificados para os elétrons de 300 keV é de aproximadamente 395 nm8, o que significa que os estudos crio-ET estão limitados à periferia celular para a maioria das células.
Diferentes técnicas foram desenvolvidas para reduzir a amostra até uma espessura suficiente para crio-ET. A criomicrotomia utiliza o corte mecânico da amostra com uma faca de diamante na temperatura do nitrogênio líquido (-196 °C) para fornecer seções de 60-80 nm de espessura adequadas para crio-ET9,10,11. Várias seções podem ser preparadas a partir de uma única célula e a análise de dados pode eventualmente produzir informações estruturais 3D para a maior parte da célula. No entanto, o corte mecânico pode causar vários artefatos, como seções curvas, fendas ou compressão de amostra, que podem influenciar a estrutura resultante e viés dos dados crio-ET10,11,12. A micromaquintação de feixe de íons focado em crio-fibe (crio-FIBM) representa uma abordagem alternativa onde uma seção celular fina é preparada por ablação gradual da amostra usando um feixe focal de íons Ga+ (FIB) em um processo de várias etapas, o que pode resultar em 80-300 nm de espessura seção transversal celular (lamella)13,14,15 . Em contraste com a crio-ultramicrotomia, apenas uma lamella é preparada a partir de uma única célula, o que representa ~0,3-3% de seu volume, e a micromaquinção de múltiplas células geralmente é necessária para encontrar uma região de interesse na seção transversal fresada. Além disso, o throughput de todo o fluxo de trabalho ainda é hoje bastante baixo, muitas vezes limitado a lamellae de alta qualidade de 6-8 de uma sessão crio-FIBM de 8 horas. Por outro lado, as seções transversais crio-FIBM são desprovidas de quaisquer artefatos de compressão e fornecem entrada adequada para crio-ET de alta resolução. Além disso, a transferência da lamella para o portador da amostra para crio-ET não é necessária, pois a amostra é retida na grade TEM durante todo o processo de preparação da lamella e a mesma grade pode ser posteriormente transferida para o TEM. Esperamos que o rendimento do crio-FIBM seja significativamente melhorado em breve, principalmente a partir da disponibilidade de software para moagem lamella não supervisionada16,17 e utilização de FIBs operando sob o princípio do plasma de casal de carga, que irá permitir a ablação material mais rápida.
Saccharomyces cerevisiae (levedura) são células eucarióticas de forma esférica e diâmetro de ~2-5 μm. Graças ao seu tamanho, acessibilidade, genética, tempo de geração e manipulação simples, a levedura é extensivamente estudada como um organismo modelo eucariótico em pesquisas de biologia celular e molecular semelhantes à Escherichia coli,que é bem estudada como um organismo modelo procariótico em bacteriologia. A levedura pode ser facilmente cultivada em suspensão e uma alta quantidade de células é gerada em pouco tempo (dobrando o tempo de 1 a 2 horas). Mais importante, a levedura compartilha uma complexa estrutura celular interna com células animais e vegetais, mantendo um pequeno genoma composto por um baixo teor de DNA não codificado. A caracterização estrutural do proteome de levedura a partir dos dados in situ de alta resolução pode, assim, ajudar a fornecer uma descrição mecanicista para a extensa quantidade de dados funcionais disponíveis na literatura.
Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para a aquisição de dados in situ crio-ET sobre a amostra de levedura, que abrange todas as etapas desde o cultivo da amostra até a preparação da lamella crio-FIBM, e a transferência de espécimes para TEM para aquisição de dados crio-ET.

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>etano</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>cepa BY4741</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><forte>Descartável</forte></td>Papéis mata-borrão <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Clipe C</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>Anel</td> <td>de clipe CThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Varas de espalhamento</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Alças de inoculação estéreis</td><td>MARCA</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico estéril</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>TEM grades</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Systec</td><td>balanças 101291545</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cryo-FIB/SEM</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de fluxo laminar</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotômetro UV/VIS</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>Robô de vitrificação</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação e micromaquinção crio-fib de saccharomyces cerevisiae para tomografia crio-elétron

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Hoje, a tomografia crio-elétron (crio-ET) é a única técnica que pode fornecer dados estruturais de resolução quase atômica em complexos macromoleculares in situ. Devido à forte interação de um elétron com a matéria, estudos crio-ET de alta resolução são limitados a espécimes com uma espessura inferior a 200 nm, o que restringe a aplicabilidade do crio-ET apenas para as regiões periféricas de uma célula. Um fluxo de trabalho complexo que compreende a preparação de finas seções transversais celulares pela micromaquinção de feixe de íons focada em crio-ion (crio-FIBM) foi introduzido durante a última década para permitir a aquisição de dados crio-ET do interior de células maiores. Apresentamos um protocolo para a preparação de lamellae celular a partir de uma amostra vimentada pelo congelamento de mergulho utilizando Saccharomyces cerevisiae como um exemplo prototípico de uma célula eucariótica com ampla utilização em pesquisas de biologia celular e molecular. Descrevemos protocolos de vitrificação de S. cerevisiae em remendos isolados de algumas células ou uma monocamada contínua das células em uma grade TEM e fornecemos um protocolo para preparação de lamella por crio-FIB para essas duas amostras.

A cultura saccharomyces cerevisiae foi colhida em meio à fase de crescimento exponencial. Preparamos dois tipos de espécimes nos quais as células foram distribuídas como pequenos aglomerados de várias células sobre a superfície da grade TEM (Figura 1A,C) ou formaram uma monocamada contínua sobre quadrados de grade individuais da grade TEM(Figura 1B,D). O fator discriminatório para a preparação da amostra com ilhotas celulares distintas ou a monocamada celular é a concentração da cultura celular aplicada à grade TEM. A cultura celular colhida concentrou-se em OD600 = 1,0 para o primeiro caso, ou para OD600 = 30 a 60 para este último caso, respectivamente. A amostra para a preparação da monocamada celular foi ainda complementada com 5% v/v glicerol antes da vitrificação. O glicerol é fundamental para a vitrificação da solução tampão, que preenche o espaço entre as células (Figura 2), pois as reflexões do tampão cristalino podem ser prejudiciais para o rastreamento posicional adequado e o foco durante a coleta de dados crio-ET.
Além disso, a cultura de suspensão de levedura foi manchada contra o material não absorvente, como o bloco de manchas PTFE ou a almofada impressa 3D personalizada feita de material FlexFill 98A. O papel de mancha foi posicionado apenas na parte traseira da grade com relação à aplicação da amostra (back-blotting). A estratégia de desinchar as costas é recomendada para a cultura de suspensão mergulhar congelando como mancha com o papel filtro de ambos os lados resulta em adesão das células ao papel de mancha(Figura 1E).
O protocolo descrito aqui utiliza grades TEM cortadas no cartucho de grade, que forma suporte estável para a grade e facilita o manuseio amostral da amostra após a vitrificação. Isso impõe a necessidade de que outros porta-amostras e os transportes no microscópio FIB/SEM e TEM possam aceitar tal cartucho de grade.
Após a transferência da amostra para o microscópio FIB/SEM, a amostra foi revestida pela primeira vez com uma camada de platina metilcyclopentadienyl de 0,3-1,0 μm usando o sistema de injeção de gás microscópio (SIG). Uma camada adicional do irídio inorgânico foi sputtered na superfície da amostra para endurecer a camada GIS e tornar a superfície condutora. Os lamellae foram moídos em múltiplas etapas (Figura 3) onde (I) a corrente de fresagem, (II) a largura da lamella, e (III) a distância da área de fresagem acima e abaixo das amostras foram diminuídas de forma stepwise. A etapa final de fresagem ("polimento") foi realizada em baixa corrente (10-30 pA) apenas do lado superior da lamella e com a amostra inclinada por um adicional de 1° em direção ao feixe Ga+. A utilização do protocolo descrito resultou, em média, em lamellae de 8 a 10 preparadas em duas grades TEM dentro de uma sessão de 6 a 8 horas.
As redes TEM com o lamellae foram posteriormente transferidas para um microscópio eletrônico de transmissão. Os lamellae foram primeiro examinados e apenas aqueles que apresentavam cortinas mínimas (artefatos decorrentes de fresagem irregular em toda a superfície lamella), baixo nível de contaminação superficial e bom contraste celular (geralmente observado para lamellae com espessura de &lt; 200 nm) foram selecionados para a aquisição dos dados crio-ET. Além disso, lamellae contendo rachaduras em toda a extensão foram descartadas da coleta de dados. Em geral, cerca de 50% dos lamellae transferidos para a TEM foram adequados para aquisição de dados. As séries tilt foram coletadas no detector de elétrons diretos pós-GIF K2 com a fenda de seleção de energia definida para 20 eV. A coleta de dados foi realizada no software SerialEM18 e a série inclinação foi coletada utilizando uma dose simétrica esquema19 com a faixa de inclinação de ±60° e o incremento de 3°. Os dados foram adquiridos na ampliação correspondente ao tamanho do pixel de 3,47 A/px. A dose total de 65 e/Å2 foi distribuída uniformemente sobre os subquadrados individuais. As imagens de inclinação foram coletadas como um conjunto de três quadros, que foram posteriormente corrigidos para o dano de movimento e radiação durante a aquisição de dados usando o programa MotionCor220. Os parâmetros da função de transferência de contraste foram estimados utilizando Ctffind421. A série de inclinação foi processada no eTomo18. A rotina de rastreamento de patches foi usada para alinhar as imagens. O tomograma foi reconstruído usando um algoritmo de projeção traseira ponderado após binning 2x das imagens e, posteriormente, filtrado usando filtro sirt -like (definido para 8 iterações) em IMOD18. A segmentação do tomograma foi realizada manualmente no software Amira22. Os tomogramas reconstruídos fornecem uma representação de alta resolução do interior celular da levedura e nos permitem observar organelas como vacuoles ou mitocôndrias em alto nível de detalhes ou estudar complexos macromoleculares, como microtúbulos, ou complexos de poros nucleares in situ e sob condições quase nativas(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Figura 1: Imagens FIB e SEM de S. cerevisiae vitrificado Imagens FIB (A) e SEM(C)dos pequenos aglomerados de levedura vitrificados na grade TEM. Imagens FIB (B) e SEM(D)da levedura formando uma monocamada contínua na superfície da grade. A amostra foi revestida com camada de SIG e Irridium antes da imagem. As barras de escala nos painéis A-B correspondem a 10 μm. A amostra de levedura é borrada contra material não absorvente como PTFE ou FlexFill 98A (verde) e com o papel de mancha posicionado na parte traseira da grade (branco, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Figura 2: S. cerevisiae lamellae Uma imagem TEM de uma lamella micromaquinada da amostra com levedura monocamada contínua sobre a superfície da grade. As reflexões observadas entre as células continham meio/tampão indevidamente vitrificado(A,destacado com círculos vermelhos). Uma imagem TEM de lamella gerada no fermento vitrificada em uma monocamada contínua com a adição de 5% de glicerol no médio/tampão(B). A barra de escala corresponde a 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Figura 3: Fluxo de trabalho Crio-FIBM Representação esquemática do processo de moagem lamella. As etapas iniciais de fresagem áspera são realizadas em altas correntes FIB de ambos os lados da posição lamella provisória (destacada em verde) enquanto a etapa final de polimento é realizada apenas a partir do lado superior e na baixa corrente FIB (destacada em laranja, veja vídeo de acompanhamento às 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Figura 4: Organelas de levedura e complexos macromoleculares retratados por crio-ET Fatias dos tomogramas reconstruídos representando um vacuole (A, barra de escala: 200 nm), ribossomos (B, barra de escala: 200 nm), um núcleo paracristallino de peroxisome(C, barra de escala: 100 nm), microtúbulo (seta branca) na proximidade de estrutura fibrosa não identificada (seta preta, D,barra de escala: 100 nm), detalhes de microtúbulos múltiplos(E, barra de escala: 50 nm), uma membrana nuclear com poros indicados por setas (F, barra de escala 200nm), mitocondrion(G,H, barra de escala: 100 nm, as setas indicam cristae individual), um feixe de estruturas filamentosas não identificadas(I, barra de escala: 100 nm). Os painéis B, C, D, E, G contêm uma seção de tomogramas preparados a partir de pequenos aglomerados de células, enquanto as seções de tomogramas coletadas em lamellae de uma monocamada das células são mostradas nos painéis A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para a preparação de lamella de espécimes biológicos congelados por micromaquingia de feixe de íons focado em crio-pia para estudos estruturais de alta resolução de macromoléculas in situ com tomografia crio-elétron. O protocolo apresentado fornece diretrizes para a preparação de lamellae de alta qualidade com alta reprodutibilidade para caracterização estrutural de macromoléculas dentro do Saccharomyces cerevisiae.

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Este vídeo se concentrará na preparação da salmonela de levedura para tomografia crio-elétron Vamos passar pelo fluxo de trabalho do cultivo celular à crio-elétron tomografia Saccharomyces cerevisiae são cultivadas para preparação de espécimes de íons na suspensão É recomendado para trabalhar em condições estéreis dentro da caixa de fluxo laminar dez mililitros de levedura estéril extraída para médio para cultivo celular é adicionado para esterilizar frasco de cultivo um mililitro de glicose estéril 20 por cento é adicionado a o frasco com cultura média uma colônia de leveduras é cuidadosamente colhida de nossa placa de cultivo e transferida para o meio de crescimento preparado no cultivo de frasco de frasco é então coberto com folha e misturado bem para dispersar células cultura celular é colocado na incubadora e cultivado em trinta graus com agitação constante até que a fase exponencial é alcançada cultura celular levedura é cultivada até fase exponencial e densidade física celular é medida por segurar o medidor contra um meio limpo como uma cultura celular de amostra de referência está concentrada em OD1 ou OD30, além de cinco por cento do glicerol antes de o congelamento de branco A superfície das grades eletro-microscópicas é limpa e ativada para aplicação de suspensão celular por grades de plasma são colocadas em câmara de descarga de brilho voltada para cima e o procedimento de limpeza de plasma é definido para 30 a 45 segundos as grades EM têm agora e estão prontas para células aplicação da amostra Vitrificação da suspensão celular de levedura nas grades EM é feita por branco congelando no etano líquido usando máquina vitrobot A preparação do etano líquido ocorre liquefazendo gás etano em um copo de metal resfriado com nitrogênio líquido Em grid com suspensão celular é manchado por papel filtro da parte de trás e por plástico não adesivo dobrado do lado do carbono dianteiro A temperatura dentro da câmara Vitrobot é definida para dezoito graus e umidade a cem por cento de tempo de espera, tempo de mancha e força de mancha são definidos na tela Vitrobot também A grade de descarga de brilho é escolhida por pinças Vitrobot e montada ao instrumento três pontos cinco microliters de Saccharomyces cerevisiae suspensão é aplicada ao lado carbono da grade dentro da câmara climática Vitrobot Suspensão precisa ser adequadamente misturada antes que cada aplicação da grade de grade é blanche congelada nas redes de eletro-microscopia de etano líquido com células vitrificadas são armazenadas sob condições de nitrogênio líquido ou montadas no cartucho de grade para carregar no microscópio cryo SEM A grade com células vitrificadas é então presa no cartucho de grade adequado para o carregamento tanto para os microscópios SEM quanto para os microscópios C-clip ring é montado na ferramenta de recorte e resfriado na grade de nitrogênio líquido é colocado na grade de carbono voltada para baixo e cortado com o A amostra do anel de clipe C é então colocada na caixa de grade especial Espécime para a preparação de lamila é carregado para microscópio FIB/SEM de feixe duplo e apto com pote de carregamento de câmara de preparação crio-estágio é devidamente resfriado e preenchido com suporte de amostra de nitrogênio líquido chamado transporte é colocado na caixa de grade e resfriado, bem como caixa de grade com espécime é transferido do dewar de armazenamento para o pote e grades são colocadas em duas ranhuras no lado carbono de transporte com células voltadas para cima em caso de uso de cartuchos de grade FIB o corte para fora do cartucho de grade deve ser cuidadosamente alinhado a doze horas nas grades de transporte são apertados pelo parafuso e o transporte é virado para baixo para o pote de carga posição de carregamento é colocado na estação de transferência e coberto com tampa Câmara de transferência com pote de carregamento é colocado na parte superior da tampa e bombeado através do transporte de baixo vácuo com grades é fixado na haste e fechado dentro das pequenas câmaras de transferência coletadas para a câmara de preparação são bombeadas e o transporte é inserido em crio-estágio em alto vácuo estágio de câmara SEM é inclinado para quarenta e cinco graus e movido quatro milímetros na posição central da grade inserindo a agulha do sistema de injeção de gás cria camada protetora de orgânico em espécime biológico contra dano de radiação durante o foco As grades de fresagem de feixe de íons são então revestidas com véu fino de metal inorgânico para criar camada condutora na fresagem de feixe de íons de material biológico focada em lamella em aglomerado de células ou monocamada é feita em poucos passos estágio é movido para moagem região de ângulo de interesse é encontrado e padrões de fresagem superior e inferior são criados lamella áspero é moído com diminuição gradual da corrente FIB e espessura lamella o polimento final de lamella is Realizada apenas com padrão superior e baixa corrente FIB para evitar danos frontais e efeito de cortina no feixe de elétrons da superfície lamella mostra o progresso durante o processo de moagem aqui podemos ver a lamella polida final A espessura final da lamella precisa ser inferior a duzentos e cinquenta nanômetros para ser transparente para a transmissão do feixe de elétrons a ilustração de lamella moída em aglomerado de células e monocamada com prós e contras de ambos os tipos de amostras com lamali são muito suavemente transferidos através da câmara de preparação de volta para o pote de carga é resfriado e preenchido com nitrogênio líquido fresco e limpo para evitar a contaminação do gelo de grades lamali moídas são removidos do transporte e devolvidos de volta à caixa de grade espécime com lamali moído é finalmente transferido para transmissão de espectro crioscópio eletrônico tem que ser 90 graus girados antes de inserir para o carregador automático TEM para garantir a adequada orientação da lamella em relação ao acesso de inclinação TEM Lamili são rastreados e região de interesse para aquisição de dados tomográficos crio-elétron é localizado O eixo principal de Lamella é perpendicular ao eixo de inclinação do microscópio para ver o campo de visão em ângulos de alta inclinação método dosimétrico é usado para coletar dados de tomografia crio-elétron coletada tomograma é então processado em software Etomo e segmento monolay software Neste protocolo mostramos como preparar eficientemente uma amostra de células de levedura para uma micro máquina lamella usando a fresagem de feixe de íons focada em crio e como preparar e processar dados de tomografia eletrônica e lamali celular

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

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